Midkine(MDK)在肝細(xì)胞癌(HCC)中的表達(dá)及其臨床意義

朱文偉 張巨波 郭 磊 張 博 葉青海

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝癌研究所肝外科 上海 200032)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，預(yù)后很差，5年生存率不到5%，排在我國(guó)癌癥死因第2位［1］。HCC預(yù)后差的一個(gè)重要原因就是多數(shù)患者未能早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期治療。一旦出現(xiàn)癥狀，多數(shù)患者已進(jìn)入中晚期，往往失去根治性治療的機(jī)會(huì)，故療效很差。因此，尋找新的腫瘤標(biāo)記物以進(jìn)一步提高HCC患者的早期診斷率是進(jìn)一步改善其預(yù)后的關(guān)鍵。我們課題組前期通過(guò)基因芯片分析技術(shù)發(fā)現(xiàn)5個(gè)在HCC癌組織中高表達(dá)的基因(GPC3、PEG10、MDK、SERPINI1 和 QP-C)，并發(fā)現(xiàn)運(yùn)用這5個(gè)基因可以準(zhǔn)確區(qū)分肝癌組織及肝硬化的肝組織［2］。

其中，Midkine(MDK)為一種小分子分泌性蛋白，屬肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子家族成員，其相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)約為14 000［3］。MDK基因定位于人類染色體11p11．2，由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成。MDK是一種重要的多功能細(xì)胞因子，最初發(fā)現(xiàn)其在多種系統(tǒng)和組織、特別是神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)生和發(fā)育中起著重要作用。深入研究還發(fā)現(xiàn)MDK在多種腫瘤中表達(dá)顯著上調(diào)［4－8］。它可通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化、促進(jìn)腫瘤血管生成、促纖溶和細(xì)胞趨化、增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的耐藥性和抑制細(xì)胞凋亡等一系列作用［4］以調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、耐藥等不良生物學(xué)行為。但關(guān)于MDK在HCC患者組織以及血清中的表達(dá)未見(jiàn)深入報(bào)道。本文旨在以前期工作為基礎(chǔ)，進(jìn)一步探討MDK在HCC患者組織中的表達(dá)。同時(shí)，通過(guò)檢測(cè)肝癌患者血清 MDK水平，初步分析其作為HCC檢測(cè)指標(biāo)的臨床價(jià)值。

材料和方法

組織及血清樣本 收集2005年期間在我院肝外科行根治性手術(shù)的50例臨床樣本，其中HCC患者的腫瘤組織30例，其對(duì)照石蠟標(biāo)本20例。20例對(duì)照中，10例正常肝組織來(lái)源于血管瘤患者，10例無(wú)瘤肝硬化組織來(lái)源于門脈高壓患者行斷流手術(shù)時(shí)的活檢肝組織。此外，課題中所使用的總共120例血清樣本(包括60例肝癌、20例乙肝肝硬化、19例丙肝肝硬化及21例正常人血清標(biāo)本)分別來(lái)自2005年9月至2007年2月在復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝癌研究所經(jīng)外科手術(shù)切除后并經(jīng)病理學(xué)證實(shí)的肝癌患者及中山醫(yī)院消化科和上海市公共衛(wèi)生中心臨床診斷為肝硬化的患者。正常人血清標(biāo)本來(lái)源于中山醫(yī)院健康體檢中心體檢正常的血清標(biāo)本。病理診斷由2位病理學(xué)專家共同認(rèn)定，所有患者均簽署知情同意書(shū)。

細(xì)胞株及試劑 實(shí)驗(yàn)中所用的各種細(xì)胞系(LO2、Changliver、PLC、HepG2、Hep3B、MHCC97H、HCCLM3)由我院肝癌研究所構(gòu)建或保存。Trizol試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)，Takara逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(大連寶生物公司)，DMEM高糖培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco BRL公司)，MDK抗體(美國(guó)Lifespan Bioscience公司)，GAPDH、羊抗兔抗體(美國(guó) Cell Signaling Technology公司)，Envision二抗(丹麥DAKO公司)，MDK ELISA試劑盒(美國(guó)BioVendor公司)。

細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇的細(xì)胞采用DMEM高糖培養(yǎng)基(含10%FBS，青霉素200 IU/mL、鏈霉素200 IU/mL)于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。0．25%胰蛋白酶 +0．02乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA)消化細(xì)胞，1∶3 傳代，約3～4天傳代1次。

免疫組化染色 切片常規(guī)脫蠟至水，以3%的過(guò)氧化氫靜置10min，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，PBS液沖洗，經(jīng)抗原微波修復(fù)后以MDK抗體(稀釋濃度1∶250)孵育4℃過(guò)夜，之后以 Envision二抗37℃孵育30 min，DAB顯色液，蘇木精復(fù)染，封片。以PBS緩沖液代替一抗，其他步驟不變，結(jié)果作為陰性對(duì)照。

Western blot 樣品準(zhǔn)備:細(xì)胞長(zhǎng)至瓶底的80%～90%時(shí)，棄去培養(yǎng)液向培養(yǎng)瓶中加入相應(yīng)體積的蛋白裂解液裂解細(xì)胞，0℃放置15 min。用刮棒刮下細(xì)胞，收集到預(yù)冷的1．5 mL離心管中;在4℃下12 000 r/min離心20 min，將上清按需分裝，保存于－80℃;BCA法檢測(cè)蛋白濃度，100℃蛋白變性5 min。制備聚丙烯凝膠，室溫下60 V電泳至分離膠與濃縮膠分界線后，電壓轉(zhuǎn)至80 V繼續(xù)電泳約2 h。安裝轉(zhuǎn)膜裝置，冰浴轉(zhuǎn)膜:100 V/1～2 h。用5%脫脂奶粉室溫下封閉 1 h;加一抗(MDK、GAPDH)雜交，PBST洗膜3次，每次10 min;加二抗(山羊抗兔)雜交，PBST洗膜3次，每次10 min。顯影:混合ECL試劑(每張膜用試劑A與試劑B各1mL)。瀝干膜，迅速加上混合液，輕輕搖晃，反應(yīng)70 s，以保鮮紙包裹，貼入暗盒。Las3000曝光機(jī)器曝光，根據(jù)膜顯影情況，適度調(diào)節(jié)曝光時(shí)間。

酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)(ELISA) 血清MDK檢測(cè)嚴(yán)格按照MDK ELISA檢測(cè)試劑盒的產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。每個(gè)樣品做2個(gè)復(fù)孔，酶標(biāo)儀上讀出450 nm波長(zhǎng)時(shí)各孔的吸光度值(D)。酶標(biāo)儀根據(jù)平板設(shè)置、每孔吸光度值以及標(biāo)準(zhǔn)曲線自動(dòng)計(jì)算每孔的濃度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品精確計(jì)算出樣品濃度(ng/mL)。

數(shù)據(jù)處理 用SPSS 17．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。不同組間計(jì)量資料的比較用配對(duì)t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料分別計(jì)算例數(shù)和所占比例，構(gòu)成情況間的差別用χ2檢驗(yàn)或Fisher's確切概率法。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

MDK在肝癌組織、肝硬化組織及正常肝臟組織中染色表達(dá)情況 MDK主要表達(dá)于肝癌腫瘤組織中，呈彌漫性分布于細(xì)胞質(zhì);同時(shí)亦有少部分散在表達(dá)于肝硬化組織的膽管上皮細(xì)胞內(nèi)，而在正常肝細(xì)胞內(nèi)幾乎不表達(dá)(圖1)。MDK在各組織中的表達(dá)及統(tǒng)計(jì)情況見(jiàn)表1。MDK在肝癌組織中的表達(dá)顯著強(qiáng)于肝硬化組織及正常肝組織。在30例腫瘤組織標(biāo)本中，23例呈陽(yáng)性表達(dá)(陽(yáng)性率77%)，表達(dá)陽(yáng)性率顯著高于肝硬化組織(3/10，30%;P＜0．01)和正常肝組織(0/10，0%;P＜0．001)。

圖1 MDK在肝癌、肝硬化及正常肝組織中的表達(dá)Fig 1 Expression of MDK in HCC tissue，cirrhotic liver tissue and normal liver tissue

表1 MDK在肝癌、肝硬化及正常肝組織的表達(dá)差異Tab 1 MDK expression levels in HCC，cirrhotic liver and normal liver tissues

MDK在各種肝癌細(xì)胞系和正常肝細(xì)胞系中的表達(dá) 通過(guò)Western blot檢測(cè)各種細(xì)胞株中MDK的蛋白表達(dá)水平變化(圖2)，在兩株正常肝細(xì)胞系LO2和Chang liver中未能檢測(cè)到MDK蛋白表達(dá)，而在肝癌細(xì)胞系 PLC、HepG2、Hep3B、MHCC97H、HCCLM3中MDK蛋白普遍表達(dá)，尤其在MHCC97H細(xì)胞中表達(dá)最高。

圖2 MDK不同肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)Fig 2 MDK expression in different cell lines

血清MDK在HCC患者、肝硬化患者和正常人群中的表達(dá) 為了進(jìn)一步明確MDK能否作為HCC血清標(biāo)記物，我們采用ELISA法檢測(cè)60例HCC患者和60例對(duì)照人群的血清MDK表達(dá)情況。ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，除了2例正常人外，其余受試者血清中均能檢測(cè)到MDK。各組血清標(biāo)本的MDK水平檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。HCC患者血清中 MDK 的中位數(shù)水平(1．195 ng/mL，0．84～1．71)較正常人(0．102 ng/mL，0．02 ～0．53;P＜0．01)、HBV 相關(guān)肝硬化(0．57 ng/mL，0．26 ～0．67;P＜0．05)和 HCV 相關(guān)肝硬化(0．34 ng/mL，0．09 ～0．56;P＜0．01)患者顯著升高。我們進(jìn)一步通過(guò)ROC曲線評(píng)估MDK診斷HCC的敏感性和特異性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血清MDK的ROC曲線下面積(AUROC)高達(dá) 0．918，95%CI為 0．866～0．966(P＜0．001，圖 4)，提示血清檢測(cè)MDK可以區(qū)分肝癌患者和非肝癌患者。

圖3 肝癌、肝硬化和正常人中血清MDK表達(dá)水平Fig 3 Expression of serum MDK in patients with HCC and liver cirrhosis as well as health donors

圖4 血清MDK蛋白水平的ROC曲線Fig 4 ROC curve of serum MDK

血清 MDK在甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)陰性肝細(xì)胞癌和小肝癌患者中的表達(dá)情況如圖5所示，在60例肝癌患者中，AFP陰性(＜20 ng/mL)的肝癌患者血清MDK水平(1．597 ng/mL，1．01 ～2．08)同樣顯著高于正常人水平(0．102 ng/mL，0．02 ～0．53;P＜0．001)及肝硬化患者(P＜0．001)。另一方面，我們還進(jìn)一步分析了MDK在小肝癌患者(＜5 cm)患者中的表達(dá)情況。結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)，MDK在小肝癌患者中表達(dá)水平(1．168 ng/mL，0．802～1．899)亦顯著高于上述對(duì)照人群。以上結(jié)果提示，血清MDK在診斷AFP陰性肝癌和小肝癌中具備初步的臨床價(jià)值。

圖5 MDK在小肝癌和AFP陰性肝癌中的表達(dá)水平Fig 5 Expression of serum MDK in small HCCs and AFP negative HCCs

討 論

據(jù)統(tǒng)計(jì)，70%～90%的肝細(xì)胞癌患者常合并存在慢性肝病和肝硬化，其主要致病因素為HBV和HCV感染［9－10］。從20世紀(jì)70年代肝癌患者血清內(nèi)被檢測(cè)到特異性AFP升高以來(lái)，AFP作為肝癌診斷標(biāo)志被廣泛運(yùn)用。但是只有60%～70%的肝癌患者血清存在AFP升高(＞20 ng/mL)，小肝癌患者更是只有33% ～65%伴血清AFP升高。而且，15% ～58%的慢性肝炎患者和11%～47%的肝硬化患者(肝癌高危人群)均發(fā)現(xiàn)血清AFP的非特異性升高，而75% ～90%的肝癌發(fā)生在硬化的肝臟［11］。因此，尋找新的特異性及敏感性更高的肝癌標(biāo)志物，對(duì)肝癌尤其是AFP陰性肝癌的診斷具有重要意義。

我們課題組前期通過(guò)基因芯片分析技術(shù)對(duì)218例不同AFP水平的肝癌患者的癌組織及癌旁組織基因表達(dá)譜比較分析，得到5個(gè)在癌組織中高表達(dá)的基因(GPC3、PEG10、MDK、SERPINI1 和 QP-C)，同時(shí)運(yùn)用這5個(gè)基因可以準(zhǔn)確地將肝癌組織和肝硬化的肝組織區(qū)分開(kāi)［2］。且在AFP陰性肝癌和小肝癌患者中的診斷預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率分別達(dá)到82%和87．5%，其中尤以GPC3、PEG10和MDK所占的預(yù)測(cè)權(quán)重較大［2］。本研究中，我們?cè)谇捌谘芯康幕A(chǔ)上，選取其中的一個(gè)重要候選基因MDK進(jìn)一步觀察其蛋白水平在HCC腫瘤組織、肝硬化組織和正常肝組織中的表達(dá)情況。我們證實(shí)，MDK不僅在HCC組織中表達(dá)顯著上調(diào)，而且在各種肝癌細(xì)胞系中也普遍表達(dá)。

MDK是肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子的成員之一［3］，最初是在視黃酸誘導(dǎo)的胚胎腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)該基因的表達(dá)。與同為肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子家族成員類似，MDK具有包括促纖溶、抗凋亡、促有絲分裂、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、血管形成和化學(xué)趨化功能，參與多種腫瘤發(fā)生［4］。作為一種分泌性蛋白質(zhì)，MDK存在于多種腫瘤患者血清中［12－13］。Ikematsu 等［14］發(fā)現(xiàn)多種腫瘤患者血清中MDK水平升高，其中87%的患者超過(guò)0．5 ng/mL，顯著高于對(duì)照組的(0．154 ±0．076)ng/mL。提示血清MDK可作為檢測(cè)HCC的一種重要手段。和既往在胃癌的研究報(bào)道類似［15］，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在大部分正常人、所有肝硬化及HCC患者的血清中均可檢測(cè)到MDK蛋白，而HCC患者血清MDK較正常人、HBV相關(guān)肝硬化和HCV相關(guān)肝硬化患者顯著升高。ROC曲線評(píng)估MDK診斷HCC的敏感性和特異性發(fā)現(xiàn)，血清MDK的ROC曲線下面積(AUROC)高達(dá)0．918，95%CI為 0．866 ～0．966(P＜0．001)，血清檢測(cè)MDK可以區(qū)分肝癌患者和非肝癌患者。提示血清MDK是檢測(cè)HCC的潛在腫瘤標(biāo)記物。有趣的是，我們的初步結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，在AFP陰性(＜20 ng/mL)肝癌和小肝癌(＜5 cm)患者中，MDK的表達(dá)同樣明顯升高，不僅初步提示其在AFP陰性HCC患者中的診斷價(jià)值，而且提示將兩者聯(lián)合檢測(cè)有望進(jìn)一步提高HCC診斷的靈敏性。

綜上所述，本研究結(jié)果證實(shí)MDK在HCC中的表達(dá)及其在HCC發(fā)生中的重要作用，也為臨床治療肝癌提供了潛在的靶點(diǎn)。此外我們推測(cè)，血清檢測(cè)MDK可能成為診斷肝癌特別是AFP陰性肝癌的重要血清標(biāo)志物。因此進(jìn)一步擴(kuò)大肝細(xì)胞癌血清樣本驗(yàn)證其在HCC中的診斷價(jià)值十分必要。

［1］ Yang L，Parkin DM，F(xiàn)erlay J，et al．Estimates of cancer incidence in China for 2000 and projections for 2005［J］．Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2005，14(1):243 －250．

［2］ Jia HL，Ye QH，Qin LX，et al．Gene expression profiling reveals potential biomarkers of human hepatocellular carcinoma［J］．Clin Cancer Res，2007，13(4):1133 － 1139．

［3］ Muramatsu T．Midkine(MK)，the product of a retinoic acid responsive gene，and pleiotrophin constitute a new protein family regulating growth and differentiation［J］．Int J Dev Biol，1993，37(1):183 －188．

［4］ Kadomatsu K，Muramatsu T．Midkine and pleiotrophin in neural development and cancer［J］．Cancer Lett，2004，204(2):127－143．

［5］ Rha SY，Noh SH，Kwak HJ，et al．Comparison of biological phenotypes according to midkine expression in gastric cancer cells and their autocrine activities could be modulated by pentosan polysulfate［J］．Cancer Lett，1997，118(1):37－46．

［6］ Garver RJ，Radford DM，Donis-Keller H，et al．Midkine and pleiotrophin expression in normal and malignant breast tissue［J］．Cancer，1994，74(5):1584 －1590．

［7］ O'Brien T，Cranston D，F(xiàn)uggle S，et al．The angiogenic factor midkine is expressed in bladder cancer，and overexpression correlates with a poor outcome in patients with invasive cancers［J］．Cancer Res，1996，56(11):2515 －2518．

［8］ Sakitani H，Tsutsumi M，Kadomatsu K，et al．Overexpression of midkine in lung tumors induced by N-nitrosobis(2-hydroxypropyl)amine in rats and its increase with progression［J］．Carcinogenesis，1999，20(3):465 －469．

［9］ El-Serag HB，Rudolph KL．Hepatocellular carcinoma:epidemiology and molecular carcinogenesis ［ J］．Gastroenterology，2007，132(7):2557 －2576．

［10］ Poon D，Anderson BO，Chen LT，et al．Management of hepatocellular carcinoma in Asia:consensus statement from the Asian Oncology Summit 2009［J］．Lancet Oncol，2009，10(11):1111－1118．

［11］ Taketa K．Alpha-fetoprotein:reevaluation in hepatology［J］．Hepatology，1990，12(6):1420 －1432．

［12］ Obata Y，KikuchiS，Lin Y，etal．Serum midkine concentrations and gastric cancer［J］．Cancer Sci，2005，96(1):54－56．

［13］ Shimada H，Nabeya Y，Tagawa M，et al．Preoperative serum midkine concentration is a prognostic marker for esophageal squamous cell carcinoma［J］．Cancer Sci，2003，94(7):628－632．

［14］ Ikematsu S，Yano A，Aridome K，et al．Serum midkine levels are increased in patients with various types of carcinomas［J］．Br J Cancer，2000，83(6):701 －706．

［15］ Xu Y，Qu X，Zhang X，et al．Midkine positively regulates the proliferation of human gastric cancer cells［J］．Cancer Lett，2009，279(2):137 －144．