去整合素金屬蛋白酶10(ADAM10)在喉癌組織中的表達(dá)和臨床意義

龐宇峰 周 梁 龔洪立 田 潔 龔靜蓉

(1復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院耳鼻咽喉科 上海 200031;2復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院耳鼻咽喉科 上海 200240)

喉癌是常見的頭頸部惡性腫瘤，隨著工業(yè)化的進(jìn)程與環(huán)境的污染，近40年來喉癌的發(fā)病率有逐漸增多的趨勢(shì)，但其病因與致病機(jī)制仍有待進(jìn)一步探索，深入研究喉癌的發(fā)生發(fā)展與轉(zhuǎn)移等機(jī)制對(duì)患者的診斷治療及預(yù)后有著重要意義［1］。去整合素金屬蛋白酶家族(a disintegrin and metalloprotease 10，ADAMs)是一種近年來新發(fā)現(xiàn)的Ⅰ型跨膜蛋白家族，因其包含的兩個(gè)主要結(jié)構(gòu)基質(zhì)金屬蛋白酶區(qū)域與去整合素區(qū)域而得名。對(duì)ADAMs的逐步研究揭示這些分子廣泛參與了人體中諸如細(xì)胞黏附、融合、轉(zhuǎn)移，膜蛋白脫落和蛋白水解等生物學(xué)事件。研究還發(fā)現(xiàn)ADAMs在許多惡性腫瘤中有所表達(dá)，并參與了癌癥發(fā)生發(fā)展與轉(zhuǎn)移的病理過程［2］，其中ADAM10被發(fā)現(xiàn)在口腔鱗癌等腫瘤中有高表達(dá)［3］，但在喉癌中的表達(dá)國(guó)內(nèi)外尚無相關(guān)研究報(bào)道。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR與組織芯片免疫組化的方法，研究ADAM10在喉癌中的表達(dá)及其與喉癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性。

材料和方法

標(biāo)本收集 收集復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院頭頸外科2011年1月至2011年4月的喉癌全喉切除術(shù)或部分喉切除術(shù)標(biāo)本共21例。每例標(biāo)本均取腫瘤組織及腫瘤周圍5cm以上的喉部正常黏膜組織，所有標(biāo)本離體后均在10 min內(nèi)置于液氮內(nèi)保存待提取RNA。組織芯片所用標(biāo)本收集于復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院頭頸外科2010年2月至2011年4月的喉癌全喉切除術(shù)或部分喉切除術(shù)標(biāo)本共62例。每例標(biāo)本均取腫瘤組織及腫瘤周圍5 cm以上的喉部正常黏膜組織，標(biāo)本經(jīng)10%甲醛溶液固定，石蠟包埋待制組織芯片。

主要試劑及儀器 RNA提取試劑Trizol(美國(guó)Invitrogen公司);PrimeScript RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，實(shí)時(shí)定量PCR試劑SYBR Premix Ex Taq(日本TaKaRa公司);兔抗人ADAM10多克隆抗體(美國(guó)Abcam公司)。TMA600型博南組織芯片微陣列點(diǎn)樣儀(上海博南生物技術(shù)有限公司)。

實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 引物的設(shè)計(jì)與合成:在GenBank中查詢并結(jié)合Primer Premier 6．0軟件設(shè)計(jì)ADAM10和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH，作為內(nèi)參)的引物，合成引物序列。ADAM10的擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為 166 bp，其上游引物 5'-GCTGATGAGAAG-GACCCTACAA-3'，下游引物 5'-ATGCTCCAACCC-AAGCCAGAC-3'。總 RNA的提取:取組織塊50 mg用液氮在研缽中研磨成粉末，然后移入玻璃勻漿管中加入1mL Trizol抽打勻漿。然后按說明書步驟提取細(xì)胞內(nèi)總RNA。用紫外分光光度儀測(cè)定RNA樣品濃度(D260/D280為1．8～2．0)。按照實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的兩步法步驟分別進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增。PCR的反應(yīng)條件為:95℃變性1 min，然后 95℃ 10 s，58℃ 20 s，72℃ 20 s，進(jìn)行 45個(gè)循環(huán)擴(kuò)增。所有反應(yīng)均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，以GAPDH為內(nèi)參照，記錄每個(gè)反應(yīng)管中熒光信號(hào)所達(dá)設(shè)定閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)即Ct值。采用2－ΔΔCt相對(duì)定量法，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算腫瘤組織及配對(duì)正常組織中ADAM10的相對(duì)表達(dá)量，ΔCt=Ct(ADAM10)－Ct(GAPDH)，ΔΔCt=ΔCt(腫瘤組織)－ΔCt(正常組織)。其中2－ΔΔCt表示腫瘤組織中 ADAM10的表達(dá)量相對(duì)于癌旁正常黏膜組織中ADAM10表達(dá)量的倍數(shù)。

組織芯片法 制片:(1)將62例10%甲醛溶液固定的標(biāo)本石蠟包埋，顯微鏡下確定目標(biāo)區(qū)并定位。(2)用陣列儀在標(biāo)本蠟塊上打孔，鉆取標(biāo)本組織柱，每個(gè)組織柱直徑1．5 mm，按順序移到受體蠟塊上，精確排成微孔陣列。然后將制備好的微陣列蠟塊放入溫箱，調(diào)定溫箱溫度，在半融狀態(tài)下取出。隨即冷卻并放入4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?3)最后對(duì)組織芯片蠟塊連續(xù)切片。切片厚度2 μm，共切片100張。染色:一抗兔抗人 ADAM10多克隆抗體稀釋濃度1∶250。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。結(jié)果判定:對(duì)染色的芯片分別進(jìn)行照相。用計(jì)算機(jī)軟件分析組織芯片的每張圖片中的陽(yáng)性面積(area)和陽(yáng)性面積百分比(area%)以進(jìn)行定量比較。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均采用Stata 9軟件處理，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。其中數(shù)值采用表示，表達(dá)結(jié)果采用配對(duì)t檢驗(yàn)，臨床參數(shù)分析采用單因素方差分析。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

ADAM10 mRNA的表達(dá) 通過實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 方法檢測(cè)，經(jīng) 2－ΔΔCt相對(duì)定量法分析，其中腫瘤組織中與正常黏膜組織中ADAM10的－ΔΔCt值見表1，由此測(cè)定ADAM10 mRNA在21例喉癌腫瘤組織與正常黏膜組織中表達(dá)的倍數(shù)(表1、圖1)。其相應(yīng)的倍數(shù)為2．691 ±1．568，95%CI為1．978 ～3．405。對(duì)其倍數(shù)進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，然后進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5．633，P＜0．001)。說明喉癌組織中ADAM10的表達(dá)量高于正常黏膜組織。

圖1 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)ADAM10在腫瘤組織/對(duì)照正常組織中表達(dá)的倍數(shù)Fig1 The times of ADAM10 expressed in tumor tissues and control tissues detected by real time RT-PCR

表1 2－ΔΔCt方法計(jì)算 ADAM10(腫瘤/癌旁)相對(duì)表達(dá)量Tab 1 The times of ADAM10 expressed in tumor tissues and control tissues calculated by 2 －ΔΔCtmethod

實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)喉癌組織中ADAM10 mRNA的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 ADAM10在喉癌組織中的表達(dá)在不同的病理組織學(xué)分級(jí)中有差異(P＜0．01)。本次21組病例中有5例Ⅰ級(jí)(高分化)，16例Ⅱ級(jí)(中分化)，沒有Ⅲ級(jí)(低分化)病例。喉癌腫瘤組織與正常黏膜組織中ADAM10表達(dá)的倍數(shù)Ⅰ級(jí)明顯低于Ⅱ級(jí)，其中位表達(dá)值分別為Ⅰ級(jí)1．401、Ⅱ級(jí)2．826。此外，ADAM10 在喉癌組織中的表達(dá)在不同TNM分組、臨床分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否等各組中均無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表2、圖2)。

表2 ADAM10表達(dá)與喉癌臨床病理指標(biāo)的關(guān)系Tab 2 Relationship between the expression of ADAM10 in laryngeal cancer and clinical or pathology parameters

組織芯片結(jié)果

圖2 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)ADAM10在腫瘤組織中與正常黏膜組織中表達(dá)倍數(shù)的臨床分類比較Fig 2 The times of ADAM10 expressed in tumor tissues and control tissues detected by real time RT-PCR，and showed by/as the clinical stage and the pathology grades

ADAM10蛋白的表達(dá) ADAM10為跨膜蛋白，在人喉癌組織中主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞，陽(yáng)性著色于細(xì)胞膜與胞質(zhì)中，組織芯片照片見圖3。染色后對(duì)每對(duì)腫瘤組織與正常黏膜組織中陽(yáng)性細(xì)胞面積百分比(area%)進(jìn)行定量比較，比較其area%差值。經(jīng)Stata軟件計(jì)算，ADAM10在喉癌組織中area%為15．243 ±7．824，ADAM10 在正常黏膜組織中area% 為 1．887 ±1．918，兩者差值為 13．356 ±8．430，95%CI為 11．215 ～ 15．497。進(jìn)行配對(duì) t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12．474，P＜0．001)。說明組織芯片檢測(cè)喉癌組織中ADAM10的表達(dá)量高于正常黏膜組織(圖3、4)。

圖3 ADAM10蛋白在喉癌組織中(A、C、E、G)與正常黏膜組織中(B、D、F、H)的表達(dá) (×200)Fig 3 The photos of ADAM10 expressed in tumor tissues(A，C，E，G)and control tissues(B，D，F(xiàn)，H)(×200)

組織芯片檢測(cè)喉癌組織中ADAM10蛋白的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 與實(shí)時(shí)熒光定量 RTPCR結(jié)果類似，ADAM10蛋白在喉癌組織中的表達(dá)在不同的病理組織學(xué)分級(jí)中有差異(P＜0．01)。本次62組病例中有10例Ⅰ級(jí)(高分化)，52例Ⅱ級(jí)(中分化)，沒有Ⅲ級(jí)(低分化)病例。喉癌腫瘤組織與正常黏膜組織中ADAM10表達(dá)的area%差值Ⅰ級(jí)明顯低于Ⅱ級(jí)，其中位表達(dá)值分別為Ⅰ級(jí)5．885、Ⅱ級(jí) 14．265。此外，ADAM10 在喉癌組織中的表達(dá)在不同TNM分組、臨床分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否等各組中均無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表2、圖5)。

圖4 組織芯片檢測(cè)腫瘤組織與正常黏膜組織中ADAM10的表達(dá)Fig 4 The difference of ADAM10 expressed in tumor tissues and control tissues detected by tissue chip

圖5 組織芯片檢測(cè)ADAM10在腫瘤組織與正常黏膜組織中表達(dá)差值比較的臨床分析Fig 5 The difference of ADAM10 expressed in tumor tissues and control tissues detected by tissue chip，and showed by Clinical stages and pathology grades

討 論

1989年科學(xué)家在牛髓鞘堿性蛋白水解酶研究中發(fā)現(xiàn)了ADAM10，因發(fā)現(xiàn)其具有與ADAMs家族相似的結(jié)構(gòu)與功能，故命名之［2］。目前將ADAM家族成員分為兩組:跨膜型ADAM和分泌型ADAMTS(帶凝血酶敏感蛋白模體的ADAM)。ADAM家族成員多含有共同的前肽段，由金屬蛋白酶區(qū)域、去整合素區(qū)域、表皮生長(zhǎng)因子樣區(qū)域、跨膜區(qū)和細(xì)胞質(zhì)區(qū)域組成［4］。近年，ADAMs家族引起了科學(xué)家的廣泛關(guān)注，它們的功能不斷得到研究。ADAMs是一種有多個(gè)功能區(qū)域的蛋白，不同的功能區(qū)域各司其職。它不僅參與其他膜蛋白的蛋白水解過程，同時(shí)也參與了細(xì)胞黏附與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)。ADAMs的金屬蛋白酶區(qū)域的功能如同一把“剪刀”，能特異性地剪切許多膜蛋白酶底物。諸如許多生長(zhǎng)因子如表皮生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α、肝素結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子以及細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子α等，所有這些蛋白在合成時(shí)需要從相應(yīng)的前體一步步水解才能轉(zhuǎn)化為不同的生物功能結(jié)構(gòu)。許多研究顯示ADAMs廣泛參與這些蛋白的水解，同時(shí)包括許多受體(如腫瘤壞死因子 α受體Ⅰ、Ⅱ，CD44，L-選擇素和 Erb4/HER4等)在細(xì)胞膜表面的胞外脫落也有賴于ADAMs的剪切作用。通過這一過程，ADAMs廣泛參與細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)，從而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展［2］。ADAMs的另一個(gè)功能是作為整合素的配體與基質(zhì)蛋白競(jìng)爭(zhēng)。另外，ADAMs的富半胱氨酸域可以通過形成如多配體聚糖和纖維連接蛋白而達(dá)到細(xì)胞黏附功能［5］。

許多研究已經(jīng)證明ADAMs參與了腫瘤的發(fā)生與增值，而ADAM10也被發(fā)現(xiàn)在許多腫瘤細(xì)胞和腫瘤組織中有高表達(dá)［2］。近年的研究證實(shí)ADAM10的過表達(dá)能促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌和胃癌的生長(zhǎng)，同樣發(fā)現(xiàn)通過干擾ADAM10使之表達(dá)下調(diào)可使腫瘤細(xì)胞減緩增殖，所以ADAM10被認(rèn)為是腫瘤治療的新的潛在靶點(diǎn)［2－3］。本研究通過實(shí)時(shí)熒光定量RTPCR與組織芯片的方法，分別從基因與蛋白的層面檢測(cè)了ADAM10在喉癌中的表達(dá)情況。研究表明喉癌組織中ADAM10 mRNA與ADAM10蛋白較正常黏膜組織的表達(dá)量均有上升(P＜0．001)，提示ADAM10參與了喉癌的病理進(jìn)展。這與ADAM10在胃癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、結(jié)腸癌、前列腺癌等不同組織中的表達(dá)狀況基本相同［6－9］。通過臨床參數(shù)的分析發(fā)現(xiàn)，RT-PCR與組織芯片方法均提示ADAM10的表達(dá)與喉癌組織學(xué)分級(jí)明顯相關(guān)(P＜0．01)。雖然本次研究未有組織學(xué)分級(jí)Ⅲ級(jí)的病例，影響了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的完整性，但仍能提示ADAM10的表達(dá)與腫瘤的分化程度相關(guān)，其表達(dá)隨腫瘤的惡性程度增加而上調(diào)。這也同Ko等［3］在口腔鱗癌中檢測(cè)ADAM10的表達(dá)結(jié)果一致。另?yè)?jù)文獻(xiàn)報(bào)道ADAM10可通過釋放激活L1細(xì)胞黏附分子(L1-CAM)來加強(qiáng)卵巢和子宮腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。L1-CAM是一種神經(jīng)細(xì)胞黏附分子，在許多腫瘤細(xì)胞中也有表達(dá)，它可參與黑色素瘤、肺癌等腫瘤的轉(zhuǎn)移與侵襲，而ADAM10被視作是這些細(xì)胞系主要的L1脫落酶，從而促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移［10－11］。本次研究中實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR與組織芯片方法均提示ADAM10的表達(dá)與TNM分期、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤臨床分型無明顯相關(guān)。這一結(jié)果與文獻(xiàn)不盡相同，所以關(guān)于ADAM10同腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系還有待深入研究。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示ADAM10在喉癌組織中有高表達(dá)，但本研究只是ADAM10與喉癌關(guān)系的初步探究，并未涉及其參與癌癥發(fā)展的具體機(jī)制探索，有待于進(jìn)一步研究明確。

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