循環(huán)MicroRNA:急性心肌梗死的新型標(biāo)志物

閆 琦， 王文強(qiáng)， 侯 敢， 黃迪南

(廣東醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，廣東湛江524023)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是由于冠狀動脈粥樣斑塊破裂，冠狀動脈急性閉塞導(dǎo)致血流中斷，心肌嚴(yán)重持久缺血、缺氧而致壞死。世界衛(wèi)生組織預(yù)測到2020年冠心病將成為人類的第一大殺手?？焖?、準(zhǔn)確地診斷急性心肌梗死并予以及時、有效的治療對預(yù)后至關(guān)重要。心肌梗死標(biāo)志物在AMI診斷中扮演著重要角色，檢測方便、快速、準(zhǔn)確率高有著其他檢測手段不可替代的優(yōu)勢。

一、目前臨床應(yīng)用的AMI標(biāo)志物

心肌肌鈣蛋白(cTn，包括cTnI、cTnT)是主要在心臟表達(dá)的結(jié)構(gòu)蛋白，目前臨床用其與心電圖和肌酸激酶同工酶(CK-MB)相結(jié)合來確診AMI。研究顯示 cTn是目前最好的心肌梗死標(biāo)志物［1-2］，在胸痛發(fā)生的4～12 h即可以在血清中檢測到，并且和心肌梗死面積直接相關(guān)。但是cTn在心肌損傷后緩慢的釋放入血液，在AMI發(fā)病的前幾個小時仍不夠敏感，并且需要每6 h檢測1次。因此，還需要更早、更高敏感性和特異性的標(biāo)志物。最近研究顯示高靈敏度肌鈣蛋白檢測方法(hs-cTn)可以早期區(qū)分AMI和其他非冠狀動脈心臟病，并具有杰出的精確度［3］，是未來AMI標(biāo)志物的發(fā)展方向之一。

二、microRNA(簡稱miRNA)概述

近年來，miRNA作為新型腫瘤標(biāo)志物得到了廣泛關(guān)注［4］。研究發(fā)現(xiàn)一些心臟特異的miRNAs在AMI發(fā)生后出現(xiàn)在外周血中，也有可能成為新一代的心肌梗死標(biāo)志物。miRNAs是真核生物細(xì)胞中的一類不編碼蛋白的小分子RNA，平均長約22個核苷酸，具有高度的保守性、時序性和組織特異性。2012年8月1日，miRBase升級至19.0版(http://www.mirbase.org/)，人類 miRNAs共2 042種，其中大部分在細(xì)胞生長和凋亡、血細(xì)胞分化、同源異形盒基因調(diào)節(jié)、神經(jīng)元的極性、胰島素分泌、大腦形態(tài)形成、心臟發(fā)生、胚胎后期發(fā)育等過程中發(fā)揮重要作用。心臟中存在200多種miRNA，心肌中最豐富的有miR-1、let-7、miR-133、miR-126-3p、miR-30c 和miR-26a，動脈平滑肌細(xì)胞中有miR-145、let-7、miR-125a、miR-125b、miR-23和miR-143。在維持心臟正常功能中也發(fā)揮了重要作用，其表達(dá)失控和心臟疾病直接相關(guān)。

近年研究發(fā)現(xiàn)在人體多種體液中也存在著miRNA［5］。血液中有大量的RNA酶，但miRNAs在血漿或血清中卻非常穩(wěn)定地存在，他們被有效保護(hù)以避免接觸RNase，在嚴(yán)酷環(huán)境的條件下仍能保持穩(wěn)定。Valadi等［6］報道外切酶體中含有miRNA，血清中的miRNAs是受到外切酶體的保護(hù)才免于被消化。然而，關(guān)于miRNA是怎樣被外切酶體包裹及哪些因素引起釋放，這些過程中miRNA的功能是否發(fā)生變化等問題，還沒有合理的解釋。Mitchell等［7］將血漿放置在室溫中24 h或經(jīng)過8次反復(fù)凍融對miRNAs的量進(jìn)行測試，發(fā)現(xiàn)影響很小，沒有明顯差異。Chen等［8］發(fā)現(xiàn)A549細(xì)胞提取物中的大分子RNA，如28S rRNA、GAPDH、18S rRNA、β-actin和U6，能被核糖核酸酶輕易降解，而miRNA能一定程度對抗核糖核酸酶，并且在血清中加入核糖核酸酶也不會造成miRNA的降解。由此證明了血清中miRNA不但可以抵抗酶的消化，而且耐酸耐堿，更不受溫度變化及放置時間的影響，比蛋白更適宜作為標(biāo)志物。

三、miRNA與AMI的早期診斷

van Rooij等［9］用定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和miRNA芯片檢測大鼠心肌梗死模型梗死心肌邊緣區(qū)和遠(yuǎn)離區(qū)的miRNAs表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在心肌梗死后3 d，邊緣區(qū)有40個miRNAs發(fā)生明顯變化(以2倍為界)，其中17個上調(diào)、23個下調(diào)，遠(yuǎn)離區(qū)有22個miRNAs發(fā)生明顯變化，其中12個上調(diào)、10個下調(diào)。在心肌梗死后14 d，邊緣區(qū)有69個miRNAs上調(diào)。Alessandra等［10］在結(jié)扎小鼠冠狀動脈6 h后，發(fā)現(xiàn)miR-1和miR-133在結(jié)扎部位及其邊緣濃度下降，而在外周血液中升高，預(yù)示著這些miRNAs釋放到了血液中。人類心肌梗死發(fā)生后外周血miRNAs水平也發(fā)生變化。AMI患者血液中相關(guān)的miRNAs的變化以及CKMB和cTnI的表達(dá)量見表1。

表1 AMI患者血液中miRNAs與其對比標(biāo)志物的變化

miRNA和傳統(tǒng)蛋白質(zhì)標(biāo)志物相比具有以下優(yōu)勢:結(jié)構(gòu)簡單、具有低復(fù)雜性、組織細(xì)胞特異性、無后加工修飾、檢測方便等。與現(xiàn)有標(biāo)志物相比，出現(xiàn)更早，準(zhǔn)確率更高。Wang等［13］的研究顯示，在出現(xiàn)癥狀4 h的AMI患者血漿中miR-208的檢出率為100%，而 cTnI的檢出率只有85%。Devaux等［14］比較了510例AMI患者和87名健康人的血清hs-cTnT和miRNA，發(fā)現(xiàn)AMI患者血漿miRNA-208b和miR-499極度升高，而在健康人血清中幾乎檢測不到，與hs-cTnT相比，miR-499更能提高AMI診斷的準(zhǔn)確率。

1.miR-1 miR-1主要在心肌和骨骼肌中表達(dá)，分為miR1-1和miR1-2。miR-1參與心臟發(fā)育和肌肉分化。Cheng等［12］在體外通過TritohX-100誘導(dǎo)一個心肌壞死模型，發(fā)現(xiàn)壞死心肌中的miR-1能夠釋放到培養(yǎng)基中，并且在24 h內(nèi)很穩(wěn)定。繼發(fā)現(xiàn)miR-1水平在心肌缺血小鼠模型中異常表達(dá)后，Ai等［15］用實(shí)時定量RT-PCR對93例AMI患者和66名健康人的血漿miR-1水平進(jìn)行比較，結(jié)果顯示AMI患者血漿miR-1水平明顯升高，并且在2周后恢復(fù)正常。Long等［11］用實(shí)時逆轉(zhuǎn)錄(RT)-PCR來檢測AMI患者血漿循環(huán)miR-1和miR-126水平，同時用ELISA測定血漿cTnI。結(jié)果表明miR-1、miR-126和cTnI的表達(dá)水平表現(xiàn)出相同的趨勢，預(yù)示著miRNAs有可能為新一代的AMI標(biāo)志物。

2.miR-208 肌球蛋白基因還編碼miR-208a和miR-208b，Ji等［16］用基因芯片來檢測小鼠組織特異的miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-208只在心臟中大量表達(dá)，具有高度特異性，是最適合作為AMI標(biāo)志物的miRNA。在小鼠AMI模型中，冠狀動脈結(jié)扎后1 h血漿miR-208開始增加，3 h達(dá)到基線的1 000倍以上，并在24 h回到基礎(chǔ)水平［13］。miR-208在健康人外周血中檢測不到。Wang等［13］報道m(xù)iR-1、miR-133a、miR-499 和miR-208a在AMI發(fā)生后升高，其中miR-208a表現(xiàn)出了最高的敏感性和特異性。通過對444例AMI患者血漿中miR-1、miR-133a、miR-133b、miR-208a、miR-208b 和miR-499濃度的測定，并用單變量分析和性別-年齡調(diào)整分析，發(fā)現(xiàn)miR-208水平與AMI死亡率有明顯關(guān)系［17］。

3.miR-133 miR-133在平滑肌、骨骼肌和心肌中表達(dá)，包括miR-133-a和miR-133-b。miR-133是血管平滑肌表型開關(guān)的一個重要調(diào)節(jié)器，在動脈粥樣硬化進(jìn)展中起了一定作用。在小鼠模型中，miR-133在心肌梗死發(fā)生后1 h開始在外周血中出現(xiàn)，3 h達(dá)到峰值，比基線高出了1 000倍［13］。同樣的結(jié)果也出現(xiàn)在人類，Wang 等［18］對51例AMI患者和28名健康人血漿的miRNA水平進(jìn)行分析，結(jié)果表明AMI患者血漿中的miR-133是健康對照組的4.4倍。雖然miR-133在骨骼肌中表達(dá)豐富，但是急性肢體缺血不會導(dǎo)致外周血miR-133水平的升高，表明損傷后外周血miRNA升高具有組織特異性［19］。

4.miR-499 miR-499在肌肉中特異表達(dá)，在肌球蛋白基因調(diào)控中起重要作用。雖然miR-499在心肌中表達(dá)豐富，但是在缺血心肌中濃度下降，說明其已從壞死組織中釋放到外周血中。在大鼠和小鼠心肌梗死模型中外周血miR-499水平顯著升高。Adachi等［20］對 AMI、不穩(wěn)定性心絞痛、充血性心力衰竭患者和無心臟疾病對照組的血漿miR-499水平進(jìn)行了評估，結(jié)果顯示miR-499在所有AMI患者血漿中都升高。此外，Corsten等［21］比較了有不同程度心臟損害的患者血漿中心臟相關(guān)的miRNAs(miR-1、miR-133a、miR-208b和miR-499)，發(fā)現(xiàn)AMI患者血漿中miR-208b和miR-499與對照組相比有顯著升高。關(guān)于AMI患者循環(huán)miRNAs的研究總結(jié)見表2。

表2 AMI患者循環(huán)miRNAs的研究總結(jié)

四、循環(huán)microRNA的檢測方法

目前循環(huán)miRNA檢測方法主要有:miRNA芯片、Northern blot、原位雜交技術(shù)、熒光實(shí)時定量RTPCR(qRT-PCR)和高通量測序(Illumina/Solexa)。大致可分為兩類:一類是單樣本檢測方法，如Northern blot、原位雜交技術(shù)、qRT-PCR。另一類是高通量的檢測方法，如高通量測序技術(shù)、微陣列芯片技術(shù)等能夠同時測定多個樣本，相對于單樣本檢測方法，其能快速大規(guī)模地檢測多個microRNA的表達(dá)情況，但此方法所需樣本量大，且準(zhǔn)確性低，不利于精確定量miRNA。循環(huán)miRNA表達(dá)與定量檢測最常用的方法是qRT-PCR，此方法特異性和靈敏度高，并且操作相對簡單。大量實(shí)驗研究均用此方法進(jìn)行miRNA的定量檢測。qRT-PCR主要是基于莖-環(huán)的RT-PCR方法(stem-loop RT-PCR)和基于polyA加尾的RT-PCR方法。這2種方法均可以采用Taqman探針或者SYBR熒光染料，前者特異性更高，后者通用性好。Chen等［8］不經(jīng)過總RNA的提取，直接使用10μL血清進(jìn)行qRT-PCR分析的結(jié)果，與血清提取總RNA后進(jìn)行qRT-PCR分析的結(jié)果一致。這種方法如果能進(jìn)一步優(yōu)化將會減少miRNA檢測的步驟及成本。也有研究通過miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增定量［23］?；蛐酒梢酝瑫r檢測數(shù)百個miRNA。在玻璃載體上固定一系列核苷酸捕獲探針，然后從樣本中抽提總RNA與捕獲探針進(jìn)行雜交?？赏ㄟ^使用錨定核酸的方法(LNAs)來對探針的退火溫度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，適用于臨床大規(guī)模初步篩查。新一代測序技術(shù)在無需任何序列信息的前提下即可進(jìn)行miRNA表達(dá)譜研究，并在此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)和鑒定新的miRNA分子，但是此方法價格偏高。最近，Lusi等［19］發(fā)現(xiàn)用電化學(xué)基因傳感器能夠更加簡便快速地檢測循環(huán)體液中的miRNAs，而且敏感度可達(dá)0.1 pmol/L。miRNA檢測方法的發(fā)展進(jìn)一步為miRNAs成為生物標(biāo)志物提供了可能。

五、展望

心肌特異的miRNAs:miR-1、miR-133、miR-208和miR-499作為AMI標(biāo)志物具有在外周血中出現(xiàn)早且穩(wěn)定、準(zhǔn)確率高、結(jié)構(gòu)簡單等優(yōu)勢。miRNAs和hs-cTn聯(lián)合應(yīng)用于AMI的早期，也許可以提高檢出率和準(zhǔn)確率。血清miRNAs也許可以列入60歲以上患者入院常規(guī)檢查項目，以篩查不典型AMI，降低死亡率。Matsumoto等［24］的調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs還可以評估預(yù)后，AMI康復(fù)的患者血清中miR-155和miR-380水平的升高可以預(yù)測1年內(nèi)的心臟性死亡。miRNAs在臨床上的推廣應(yīng)用之前，還有許多問題需要解決:目前的實(shí)驗所用標(biāo)本量較小，需要進(jìn)一步大規(guī)模實(shí)驗證實(shí)從AMI發(fā)病到miRNAs在外周血中可檢測到的最短時間、在外周血中的參考區(qū)間、4組標(biāo)志物在外周血中出現(xiàn)的順序及聯(lián)合檢測的最佳方案等。Widera等［17］的研究發(fā)現(xiàn)不穩(wěn)定性心絞痛和心肌梗死患者血漿中的miRNAs有大量重疊，如何區(qū)分心絞痛和心肌梗死需進(jìn)一步實(shí)驗解決。miRNAs新的快速檢測技術(shù)的開發(fā)也非常重要。qRT-PCR雖然有著卓越的敏感性和特異性，但是仍需要2～3 h的檢測時間，不利于早期快速確診和計算梗死面積。另外，目前仍缺乏一套標(biāo)準(zhǔn)化程序，難以保障結(jié)果的穩(wěn)定性。隨著研究的深入，miRNAs作為AMI早期診斷標(biāo)志物值得期待。

［1］Reichlin T，Hochholzer W，Bassetti S，etal.Early diagnosis of myocardial infarction with sensitive cardiac troponin assays［J］.N Engl JMed，2009，361(9):858-867.

［2］Keller T，Zeller T，Peetz D，etal.Sensitive troponin I assay in early diagnosis of acute myocardial infarction［J］.N Engl J Med，2009，361(9):868-877.

［3］Haaf P，Drexler B，Reichlin T，etal.High-sensitivity cardiac troponin in the distinction of acute myocardial infarction from acute cardiac noncoronary artery disease［J］.Circulation，2012，126(1):31-40.

［4］楊中玫，沈 茜.游離microRNA在腫瘤診斷中的臨床應(yīng)用價值［J］.檢驗醫(yī)學(xué)，2010，25(5):407-410.

［5］Weber JA，Baxter DH，Zhang S，etal.The microRNA spectrum in 12 body fluids［J］.Clin Chem，2010，56(11):1733-1741.

［6］Valadi H，Ekstr?m K，Bossios A，etal.Exosomemediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells［J］.Nat Cell Biol，2007，9(6):654-659.

［7］Mitchell PS，Parkin RK，Kroh EM，etal.Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105(30):10513-10518.

［8］Chen X，Ba Y，Ma L，etal.Characterization of microRNAs in serum:a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases［J］.Cell Res，2008，18(10):997-1006.

［9］Van Rooij E，Sutherland LB，Thatcher JE，etal.Dysregulation of microRNAs after myocardial infarction reveals a role of miR-29 in cardiac fibrosis［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105(35):13027-13032.

［10］D'Alessandra Y，Devanna P，Limana F，etal.Circulating microRNAs are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction［J］.Eur Heart J，2010，31(22):2765-2773.

［11］Long G，Wang F，Duan Q，etal.Human circulating microRNA-1 and microRNA-126 as potential novel indicators for acute myocardial infarction［J］.Int J Biol Sci，2012，8(6):811-818.

［12］Cheng Y，Tan N，Yang J，etal.A translational study of circulating cell-free microRNA-1 in acute myocardial infarction［J］.Clin Sci(Lond)，2010，119(2):87-95.

［13］Wang GK，Zhu JQ，Zhang JT，etal.Circulating microRNA:a novel potential biomarker for early diagnosis of acute myocardial infarction in humans［J］.Eur Heart J，2010，31(6):659-666.

［14］Devaux Y，Vausort M，Goretti E，etal.Use of circulating microRNAs to diagnose acute myocardial infarction［J］.Clin Chem，2012，58(3):559-567.

［15］Ai J，Zhang R，Li Y，etal.Circulating microRNA-1 as a potential novel biomarker for acute myocardial infarction［J］.Biochem Biophys Res Commun，2010，391(1):73-77.

［16］Ji X，Takahashi R，Hiura Y，etal.Plasma miR-208 as a biomarker of myocardial injury［J］.Clin Chem，2009，55(11):1944-1949.

［17］Widera C，Gupta SK，Lorenzen JM，etal.Diagnostic and prognostic impact of six circulating microRNAs in acute coronary syndrome［J］.J Mol Cell Cardiol，2011，51(5):872-875.

［18］Wang R，Li N，Zhang Y，etal.Circulating microRNAs are promising novel biomarkers of acute myocardial infarction［J］.Intern Med，2011，50(17):1789-1795.

［19］Lusi EA，Passamano M，Guarascio P，etal.Innovative electrochemical approach for an early detection of microRNAs［J］.Anal Chem，2009，81(7):2819-2822.

［20］Adachi T，Nakanishi M，Otsuka Y，etal.Plasma microRNA 499 as a biomarker of acute myocardial infarction［J］.Clin Chem，2010，56(7):1183-1185.

［21］Corsten MF，Dennert R，Jochems S，etal.Circulating MicroRNA-208b and MicroRNA-499 reflect myocardial damage in cardiovascular disease［J］.Circ Cardiovasc Genet，2010，3(6):499-506.

［22］Gidl?f O，Andersson P，van der Pals J，etal.Cardiospecific microRNA plasma levels correlate with troponin and cardiac function in patients with ST elevation myocardial infarction，are selectively dependent on renal elimination，and can be detected in urine samples［J］.Cardiology，2011，118(4):217-226.

［23］Liu J，Gao J，Du Y，etal.Combination of plasma microRNAs with serum CA19-9 for early detection of pancreatic cancer［J］.Int J Cancer，2012，131(3):683-691.

［24］Matsumoto S，Sakata Y，Nakatani D，etal.A subset of circulating microRNAs are predictive for cardiac death after discharge for acute myocardial infarction［J］.Biochem Biophys Res Commun，2012，427(2):280-284.