長(zhǎng)期有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)慢性心力衰竭大鼠心肌能量代謝的調(diào)節(jié)

王勇，馬延超

（1.濰坊學(xué)院 體育學(xué)院，山東 濰坊 261061；2.洛陽(yáng)師范學(xué)院 體育學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471022）

心肌細(xì)胞代謝性重塑是心力衰竭(heart failure，HF)發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制。HF時(shí)心肌脂肪酸(fatty acid，F(xiàn)A)氧化減少、葡萄糖利用增加[1]，能量代謝的效率增加，這是心肌的自我保護(hù)機(jī)制。但同時(shí)糖酵解代謝增強(qiáng)，乳酸產(chǎn)生增多造成酸中毒與心肌損害，F(xiàn)A利用減少，脂質(zhì)在心臟沉積并造成心肌細(xì)胞凋亡與脂毒性心臟異常[2]，加之HF時(shí)線粒體生物合成減少[3]，能量生成進(jìn)一步下降，即所謂的心肌能量饑渴(energy starvation)[4]，心功能繼之惡化，因此心肌代謝性重塑又加速了HF進(jìn)程。

有氧運(yùn)動(dòng)可改善HF患者心肌代謝異常，但具體分子機(jī)制尚未明確。AMPK(磷酸腺苷活化蛋白激酶)是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)能量代謝的酶類(lèi)，其主要作用是通過(guò)激活下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑促進(jìn)能量產(chǎn)生，維持細(xì)胞的能量平衡穩(wěn)態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，AMPK在心臟的正常發(fā)育以及心肌代謝過(guò)程中起重要作用，同時(shí)對(duì)心肌缺血-再灌注損傷起保護(hù)作用[5]。關(guān)于運(yùn)動(dòng)與 AMPK關(guān)系的研究主要集中在骨骼肌組織，而在心肌表達(dá)的研究較少，Coven等[6]和Musi等[7]發(fā)現(xiàn)，一次急性運(yùn)動(dòng)可上調(diào)正常心肌AMPK活性或表達(dá)量，并呈現(xiàn)運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度依賴性，提示AMPK在心肌能量代謝以及對(duì)運(yùn)動(dòng)適應(yīng)中起重要作用。但長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)對(duì)HF心臟AMPK表達(dá)及對(duì)能量代謝的影響未見(jiàn)報(bào)道。本研究以心梗后慢性HF大鼠為模型，觀察8周有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)心功能、心肌糖原、FA和乳酸含量以及 AMPKα、PPARα、CPT-1、GLUT4、PGC-1α基因表達(dá)的影響，探討長(zhǎng)期有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)HF心臟代謝性重塑的影響及可能機(jī)制。

1 研究對(duì)象和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠45只，體質(zhì)量260~320 g，雌雄各半，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食水。

1.2 心梗后HF模型的建立

大鼠隨機(jī)分為心梗組(MI組，30只)和假手術(shù)組(Sham組，15只)。心梗組采用冠狀動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)方法：麻醉后連接呼吸機(jī)，開(kāi)胸暴露心臟，由左心耳下方2~3 mm處用0號(hào)絲線結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支。Sham組只開(kāi)胸穿線，不結(jié)扎，其他操作同MI組。MI組再隨機(jī)分為心梗對(duì)照組(MI-Sed組)和心梗運(yùn)動(dòng)組(MI-Ex組)，每組各15只。Sham組和MI-Sed組保持安靜狀態(tài)，MI-Ex組進(jìn)行為期8周的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練。

1.3 有氧運(yùn)動(dòng)方案

采用Bedford等建立的大鼠跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)方案：即5 min熱身(坡度為0°，速度為5 m/min)后，坡度調(diào)為5°，速度為 10 m/min(相當(dāng)于 45%VO2max)，第 1天訓(xùn)練 15 min、第2天30 min、第3天45 min，從第4天開(kāi)始均為60 min。5 d/周，共訓(xùn)練8周。

1.4 血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)(心功能)測(cè)定

腹腔麻醉大鼠，心導(dǎo)管插管至左心室，連接壓力換能器，利用多媒體生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)記錄左心室收縮期壓力(LVSP)、左心室舒張末期壓力(LVEDP)、左心室壓力最大上升速率(＋(dp/dt)max)和左室壓力最大下降速率(－(dp/dt)max)。

1.5 取材

大鼠斷頭處死后取心臟，用生理鹽水沖洗，濾紙沾干后迅速將組織置于液氮中并轉(zhuǎn)移至－80 ℃冰箱凍存待測(cè)。

1.6 心肌FA、糖原和乳酸測(cè)定

均采用比色法測(cè)定心肌勻漿液中糖原質(zhì)量分?jǐn)?shù)、FA濃度和乳酸質(zhì)量摩爾濃度，嚴(yán)格按照試劑盒(南京建成生物工程研究所)操作說(shuō)明進(jìn)行。單位分別為：mg/g、mmol/L、μmmol/g。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)心肌 PPARα和 CPT-1 mRNA水平

將心肌勻漿后，用Trizol法抽提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(ABI 7900HT型熒光定量PCR儀，美國(guó))測(cè)定PPARα和CPT-1 mRNA含量，引物序列見(jiàn)表1，擴(kuò)增條件：預(yù)變性95 ℃，1 min；94 ℃，30 s；54 ℃，30 s；72 ℃，1 min。共40個(gè)循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度

1.8 Western blot測(cè)定心肌總AMPKα蛋白、磷酸化AMPK α蛋白(p-AMPKα)、GLUT4和PGC-1α表達(dá)水平

裂解細(xì)胞后提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。灌制10%的分離膠和5%的濃縮膠，恒壓120 V、80 mA預(yù)電泳10 min，上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，兔抗大鼠 AMPKα、AMPKα-Thr172磷酸化、GLUT4和 PGC-1α多克隆抗體于 4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌PVDF膜。加二抗后室溫孵育1 h，暗室中滴加發(fā)光底物混合物2 mL于PVDF膜上，曝光、顯影、定影。對(duì)目的蛋白進(jìn)行光密度分析，以β-actin為內(nèi)參。目的蛋白相對(duì)含量＝目的蛋白灰度值/β-actin蛋白灰度值。

1.9 心肌組織病理學(xué)觀察

沿心臟長(zhǎng)軸將心尖至結(jié)扎點(diǎn)取2 mm厚組織制作切片，40 g/L多聚甲醛固定，石蠟包埋，Masson染色，普通光鏡觀察各組心肌組織病理學(xué)變化。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)使用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，使用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，各組兩兩比較使用LSD檢驗(yàn)。顯著性水平定為P<0.05，非常顯著水平定為P<0.01。

2 結(jié)果及分析

2.1 大鼠血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)的變化

表2結(jié)果顯示，與Sham組比較，MI-Sed組LVSP、±(dp/dt)max顯著性下降(均為P<0.01)，LVEDP則顯著性升高(P<0.01)；與MI-Sed組比較，MI-Ex組LVSP、±(dp/dt)max顯著性升高(均為P<0.01)，LVEDP則顯著性下降(P<0.01)。

表2 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響

表2 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響

與MI-Sed組比較，1)P<0.05，2)P<0.01；與Sham組比較，3)P<0.05，4)P<0.01

組別 n/只 LVSP/mmHg LVEDP/mmHg ＋(dp/dt)max/(mmHg·s-1) －(dp/dt)max/(mmHg·s-1)Sham 15 137.26±11.55 4.18±1.76 4 324.64±465.19 4 237.06±381.92 MI-Sed 15 78.39±9.754) 11.47±2.964) 2 478.28±215.274) 2 034.18±194.554)MI-Ex 15 108.35±13.202)3) 7.55±1.692)4) 3 674.82±298.352)4) 2 838.48±251.622)4)

2.2 心肌糖原、FA和乳酸含量的變化

與 Sham組比較，MI-Sed組糖原質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低(P<0.01)，F(xiàn)A濃度和乳酸質(zhì)量摩爾濃度升高(均為P<0.01)；與 MI-Sed組比較，MI-Ex組糖原質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高(P<0.05)，F(xiàn)A濃度和乳酸質(zhì)量摩爾濃度下降(均為P<0.01)(見(jiàn)表 3)。

表3 大鼠心肌糖原質(zhì)量分?jǐn)?shù)、FA濃度和乳酸質(zhì)量摩爾濃度的變化

表3 大鼠心肌糖原質(zhì)量分?jǐn)?shù)、FA濃度和乳酸質(zhì)量摩爾濃度的變化

與MI-Sed組比較，1)P<0.05，2)P<0.01；與Sham組比較，3)P<0.05，4)P<0.01

組別 n/只 w(糖原)/(mg·g-1) c(FA)/(mmol·L-1) b(乳酸)/(μmmol·g-1)Sham 15 4.17±1.30 0.62±0.08 122±27 MI-Sed 15 2.35±0.764) 1.75±0.284) 314±514)MI-Ex 15 3.78±0.621) 0.71±0.122) 233±352)4)

2.5 心臟組織病理學(xué)改變

Masson染色顯示。Sham組心肌細(xì)胞著色均勻，無(wú)明顯膠原成分。MI-Sed組心肌纖維化程度明顯，只有少量心肌細(xì)胞。MI-Ex組較 MI-Sed組心肌細(xì)胞增多，膠原纖維顯著減少(見(jiàn)圖1)。

圖1 各組心肌組織病理學(xué)變化

2.6 心肌PPARα和CPT-1 mRNA的變化

心肌PPARα和CPT-1 mRNA的變化規(guī)律一致，即MI-Sed組顯著低于Sham組(P<0.01)，MI-Ex組顯著高于MI-Sed組(P<0.01)(見(jiàn)圖2)。

圖2 心肌PPARα和CPT-1 mRNA的變化

2.7 心肌總AMPKα、p-AMPKα、GLUT4和PGC-1α蛋白的變化

心肌總 AMPKα蛋白在各組差異無(wú)顯著性(P>0.05)。p-AMPKα在 MI-Sed組高于 Sham 組(P<0.05)，MI-Ex組則分別高于MI-Sed組和Sham組(P<0.01)。GLUT4和 PGC-1α變化趨勢(shì)一致，即在MI-Sed組低于 Sham 組(P<0.01)，在 MI-Ex組高于MI-Sed 組(P<0.01)(見(jiàn)圖 3)。

圖3 心肌總AMPKα、p-AMPKα、GLUT4和PGC-1α蛋白的變化

3 討論

本研究探討了長(zhǎng)期有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)HF大鼠心肌能量代謝的影響發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)通過(guò)活化AMPK，上調(diào)下游靶分子(GLUT4、PPARα、CPT-1和PGC-1α)的基因表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn) FA利用、葡萄糖攝取與有氧氧化、線粒體生物合成增加、心肌有氧代謝能力提高，減少了心臟脂質(zhì)沉積與乳酸堆積，因此改善了HF后心臟代謝性重塑并提高心功能。

3.1 HF后心肌代謝性重塑及運(yùn)動(dòng)的良性效應(yīng)

本研究成功建立心梗后HF模型，即MI-Sed組表現(xiàn)出典型的心梗后心室舒縮功能下降(LVSP、±(dp/dt)max顯著性下降，LVEDP則顯著性升高)，同時(shí)心肌糖原質(zhì)量分?jǐn)?shù)減少、FA濃度堆積、乳酸升高、線粒體生物合成減少。8周有氧運(yùn)動(dòng)后，與MI-Sed組比較，MI-Ex組心功能改善(LVEDP顯著性降低，LVSP、±(dp/dt)max顯著性升高)，糖原質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高，F(xiàn)A濃度和乳酸質(zhì)量摩爾濃度下降。上述結(jié)果提示，心梗后HF心臟發(fā)生代謝性重塑，能量產(chǎn)生減少、酸中毒和脂毒性造成心功能進(jìn)一步下降，有氧運(yùn)動(dòng)則延緩了這一病理過(guò)程的發(fā)生，這與臨床流行病學(xué)的研究一致[8-9]。但運(yùn)動(dòng)如何通過(guò)調(diào)節(jié)能量代謝進(jìn)而改善心功能，至今仍不清楚。由于AMPK在心肌能量代謝中起關(guān)鍵作用且運(yùn)動(dòng)應(yīng)激可使其活化[6-7]，因此，推測(cè)運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的AMPK上調(diào)可能參與了對(duì)HF后心肌代謝性重塑的調(diào)節(jié)。

3.2 運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的AMPK信號(hào)通路參與了HF大鼠心肌能量的調(diào)節(jié)

研究表明，AMPK在心臟的正常發(fā)育以及心肌代謝過(guò)程中起重要作用，同時(shí)對(duì)心肌缺血-再灌注損傷起保護(hù)作用[5，10]。運(yùn)動(dòng)時(shí)，AMP與ATP比值升高誘導(dǎo)AMPK活化[6]，因此一次急性運(yùn)動(dòng)可活化AMPK[7]，并呈現(xiàn)運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度依賴性，提示AMPK在心肌能量代謝以及對(duì)運(yùn)動(dòng)適應(yīng)中起重要作用，但長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)病理心臟AMPK表達(dá)的影響尚無(wú)報(bào)道。在本研究中，經(jīng)過(guò)8周運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，總AMPKα蛋白在各組差異無(wú)顯著性，p-AMPKα(AMPK磷酸化后才能被激活，所以只有p-AMPKα具有生物活性)在MI-Ex組顯著高于MI-Sed組和Sham組，說(shuō)明長(zhǎng)期有氧運(yùn)動(dòng)可持續(xù)上調(diào)AMPK表達(dá)水平，這與長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)可提高骨骼肌、脂肪與肝臟AMPK活性的研究結(jié)果相似[11-12]，同時(shí)提示，AMPK在運(yùn)動(dòng)改善HF大鼠代謝性重塑中扮演重要角色。

1)運(yùn)動(dòng)活化AMPK-PGC-1α信號(hào)通路與線粒體生物合成。

正常心肌細(xì)胞的主要供能物質(zhì)是 FA，可產(chǎn)生60%~70%ATP，其余大約30%ATP由葡萄糖代謝供給，因此，線粒體在心肌細(xì)胞供能過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。PGC-1α是調(diào)節(jié)線粒體生物合成的關(guān)鍵性信號(hào)分子，其表達(dá)增加激活包括核呼吸因子(NRFs)及線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(Tfam)在內(nèi)的一組轉(zhuǎn)錄因子，啟動(dòng)線粒體DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄而誘導(dǎo)線粒體生物合成[13]。AMPK作為PGC-1α的上游信號(hào)分子，可上調(diào)其表達(dá)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，MI-Sed組PGC-1α蛋白水平顯著低于Sham組，提示HF時(shí)線粒體生物合成減少，這與前人的研究一致[3]。MI-Ex組p-AMPKα和PGC-1α均較MI-Sed組顯著升高，推測(cè)長(zhǎng)期有氧運(yùn)動(dòng)可激活A(yù)MPK-PGC-1α信號(hào)通路，促進(jìn)心肌線粒體生物合成[15]。臨床研究指出，運(yùn)動(dòng)能力下降、易疲勞和肌無(wú)力是影響HF患者生活質(zhì)量的主要因素，這與HF時(shí)心輸出量和最大攝氧量(VO2max)降低以及有氧代謝能力下降密切相關(guān)。而PGC-1α上調(diào)使線粒體容積密度增加并與 HF患者VO2max和無(wú)氧閾的變化正相關(guān)[16]。因此，運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)AMPK-PGC-1α上調(diào)改善了HF時(shí)能量產(chǎn)生，心臟收縮功能和有氧能力(VO2max)隨之提高[17]，為代謝性重塑的良性變化奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

2)運(yùn)動(dòng)活化AMPK-PPARα信號(hào)通路與FA代謝。

FA是正常心肌安靜時(shí)的主要能量底物，PPARα能夠調(diào)控編碼心肌線粒體大部分 FA氧化酶的基因表達(dá)[18]，其中CPT-1催化長(zhǎng)鏈FA進(jìn)入線粒體，是決定FA氧化的限速酶之一。最新的研究指出，PPARα是AMPK下游的靶分子，即AMPK可上調(diào)PPARα表達(dá)，兩者構(gòu)成AMPK-PPARα信號(hào)通路，對(duì)維持心肌能量代謝穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要作用[19-20]。此外，AMPK還可激活PGC1α，PGC1α作為轉(zhuǎn)錄協(xié)同激活因子，與PPARα結(jié)合促進(jìn)FA代謝酶的表達(dá)。

研究證實(shí)，壓力過(guò)負(fù)荷HF模型8周后，PPARα mRNA和蛋白水平均顯著低于對(duì)照組[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，雖然MI-Sed組AMPK有一定程度升高，但PPARα mRNA在MI-Sed組顯著低于Sham組，提示少量活化的AMPK不足以上調(diào)PPARα或者存在其他網(wǎng)絡(luò)式信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(如PGC1α下調(diào))。伴隨CPT-1的表達(dá)下調(diào)，心肌FA含量顯著升高，這是HF時(shí)FA利用減少的重要分子機(jī)制。HF時(shí)FA供能減少，一方面，可減少缺血缺氧狀態(tài)下心肌氧耗(FA氧化耗氧量多于葡萄糖)，但同時(shí)可造成脂質(zhì)在心臟沉積，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡和脂毒性心臟異常。臨床研究發(fā)現(xiàn)，HF患者心肌內(nèi)出現(xiàn)明顯的脂質(zhì)沉積，而且心肌細(xì)胞間脂質(zhì)沉積與收縮功能失調(diào)及心功能衰竭有關(guān)[2]。

耐力運(yùn)動(dòng)可上調(diào)心臟 PPARα表達(dá)水平[21]，與本研究結(jié)果一致，即經(jīng)過(guò)8周有氧運(yùn)動(dòng)，MI-Ex組PPARα、CPT-1 mRNA水平顯著高于MI-Sed組，說(shuō)明長(zhǎng)期有氧運(yùn)動(dòng)激活了 AMPK-PPARα信號(hào)通路，加之 PGC1 α上調(diào)、線粒體生物合成增加使心肌能夠更有效的氧化、利用FA供能，心臟FA含量顯著降低，減輕了心臟脂質(zhì)沉積并改善脂毒性心臟異常。

3)運(yùn)動(dòng)活化 AMPK-GLUT4信號(hào)通路與葡萄糖代謝。

葡萄糖代謝約占正常心肌能量代謝的1/3。AMPK可通過(guò)上調(diào) GLUT4表達(dá)以及轉(zhuǎn)位而促進(jìn)葡萄糖攝取并增強(qiáng)糖酵解作用[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，HF時(shí)GLUT4蛋白表達(dá)下調(diào)，這與Tian等[19]的研究結(jié)果一致，他們還發(fā)現(xiàn)，雖然GLUT4總蛋白降低，但肌膜上的GLUT4占總蛋白的百分比卻增加，提示HF時(shí)AMPK代償性增加可促進(jìn) GLUT4向肌膜轉(zhuǎn)位，從而增加葡萄糖攝取。然而由于 GULT4總量減少，GLUT4在肌膜的相對(duì)增多并不能滿足HF時(shí)心肌的能量供應(yīng)。HF時(shí)糖酵解效率明顯增強(qiáng)，心肌糖原含量減少，乳酸堆積增多、酸中毒進(jìn)一步影響心功能[23]。

一次急性運(yùn)動(dòng)可上調(diào)GLUT4表達(dá)[24]，其意義在于通過(guò)增強(qiáng)糖酵解作用及時(shí)為心肌提供能量(糖酵解供能效率均較 FA和糖有氧氧化高)。但長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)上調(diào)GLUT4表達(dá)的意義可能不同于一次急性運(yùn)動(dòng)。在本研究中，MI-Ex組GLUT4蛋白水平顯著高于MI-Sed組，提示長(zhǎng)期有氧運(yùn)動(dòng)通過(guò)活化AMPK促進(jìn)GLUT4表達(dá)，葡萄糖攝取增加。與此同時(shí)，MI-Ex組心肌乳酸含量較MI-Sed組顯著性降低(但仍高于Sham組)，說(shuō)明長(zhǎng)期有氧運(yùn)動(dòng)促使HF時(shí)糖酵解供能向糖有氧氧化供能轉(zhuǎn)變。其可能機(jī)制是長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)通過(guò)增加線粒體生物合成、舒張血管(特別是冠狀動(dòng)脈)增加血流量，機(jī)體的有氧代謝能力增強(qiáng)，同時(shí)FA氧化利用增加又可通過(guò)葡萄糖-脂肪酸循環(huán)[25]抑制糖酵解的關(guān)鍵酶——丙酮酸脫氧酶和磷酸果糖激酶，使糖酵解供能逐漸轉(zhuǎn)向糖有氧氧化供能。因此，心肌乳酸堆積減少，心功能隨之改善。

HF時(shí)心肌能量代謝的特點(diǎn)是由優(yōu)先利用FA轉(zhuǎn)變?yōu)樘墙徒夤┠転橹鞑⒃斐伤嶂卸竞椭|(zhì)沉積，同時(shí)線粒體生物合成減少，隨著HF發(fā)展進(jìn)程，脂肪酸與葡萄糖的利用均顯著下降；運(yùn)動(dòng)則使FA氧化、葡萄糖利用以及線粒體生物合成均增加，這是心肌對(duì)長(zhǎng)期訓(xùn)練適應(yīng)的結(jié)果。

綜上所述，長(zhǎng)期有氧運(yùn)動(dòng)通過(guò)激活A(yù)MPK及其下游信號(hào)通路改善了HF心臟的代謝性重塑并提高運(yùn)動(dòng)心功能。

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