運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)糖尿病大鼠心肌纖維化的改善作用及其可能機(jī)制

侯改霞，肖國(guó)強(qiáng)

（1.華南師范大學(xué) 體育科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.河南大學(xué) 體育學(xué)院，河南 開封 475001）

心肌纖維化是糖尿病心肌病變時(shí)的重要特征之一[1]。心肌纖維化可增加心室壁的僵硬度，降低心室順應(yīng)性而導(dǎo)致心室收縮及舒張功能不全，心功能下降，并最終導(dǎo)致心力衰竭。因此心肌纖維化成為近年來糖尿病心肌病研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)。Castellar等[2]和Searls等[3]分別通過天狼星紅染色技術(shù)和透射電子顯微鏡技術(shù)觀察到運(yùn)動(dòng)可顯著改善糖尿病大鼠心肌纖維化，但具體機(jī)制的研究卻很少見。本研究通過高脂喂養(yǎng)加腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素(STZ)構(gòu)建2型糖尿病大鼠模型，觀察運(yùn)動(dòng)對(duì)2型糖尿病大鼠心肌纖維化的影響，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 造模與分組

雄性SD大鼠45只(SPF級(jí)，6周齡，體重(160~180)g；購(gòu)自鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(豫)2010-0002)。大鼠分籠飼養(yǎng)，自然晝夜節(jié)律變化，自由飲食。室溫(23±2) ℃，相對(duì)濕度40%~60%。高脂飼料配方：64.8%基礎(chǔ)飼料，20%蔗糖，10%豬油，5%蛋黃粉，0.2%膽酸鈉(質(zhì)量比)。高脂飼料由鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心配制。

參照Reed等[4]、Srinivasan等[5]方法建立2型糖尿病大鼠模型。SD大鼠普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分成正常對(duì)照組(10只)和高脂飲食組(35只)2組，正常對(duì)照組繼續(xù)飼喂普通飼料，高脂飲食組改為高脂飼料喂養(yǎng)。飼喂6周后，高脂飲食組通過口服葡萄糖耐量試驗(yàn)和胰島素敏感性試驗(yàn)證實(shí)產(chǎn)生胰島素抵抗后，過夜空腹12 h，腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素(STZ，30 mg/kg)，72 h后檢測(cè)大鼠隨機(jī)血糖，隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L為糖尿病大鼠暫時(shí)成模標(biāo)準(zhǔn)，剔除血糖不達(dá)標(biāo)大鼠。1周后復(fù)查暫時(shí)成模大鼠，隨機(jī)血糖仍≥16.7 mmol/L為建模成功。共有33只大鼠造模成功。將造模成功大鼠隨機(jī)分為糖尿病對(duì)照組(16只)和糖尿病運(yùn)動(dòng)組(17只)。

1.2 訓(xùn)練方案

糖尿病運(yùn)動(dòng)組大鼠進(jìn)行不負(fù)重游泳訓(xùn)練，水溫36℃，訓(xùn)練時(shí)間共12周，每周5 d。第1周15 min，以后以每周15 min遞增延長(zhǎng)，直到延長(zhǎng)至每天90 min。大鼠游泳過程中若出現(xiàn)漂浮現(xiàn)象，采用人為驅(qū)趕的方式使其繼續(xù)游泳。

1.3 主要試劑和儀器

STZ購(gòu)自Sigma公司，兔抗NF-κB P65多克隆抗體、氧化型谷胱甘肽(GSSG)和還原型谷胱甘肽(GSH)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所，血糖(GLU)、糖化血紅蛋白(GHb)、糖化血清蛋白(GSP)、羥脯氨酸(Hyp)、丙二醛(MDA)和Masson染色檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物研究所，晚期糖基化末端產(chǎn)物(AGEs)、胰島素(INS)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海藍(lán)基生物科技公司。

RT-2100C酶標(biāo)儀(美國(guó))、RT-1904C半自動(dòng)生化分析儀(美國(guó))、垂直平板電泳儀(北京市六一儀器廠)、半干印跡轉(zhuǎn)移槽(北京市六一儀器廠)、高速冷凍離心機(jī)(Sigma)、722 紫外分光光度計(jì)(上海精工儀器有限公司)、MDF-382E(N)超低溫冰箱(日本)。

1.4 取材和指標(biāo)檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)過程中，糖尿病對(duì)照組和糖尿病運(yùn)動(dòng)組大鼠相繼死亡9只，至12周游泳訓(xùn)練結(jié)束時(shí)，糖尿病對(duì)照組余13只，糖尿病運(yùn)動(dòng)組余11只。在游泳訓(xùn)練第12周周末，所有大鼠過夜禁食12 h后，將大鼠腹腔麻醉，剖腹，從腹主動(dòng)脈取血，取部分全血用于GHb測(cè)定，其余全血3 000 r/min離心20 min，取血清置于-80 ℃冰箱保存待測(cè)。取部分左心室置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 4%多聚甲醛中固定以備Masson染色檢測(cè)，另取部分左心室置于-80 ℃冰箱保存以做心肌 AGEs、Hyp、MDA、GSSG和GSH含量和NF-κB P65蛋白Western blotting檢測(cè)。

1)心肌Masson染色檢測(cè)。

常規(guī)乙醇梯度脫水，石蠟包埋切片，片厚4 μm，Masson染色，中性樹脂封片。染色結(jié)果：膠原纖維和胞核呈藍(lán)色，胞質(zhì)、肌纖維呈紅色。在Olympus顯微鏡400倍光鏡視野下，每張切片隨機(jī)選出6個(gè)視野并獲取圖像，采用Image-Pro Plus Version 6.0圖像分析系統(tǒng)分析。測(cè)量每個(gè)視野中藍(lán)色膠原纖維染色的面積，計(jì)算膠原面積與心肌組織總面積的比值，取其均值即為每只大鼠膠原容積分?jǐn)?shù)(Collagen Volume Fraction，CVF)，含膠原豐富的冠脈細(xì)小血管區(qū)域不納入測(cè)量范圍內(nèi)[6]。

2)血液 GLU、GHb、GSP、INS和心肌Hyp、MDA、AGEs、GSSG、GSH檢測(cè)。

GLU測(cè)試采用磷鉬酸法，GHb采用比色法(結(jié)果以每10 g血紅蛋白中糖化血紅蛋白的光密度值表示)，GSP采用果糖胺法，羥脯氨酸(Hyp)測(cè)定采用堿水解法，MDA采用硫代巴比妥酸法，GSSG和GSH采用分光光度法，Insulin和AGEs采用酶聯(lián)免疫法，操作檢測(cè)流程嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。心肌組織使用勻漿器進(jìn)行勻漿，制成10%心肌組織勻漿液。

3)NF-κB P65 Western blot檢測(cè)。

取大鼠左心室組織100 mg，加入1 000 μL RIPA裂解液(含蛋白酶抑制劑)充分勻漿，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清，用BCA法進(jìn)行蛋白定量；取20 μg樣品，電泳后轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上；5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；一抗孵育(NF-κB P65一抗稀釋濃度為1︰200)，4 ℃過夜孵育；二抗室溫?fù)u床孵育2 h。充分洗滌后曝光、顯影、定影、掃描，用Quantity One圖像分析軟件分析目標(biāo)條帶與內(nèi)參(GAPDH)光密度值的比值。

4)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果及分析

2.1 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)2型糖尿病大鼠血液GLU、INS、GHb和GSP水平的影響

由表1可見，與正常對(duì)照組相比，糖尿病對(duì)照組血液GLU、INS、GHb和GSP水平均升高(P<0.05或P<0.01)。糖尿病運(yùn)動(dòng)組血液GLU、GHb和GSP水平均比糖尿病對(duì)照組下降(P<0.01)，但仍高于正常對(duì)照組(P<0.01)。

表1 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)2型糖尿病大鼠血液GLU、INS、GHb和GSP水平的影響

表1 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)2型糖尿病大鼠血液GLU、INS、GHb和GSP水平的影響

1)以每10 g血紅蛋白中糖化血紅蛋白的密度值表示；2)與正常對(duì)照組比較，P<0.01；3)與糖尿病對(duì)照組比較，P<0.01；4)與正常對(duì)照組比較，P<0.05

組別 n/只 c(GLU)/(mmol·L-1) ρ(INS)/(ng·mL-1) GHb1) c(GSP)/(mmol·L-1)正常對(duì)照組 10 5.80±0.34 1.46±0.13 11.15±1.47 2.98±0.16糖尿病對(duì)照組 13 14.21±0.932) 1.62±0.124) 35.48±3.102) 5.75±0.362)糖尿病運(yùn)動(dòng)組 11 10.84±0.512)3) 1.56±0.20 26.34±2.182)3) 4.11±0.352)3)

2.2 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)2型糖尿病大鼠心肌GSSG/GSH值、MDA含量的影響

由表2可見，糖尿病對(duì)照組心肌GSSG/GSH、MDA均高于正常對(duì)照組(P<0.01)，糖尿病運(yùn)動(dòng)組心肌GSSG/GSH、MDA均低于糖尿病對(duì)照組(P<0.01)，但仍高于正常對(duì)照組(P<0.01或P<0.05)。

表2 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)2型糖尿病大鼠心肌GSSG/GSH值、MDA含量的影響

表2 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)2型糖尿病大鼠心肌GSSG/GSH值、MDA含量的影響

1)與正常對(duì)照組比較，P<0.01；2)與糖尿病對(duì)照組比較，P<0.01；3)與正常對(duì)照組比較，P<0.05

組別 n/只 GSSG/GSH b(MDA)/(nmol·mg-1)正常對(duì)照組 10 0.026 7±0.003 9 0.613 3±0.082 4糖尿病對(duì)照組 13 0.107 4±0.008 71) 1.185 7±0.078 31)糖尿病運(yùn)動(dòng)組 11 0.084 1±0.005 81)2) 0.883 3±0.056 12)3)

2.3 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)2型糖尿病大鼠心肌 AGEs、Hyp和CVF的影響

由表 3可見，糖尿病對(duì)照組心肌 AGEs、Hyp和CVF均高于正常對(duì)照組(P<0.01)，糖尿病運(yùn)動(dòng)組心肌AGEs、Hyp和CVF均低于糖尿病對(duì)照組(P<0.01)，但仍高于正常對(duì)照組(P<0.01)。

表3 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)2型糖尿病大鼠心肌AGEs、Hyp和CVF的影響

表3 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)2型糖尿病大鼠心肌AGEs、Hyp和CVF的影響

1)與正常對(duì)照組比較，P<0.01；2)與糖尿病對(duì)照組比較，P<0.01

組別 n/只 w(AGEs)/(ng·mg-1) w(Hyp)/(μg·g-1) CVF/%正常對(duì)照組 10 0.36±0.11 477±23 9.16±1.34糖尿病對(duì)照組 13 3.32±0.321) 785±421) 19.42±2.191)糖尿病運(yùn)動(dòng)組 11 2.00±0.301)2) 654±261)2) 14.90±1.021)2)

2.4 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)2型糖尿病大鼠心肌NF-κB P65蛋白表達(dá)的影響

由表4可見，與正常對(duì)照組相比，糖尿病對(duì)照組大鼠心肌NF-κB P65蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可降低糖尿病大鼠心肌NF-κB P65蛋白表達(dá)(P<0.05)。

表4 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)2型糖尿病大鼠心肌NF-κB P65蛋白表達(dá)的影響

表4 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)2型糖尿病大鼠心肌NF-κB P65蛋白表達(dá)的影響

1)與正常對(duì)照組比較，P<0.01；2)與糖尿病對(duì)照組比較，P<0.05

組別 n/只 NF-κB P65積分光密度比值正常對(duì)照組 6 0.147 1±0.032 2糖尿病對(duì)照組 6 0.512 5±0.084 31)糖尿病運(yùn)動(dòng)組 6 0.431 7±0.057 51)2)

3 討論

3.1 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)2型糖尿病大鼠血液指標(biāo)的影響

本研究采用高脂飲食加小劑量STZ復(fù)制2型糖尿病動(dòng)物模型，經(jīng)過12周的實(shí)驗(yàn)周期，2型糖尿病動(dòng)物模型仍表現(xiàn)出中度高血糖、中度高胰島素血癥和胰島素抵抗的主要臨床特征，證明2型糖尿病大鼠模型建模成功。GHb是血液中血紅蛋白與糖類經(jīng)過緩慢、連續(xù)的非酶促反應(yīng)生成的產(chǎn)物，能反映測(cè)定點(diǎn)之前 1~2個(gè)月甚至更長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)的平均血糖水平，是判定糖尿病長(zhǎng)期血糖控制的指標(biāo)[7]。GSP是一類類似果糖胺的物質(zhì)，是血漿中蛋白質(zhì)與葡萄糖非酶糖化過程中形成的一種高分子酮胺結(jié)構(gòu)，GSP反映的是測(cè)定前1~3周內(nèi)血糖的平均水平[8]。本研究表明，12周游泳運(yùn)動(dòng)不但降低2型糖尿病大鼠血液GLU水平，也顯著降低了血液GHb和GSP水平，提示運(yùn)動(dòng)降低2型糖尿病大鼠GLU水平的效果是長(zhǎng)效穩(wěn)定的，這可能與運(yùn)動(dòng)增加能量的消耗，促進(jìn)機(jī)體對(duì)葡糖糖的吸收有關(guān)。

3.2 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練改善 2型糖尿病大鼠心肌纖維化的可能機(jī)制

研究發(fā)現(xiàn)，不管是1型糖尿病還是2型糖尿病，糖尿病心肌病最突出的病理組織學(xué)變化是心肌纖維化[9]。心肌纖維化是指在心肌的正常組織結(jié)構(gòu)中膠原纖維過量積聚，表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解失衡，心臟組織中膠原濃度顯著升高或膠原成分發(fā)生改變[10]。本研究結(jié)果顯示2型糖尿病大鼠心肌Hyp和CVF均顯著升高，證明2型糖尿病大鼠已經(jīng)發(fā)生了心肌纖維化，而運(yùn)動(dòng)對(duì)此具有很好的改善作用。

臨床藥理研究認(rèn)為糖尿病心肌晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycosylation end products，AGEs)的含量與心肌纖維化密切相關(guān)，對(duì)AGEs清除、抑制是防治糖尿病心肌纖維化的重要途徑[11]。AGEs通過多種病理機(jī)制參與糖尿病組織膠原的代謝，概括起來分為兩類：(1)非受體介導(dǎo)途徑[12-13]：AGEs直接與長(zhǎng)周期蛋白質(zhì)如膠原蛋白共價(jià)交聯(lián)，同時(shí)不易被蛋白酶降解，導(dǎo)致血管壁、心肌變硬和功能改變。(2)受體介導(dǎo)途徑[14-15]：AGEs與其受體RAGE (Receptor for AGEs)結(jié)合，激活各種信號(hào)傳導(dǎo)通路，如：MAPK、PI3K、NADPH等，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激[16-17]。氧化應(yīng)激的升高反過來又可激活多條信號(hào)傳導(dǎo)通路，如ERK1/2MAPK、P38MAPK、JAK/STAT等，進(jìn)而通過這些信號(hào)通路的級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)，激活下游對(duì)氧化還原反應(yīng)敏感的核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，NF-κB進(jìn)一步調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá)。本研究顯示運(yùn)動(dòng)可有效降低2型糖尿病大鼠心肌AGEs含量，這與運(yùn)動(dòng)降低正常人體血清[18-19]和肥胖糖尿病 Zucker大鼠腎臟[20]AGEs水平的研究結(jié)論一致。運(yùn)動(dòng)降低2型糖尿病大鼠心肌AGEs含量，其機(jī)制可能是：高血糖是引起AGEs生成的直接因素，運(yùn)動(dòng)可顯著降低2型糖尿病大鼠血糖水平，進(jìn)而降低AGEs的生成；其次，AGEs的形成過程產(chǎn)生氧化應(yīng)激，同時(shí)氧化應(yīng)激也可促進(jìn)AGEs的形成。運(yùn)動(dòng)對(duì)糖尿病機(jī)體具有抗氧化、抗炎作用[21]，因此可減少AGEs的生成。此外，2型糖尿病大鼠心肌GSSG/GSH、MDA水平顯著升高，說明心肌存在氧化應(yīng)激加劇的現(xiàn)象。運(yùn)動(dòng)降低了2型糖尿病大鼠心肌的氧化應(yīng)激水平，這可能與運(yùn)動(dòng)降低AGEs的生成和運(yùn)動(dòng)的抗氧化功能有關(guān)。

為了驗(yàn)證運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練降低 2型糖尿病大鼠心肌AGEs、氧化應(yīng)激與運(yùn)動(dòng)改善2型糖尿病大鼠心肌纖維化有關(guān)，本研究對(duì)大鼠心肌組織NF-κBp65蛋白的表達(dá)進(jìn)行了測(cè)試。p50/p65是NF-κB最常見的異源二聚體，細(xì)胞靜息狀態(tài)下，NF-κB與其抑制蛋白IκB(Inhibitor of NF-κB，IκB)結(jié)合以無活性的形式存在于胞漿中。當(dāng)細(xì)胞受到刺激時(shí)(如氧化應(yīng)激、細(xì)胞因子、細(xì)菌、病毒等)，蛋白激酶IκB (I kappa B kinase)的活性迅速升高，使抑制蛋白IκB依次發(fā)生磷酸化、泛素化和降解，從而使NF-κB以活性形式釋放，NF-κB轉(zhuǎn)位入核與靶基因啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)域的特定位點(diǎn)結(jié)合，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性[22]。機(jī)體內(nèi)抗氧化水平降低、氧化應(yīng)激的增強(qiáng)可升高NF-κB水平[23]，NF-κB的表達(dá)水平升高可增強(qiáng)受其調(diào)控的多種細(xì)胞因子基因表達(dá)[24-25]，如 TGFβ、TNF-α、IL-1 β、IL-6 等。通常這些細(xì)胞因子可使心肌纖維化、炎癥加重、細(xì)胞凋亡，心肌功能下降。在本研究中，糖尿病大鼠心肌NF-κB表達(dá)較正常對(duì)照組顯著提高，運(yùn)動(dòng)降低了糖尿病大鼠心肌NF-κB的表達(dá)水平，從而阻斷了NF-κB所誘導(dǎo)的細(xì)胞因子表達(dá)的反應(yīng)鏈。NF-κB是氧化應(yīng)激的下游分子，同時(shí)也是調(diào)節(jié)RAGE表達(dá)的一個(gè)啟動(dòng)子，它的激活可作為一種正反饋促進(jìn)AGEs和RAGE的結(jié)合[24]。因此NF-κB蛋白表達(dá)水平的降低，也反過來降低了AGEs/RAGE信號(hào)通路效應(yīng)。

總之，運(yùn)動(dòng)的降血糖、抗氧化作用降低了2型糖尿病大鼠心肌AGEs含量和氧化應(yīng)激水平。由于氧化應(yīng)激水平的降低，使對(duì)氧化還原反應(yīng)敏感的 NF-κB P65蛋白表達(dá)下降，并阻斷了NF-κB所誘導(dǎo)的細(xì)胞因子表達(dá)的反應(yīng)鏈，直接或間接起到了對(duì)心肌組織的保護(hù)作用，但是由于其作用機(jī)制復(fù)雜，具體的信號(hào)傳導(dǎo)通路有待于進(jìn)一步的研究。

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