ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子1 R219K基因多態(tài)性與腦梗死OCSP分型的關(guān)系

周中華， 肖志杰， 鄧 可， 潘金保， 張 詠， 王 鵬

隨著我國人口老齡化程度的逐步加深，腦血管疾病的發(fā)病率逐年升高，全國每年新發(fā)病例250萬，死于腦血管病超過150萬，幸存者600萬～700萬，殘疾率高達75%，目前腦血管病年增長率高達8.7%，中青年腦梗死的發(fā)病率也呈逐年升高趨勢［1，2］。腦梗死是腦血管疾病中最常見的類型，其發(fā)病率在腦血管病中高達60% ～80%［3］，腦梗死由于其高發(fā)病率，高致死率、高致殘率而給社會和家庭帶來沉重的負擔。動脈粥樣硬化性血栓性腦梗死是腦梗死中最常見的類型，其基本病因為動脈粥樣硬化。研究表明高密度脂蛋白-膽固醇(HDL-C)的高水平能防止動脈粥樣硬化從而減少腦血管病的發(fā)生［4，5］。臨床和動物實驗證實［6］，三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子A1(ABCA1)是在合成HDL-C的起始步驟中起重要作用的一類跨膜糖蛋白，在膽固醇代謝，清除組織內(nèi)過多膽固醇，抗動脈粥樣硬化等方面發(fā)揮決定性作用。ABCA1R219K是ABCA1基因的重要的單核苷酸多態(tài)性，研究［7］表明R219K可減輕冠狀動脈粥樣硬化的嚴重程度。同時有研究［8～11］表明，R129K的功能受到性別、年齡、種族、環(huán)境等多方面因素的影響。本實驗選取ABCA1 R219K基因多態(tài)性與腦梗死關(guān)系進行研究。腦梗死OCSP分型主要通過患者發(fā)病時的臨床表現(xiàn)進行分型，不依賴于影像學(xué)檢查，專業(yè)醫(yī)務(wù)人員之間診斷一致性高，本研究對ABCA1 R219K與中國湖南地區(qū)漢族人群血脂水平、不同OCSP分型腦梗死相關(guān)性進行病例對照研究。

1 資料和方法

1.1 研究對象 279例腦梗死患者來源于2001年2月～2002年11月在湘雅二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的腦卒中患者。腦梗死組包括部分前循環(huán)梗死173例，后循環(huán)梗死29例，腔隙性梗死77例，未收集到完全前循環(huán)梗死病例，其中男性162例，女性117例，平均年齡62.5±11.4歲。腦梗死患者均符合全國第四屆腦血管病會議修訂的腦梗死診斷標準［3］。351例正常對照組，為長沙市雨花區(qū)普查和同期門診體檢的非心腦血管疾病人群，其中男性201例，女性150例，平均年齡61.6±7.0歲。通過問卷訪談收集研究對象的基本資料。凡出現(xiàn)下列情況者予以剔除:伴隨腦出血、周圍血管疾病、大動脈炎、自身免疫疾病、明顯肺部感染、惡性腫瘤、嚴重肝腎功能不全、嚴重營養(yǎng)不良。

1.2 研究方法 采集清晨空腹靜脈血3～5ml，采用低滲溶血、三氯甲烷法抽提外周白細胞基因組DNA、用多聚酶鏈式反應(yīng)(PCR)和限制性片段長度多態(tài)性測定ABCA1 R219K基因多態(tài)性。引物由上海生工生物工程公司合成。上游引物:5’-GTATTTTTGCAAGGCTACCAGTTACATTTGACAA-3’，下游引物:5’-GATTGGCTTCAGGATGTCCATGTTGGAA-3’。10L PCR反應(yīng)體系含:基因組DNA 0.2～0.5g，上游和下游引物分別為10pmol/L，4 × dNTP 0.25mmol/L，Taq 酶 0.5U，10Taq 酶緩沖液 1L，MgCl22mmol/L。擴增條件:預(yù)變性94℃ 4min;反應(yīng)循環(huán):變性 94℃ 50s、退火 58℃ 50s、延伸 72℃ 1 min，循環(huán)32次;最后72℃延伸10min。限制性內(nèi)切酶消化反應(yīng)體系20L:PCR產(chǎn)物10L，EcoN1 3U，10 NEBuffer4(含BSA)2L，37℃消化6h。8%聚丙烯酰胺凝膠電泳，以 pUC19DNA/MspI酶解片斷作為DNA片斷的標準物，于恒壓(80V)下電泳2～3h。ABCA1 R219K產(chǎn)物片斷總長度為177bp，經(jīng)特異性限制內(nèi)切酶消化后，可出現(xiàn)3種片段大小的組合。分別為 RR:177bp;RK:177bp，107bp，70bp;KK:107bp，70bp(見圖1)。將RR型和KK型進行DNA序列測定。由測序圖譜(見圖2)可以看出，ABCA1的PCR擴增產(chǎn)物序列RR型中的堿基C(見圖2中箭頭所指)突變?yōu)镵K型中的T(見圖2中箭頭所指)，即互補鏈中的G突變?yōu)锳，相應(yīng)氨基酸編碼由AGG(精氨酸)變?yōu)锳AG(賴氨酸)。

1.3 血脂測定 采用酶法測定血清TC和TG;用磷鎢沉淀法測定HDL-C;LDL-C采用公式計算;圓周免疫法測定ApoA1和ApoB100;ELISA雙抗夾心法測定Lp(a)。

1.4 統(tǒng)計分析 應(yīng)用SPSS10.0軟件包進行統(tǒng)計分析。計量資料以χ±s表示，計數(shù)資料以百分比表示，先進行正態(tài)分布檢驗，偏態(tài)分布數(shù)據(jù)先行對數(shù)轉(zhuǎn)換，兩組間比較采用 t檢驗，2組以上采用One way ANOVA檢驗，用LSD方法進行兩兩比較。分類資料采用χ2檢驗。采用Logistic回歸模型評判腦梗死危險因素作用的大小，分別計算各自的比值比(OR)及其95%可信區(qū)間(CI)。

圖1 ABCA1 R219K PCR產(chǎn)物酶切片斷8%聚丙烯酰胺凝膠電泳譜

圖2 PCR產(chǎn)物測序圖譜

2 結(jié)果

2.1 腦梗死組與對照組一般資料比較 見表1。腦梗死組與對照組在性別、年齡、體重指數(shù)比較上，差異不顯著，無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。在腦梗死常見的危險因素如收縮壓、舒張壓、高血壓病史(率)、糖尿病史(率)、卒中家族史(率)、飲酒史(率)及吸煙史(率)上，腦梗死組比對照組明顯增高，差異顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 腦梗死組與對照組生化指標比較 見表2。腦梗死組 BS、TG、TC、LDL-C、CREA 的水平高于與對照組，差異顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，但CREA在正常范圍，無臨床意義;腦梗死組HDL-C水平顯著低于對照組，差異顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

2.3 OCSP各型腦梗死組與對照組的血脂比較 見表3。與對照組血脂水平比較，部分前循環(huán)梗死組、后循環(huán)梗死組及腔隙性梗死組的TG均高于對照組，差異性顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);OCSP各型梗死組HDL-C均低于對照組，差異顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。部分前循環(huán)梗死組的TG、LDL-C、ApoB高于對照組，ApoA-1低于對照組，差異顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);不同OCSP分型腦梗死組血脂間比較，部分前循環(huán)梗死組ApoB高于腔隙性梗死組，差異顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);其他各項血脂指標組間比較，差異不顯著，無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

2.4 腦梗死組與對照組ABCA1 R219K基因型的比較 見表4。腦梗死組RR型頻率高于對照組，差異不顯著，無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，腦梗死組與對照組ABCA1 R219K其余各基因型分布頻率比較，差異均不顯著，無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.5 ABCA1 R219K基因型對血脂和脂蛋白水平的影響 見表5。ABCA1 R219K各基因型組間TG、TC、HDL-C、LDL-C、ApoB、ApoA-1、LP(a)水平差異不顯著，無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，各基因型組兩兩比較顯示，KK基因型組的 TG、TC、HDL-C和ApoA-1水平均高于RK和RR基因型組，更進一步比較，KK基因型組的TG水平高于RR基因型組，差異顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，KK基因型組的TC、HDL-C、ApoA-1水平均高于RK基因型組，差異顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.6 ABCA1 R219K基因型與腦梗死OCSP分型比較 見表6。腦梗死各OCSP分型(未收集到全前循環(huán)梗死病例)的ABCA1 R219K基因型比較，差異不顯著，無統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 腦梗死組與對照組一般臨床資料比較

表2 腦梗死組與對照組生化指標比較(χ±s)

表3 OCSP各型腦梗死與對照組的血脂比較

表4 腦梗死組與對照組ABCA1 R219K基因型的比較

表5 ABCA1 R219K基因型對血脂和脂蛋白水平的影響

表6 ABCA1 R219K基因型與腦梗死OCSP分型比較

3 討論

腦梗死發(fā)病的基本病理基礎(chǔ)是動脈粥樣硬化及斑塊形成，動脈粥樣硬化的重要危險因素是血脂代謝失衡［12］和炎癥反應(yīng)［13，14］。目前公認的脂蛋白滯留-應(yīng)答學(xué)說［15］進一步闡明了脂質(zhì)異常導(dǎo)致動脈粥樣硬化的病理過程，HDL-C被認為是一種抗動脈粥樣硬化的脂蛋白，其水平的高低反映了機體逆向轉(zhuǎn)運膽固醇的能力。HDL-C水平越高，動脈血管壁等外周組織膽固醇蓄積的可能性越小，血管壁硬化程度越低。研究證實［6］ABCA1促進細胞內(nèi)游離膽固醇和磷脂(主要是卵磷脂)向貧脂或無脂的HDL-C前體載脂蛋白A1(ApoA1)轉(zhuǎn)移，啟動HDL-C的生成，從而在膽固醇代謝，清除組織內(nèi)過多膽固醇，抗動脈粥樣硬化等方面發(fā)揮決定性作用。Laloux等［16］的研究結(jié)果表明高甘油三酯血癥在腦梗死各個亞型中均普遍存在，Tobias等人進行一項大型前瞻性隊列研究［17］表明腦梗死組HDL-C水平顯著低于對照組，研究發(fā)現(xiàn)白種人的ABCA1 R219K基因突變率超過40%，HDL-C水平升高明顯，從而減慢動脈粥樣硬化的發(fā)展［9］。本研究資料表明腦梗死組患者血脂中甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇的水平高于對照組，對照組HDL-C水平高于腦梗死各OCSP分型組(本研究未收集到完全前循環(huán)梗死病例)，差異顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義，其結(jié)果與上述研究結(jié)果相符，提示血脂異常者罹患腦梗死的風(fēng)險明顯增高。HDL-C可能是腦梗死的保護性因素。

大多數(shù)研究［18～20］表明 ABCA1 R219K K 等位基因在降低甘油三酯的水平、升高HDL-C水平和產(chǎn)生有益的臨床血脂譜方面起重要作用，從而能減緩動脈粥樣硬化的嚴重程度，RR基因型血清中的有較高的甘油三酯水平和較低的HDL-C水平，Clee等［21］的研究表明K等位基因能降低冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的患病風(fēng)險，K等位基因可作為動脈粥樣硬化的單獨保護因素，然而Takagi等［8］的研究結(jié)果卻不支持以上結(jié)論，他們認為R219K與血漿HDL-C水平及動脈粥樣硬化的形成無明顯相關(guān)。我們的研究發(fā)現(xiàn)KK型分子個體血脂水平均高于RK型和RR型，其中KK型分子個體的TG高于RR型，KK型分子個體的TC、HDL-C、ApoA-1高于 RK型，差異顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而其他血脂水平比較各基因型間比較均無顯著性差異。

ABCA1 R219K基因多態(tài)性與冠心病的相關(guān)性研究在國內(nèi)外不同人種中陸續(xù)有報道，但對于ABCA1 R219K與腦梗死關(guān)系的研究報導(dǎo)較少。多數(shù)研究認為K等位基因能減少冠心病的發(fā)病，但有研究［22］卻表明R等位基因與冠心病獨立相關(guān)。有研究報道［23］K等位基因是腦梗死的獨立保護因素。然而一項針［24］對英國人群中ABCA1 R219K基因多態(tài)性與缺血性卒中的研究表明兩者無明顯相關(guān)。我們研究發(fā)現(xiàn)腦梗死組RR型頻率高于對照組，但差異無顯著意義，腦梗死組與對照組ABCA1 R219K其余各基因型分布頻率比較，差異均不顯著，無統(tǒng)計學(xué)意義，提示ABCA1 R219K基因多態(tài)性與腦梗死無顯著相關(guān)性;根據(jù)OCSP分型，通過對腦梗死分層分析后發(fā)現(xiàn)，不同OCSP分型腦梗死的R219K基因型比較，差異無顯著意義，提示ABCA1 R219K基因多態(tài)性與腦梗死不同OCSP分型無顯著相關(guān)性。以上不同的研究結(jié)果可能與ABCA1 R219K的變異因種族、年齡、性別和環(huán)境不同而對腦梗死產(chǎn)生不同影響有關(guān)。

本實驗因未收集到完全前循環(huán)梗死病例，分析原因考慮與該型患者較其他各型發(fā)病率少，且因病情過于危重采取就地醫(yī)治有關(guān)，本實驗并未嚴格匹配血壓、吸煙、飲食等混雜因素，因此有必要對以上混雜因素進行更嚴格的配比，擴大研究例數(shù)在不同人種中進行研究，并對ABCA1基因其它單核苷酸多態(tài)性與腦梗死TOAST分型等其他腦梗死分型的關(guān)系做進一步研究。

［1］柴 軍，張麗云，賈 頤，等.中青年腦梗死病因及危險因素分析［J］.吉林醫(yī)學(xué)，2011，32(5):925.

［2］林鑫江，杜登青，莊偉端，等.青年腦梗死TOAST分型及危險因素分析［J］.中華全科醫(yī)學(xué)，2012，10(5):686-687.

［3］饒明俐.中國腦血管病防治指南［M］.北京:衛(wèi)生部疾病控制司，中華醫(yī)學(xué)會神經(jīng)病學(xué)分會制定，2004.114.

［4］Koren-Morag N，Tanne D，Graff E，et al.Low-and high-density lipoprotein cholesterol and ischemic cerebrovascular disease:the bezafibrate infarction prevention registry［J］.Arch Intern Med，2002，162:993-9.

［5］Sacco RL，Benson RT，Kargman DE，et al.High-density lipoprotein cholesterol and ischemicstroke in the elderly:the Northern Manhattan Stroke Study［J］.JAMA，2001，285:2729-2735.

［6］Zarubica A，Trompier D，Chimini G.ABCA1，from pathology to membrane function［J］.Pflugers Arch，2007，453(5):569-579.

［7］肖志杰，趙水平，聶 賽，等.ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子1基因多態(tài)性與腦梗死的關(guān)系［J］.中華神經(jīng)科雜志，2004，37:516-520.

［8］Takagi S，Iwai N，Miyazaki S，et al.Relationship between ABCA1 genetic variation and HDL cholesterol level in subjects with ischemic heart diseases in Japanese［J］.Thromb Haemost，2002，88:369-370.

［9］Brousseau ME，Bodzioch M，Schaefer EJ，et al.Common variants in the gene encoding ATP-binding cassette transporter 1 in men with low HDL cholesterol levels and coronary heart disease［J］.Atherosclerosis，2001，154:607-611.

［10］Pasdar A，Yadegarfar G，Cumming A，et al.The effect of ABCA1 gene polymorphisms on ischaemic stroke risk and relationship with lipid profile［J］.BMC Med Genet，2007，8:30.

［11］Ma XY，Liu JP，Song ZY.Associations of the ATP-binding cassette transporter A1 R219K polymorphism with HDL-C level and coronary artery disease risk:a meta-analysis［J］.Atherosclerosis，2011，215:428-434.

［12］Nordestgaard BG，Zacho J.Lipids，atherosclerosis and CVD risk:is CRP an innocent bystander［J］.Nutr Metab Cardiovasc Dis，2009，19(8):521-524.

［13］Libby P，Okamoto Y，Rocha VZ，et al.Inflammation in atherosclerosis:transition from theory to practice［J］.Circ J，2010，74(2):213-220.

［14］Orr AW，Hastings NE，Blackman BR，et al.Complex regulation and function of the inflammatory smooth muscle cell phenotype in atherosclerosis［J］.JVasc Res，2010，47(2):168-180.

［15］Tabas I，Williams KJ，Boren J.Subendothe lial lipoprote in retention as the initia ting pro cess in a the rosc leros is:update and therapeutic implica tions［J］.J Circulation，2007，116(16):1 832-844.

［16］Laloux P，Galanti L，Jamart J.Lipids in ischemic stroke subtypes［J］.Acta Neurol Belg，2004，104(1):13.

［17］Tobias K，Brendan M，Julie E，et al.Lipid level and the risk of ischemic stroke in women［J］.Neurology，2007，68(8):556-562.

［18］Andrikovics H，Pongracz E，Kalina E，et al.Decreased frequencies of ABCA1 polymorphisms R219K and V771M in Hungarian patients with cerebrovascular and cardiovascular diseases［J］.Cerebrovasc Dis，2006，21:254-259.

［19］Bertolini S，Pisciotta L，Di Scala L，et al.Genetic polymorphisms affecting the phenotypic expression of familial hypercholesterolemia［J］.Atherosclerosis，2004，174:57-65.

［20］Wang N，Xue XH，Lin Y，et al.The R219K polymorphism in the ATP-binding cassette transporter 1 gene has a protective effect on atherothrombotic cerebral infarction in Chinese Han ethnic population［J］.Neurobiol Aging，2010，31:647-653.

［21］Clee SM，Zwinderman AH，Engert JC，et al.Common genetic variation in ABCA1 is associated with altered lipoprotein levels and a modified risk for coronary artery disease［J］.Circulation，2001，103:1198-1205.

［22］Tan JH，Low PS，Tan YS，et al.ABCA1 gene polymorphisms and their associations with coronary artery disease and plasma lipids in males from three ethnic populations in Singapore［J］.Hum Genet，2003，113:106-117.

［23］Cenarro A，Artieda M，Castillo S，et al.A common variant in the ABCA1 gene is associated with a lower risk for premature coronary heart disease in familial hypercholesterolaemia［J］.J Med Genet，2003，40:163-168.

［24］Singaraja RR，Brunham LR，Visscher H，et al.Efflux and atherosclerosis:the clinical and biochemical impact of variations in the ABCA I gene［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2003，23:1322-1332.