富血小板血漿對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞定向分化的影響

杜 剛，黃 克，李 林，梁紅鎖，唐 俊，李紅波(廣西醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院骨一科，530031;通訊作者，E-mail:huangke_gx@126.com)

利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)聯(lián)合骨組織工程學(xué)方法進(jìn)行修復(fù)是當(dāng)前骨缺損研究的熱點(diǎn)［1］。BMSCs具有易體外獲得、體外擴(kuò)增速度快、較弱的免疫原性以及較強(qiáng)的組織修復(fù)能力等特點(diǎn)，可作為具有重要應(yīng)用價值的種子細(xì)胞［2］。

富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)是通過離心自體全血所得到的血小板濃縮物，血小板被激活后可釋放出多種生長因子促進(jìn)骨再生，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化、趨化以及促進(jìn)血管生成等多種生物活性［3］。利用PRP促進(jìn)骨再生、修復(fù)骨缺損是骨修復(fù)研究的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)探索PRP對體外分離的兔BMSCs誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞的作用機(jī)制，并評估其促進(jìn)骨組織再生的效果。

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑與儀器 L-DMEM培養(yǎng)基(Gibico公司)、F12-DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清(Hyclone公司)、Ficoll淋巴細(xì)胞分離液(TBD，比重1.077 g/L)、CD34-PE和 CD45-PE抗體(Santa Cruz公司)、CD105-FITC抗體(BD公司)、Trizol(Invitrogen公司)、M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega公司)、流式細(xì)胞儀(Calibur，BD公司)及細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo公司)，兔OCN ELISA檢測試劑盒(westang公司)，兔CTGF ELISA檢測試劑盒(Bio Ripid公司)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物 普通級健康新西蘭大耳白兔10只，雌性，兔齡約為3個月，體重1.5－2 kg，購自山東省農(nóng)科院提供，許可證號:SCXK［魯］20040013。

1.2 方法

1.2.1 兔來源骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的獲取 3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)對兔耳緣靜脈麻醉，穿刺股骨髁突，在無菌條件下采集兔紅骨髓3 ml，加入1.077 g/L Ficoll分離液3 ml至華氏管中，4℃，3 000 r/min，離心30 min，棄上清，吸中間乳白色樣單核細(xì)胞，培養(yǎng)基重懸后1 000 r/min，離心5 min，棄上清，重懸于含10%FBS的F12-DMEM培養(yǎng)液中，按1×105/ml接種六孔板3 ml，37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱孵育48 h后全量換液，此后每周兩次全量換液，待細(xì)胞生長至培養(yǎng)板的80%－90%時進(jìn)行消化傳代、凍存。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表型用胰蛋白酶分別消化BMSCs，分別加入下列鼠抗兔單克隆抗體:CD34-PE，CD45-PE，CD105-FITC，使用直接法標(biāo)記 CD34和 CD45，使用間接法標(biāo)記CD105，4℃孵育30 min，PBS洗2遍，流式細(xì)胞儀檢測BMSCs細(xì)胞表面抗原。

1.2.3 獲取兔血小板血漿并濃縮成指定體積分?jǐn)?shù)3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)對兔耳緣靜脈麻醉，抽取靜脈10 ml血液，搖勻后置于離心管中，以1 000 r/min的速度離心15 min，吸取全部上清液及交界面下1－2 mm的紅細(xì)胞至另一個離心管，再以3 000 r/min的速度離心8 min。棄上清液上3/4，輕輕振蕩，獲取血小板血漿。將血小板血漿與激活劑(牛凝血酶及10%的氯化鈣混合物)以9∶1的比例混合、振蕩，4℃冰箱過夜。待血凝塊充分收縮后，重離心10 min，吸取富含復(fù)合生長因子的血小板血漿上清液，加入含100 U/ml青霉素、100 mg/L鏈霉素的無血清L-DMEM培養(yǎng)基，分別稀釋成5%和10%兩個體積梯度備用。

1.2.4 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成骨細(xì)胞 將BMSCs細(xì)胞以1×106/孔接種于6孔板中，陰性對照組中加入200 μl的L-DMEM培養(yǎng)液，陽性對照組加入 200 μl的 L-DMEM 培養(yǎng)液(含終濃度0.1 μmol/L地塞米松，終濃度0.05 mmol/L抗壞血酸磷酸鹽，終濃度10 mmol/L甘油磷酸鈉，實(shí)驗(yàn)組中分別加入200 μl含5%和10%PRP的L-DMEM培養(yǎng)液，建立起B(yǎng)MSCs與PRP的共培養(yǎng)體系，置37℃ 5%CO2孵箱中培養(yǎng)，每3 d按照上述步驟更換培養(yǎng)液。

1.2.5 礦化結(jié)節(jié)染色 在共培養(yǎng)21 d后，吸除培養(yǎng)基，將細(xì)胞PBS漂洗2次，95%乙醇，4℃固定10 min，三蒸水漂洗3次，加入0.1% 茜素紅，37℃染色30 min，三蒸水漂洗，倒置相差顯微鏡觀察，以Image-Pro Plus 5.0圖像分析軟件測取每個視野下的鈣結(jié)節(jié)面積并以總像素?cái)?shù)作為量化指標(biāo)。

1.2.6 堿性磷酸酶活性試驗(yàn) 在共培養(yǎng)21 d后，吸除培養(yǎng)基，將細(xì)胞PBS漂洗2次，裂解，加入含0.1%TritonX-100、2 mmol/L MgSO4、含 6 mmol/L PNPP 的0.1 mol/L NaHCO3– Na2CO3緩沖液(pH 10.0)，37℃孵育30 min后加入1 mol/L的NaOH終止反應(yīng)，以O(shè)D405nm/OD550nm計(jì)算各組細(xì)胞ALP活性。

1.2.7 ELISA法檢測結(jié)締組織生長因子(CTGF)以及骨鈣素(OCN)的含量 在共培養(yǎng)21 d后，直接吸取細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞的CTGF以及OCN含量測定，具體操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行，采用雙抗夾心ELISA法，于490 nm波長檢測各孔OD值，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品OD值計(jì)算其濃度，將含5%和10%PRP的L-DMEM培養(yǎng)液作為對照，排除PRP中CTGF和OCN對結(jié)果的干擾。

1.2.8 RT-PCR 法檢測成骨相關(guān)基因 CTGF、ALP、Cbf-α1、Col-Ⅰ和OCN mRNA表達(dá) 在共培養(yǎng)21 d后，取細(xì)胞按Trizol說明書提取總RNA，取2 μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，引物序列見表1。PCR反應(yīng)條件:95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃30 s，72 ℃ 40 s，35個循環(huán)，72℃ 延伸10 min。實(shí)驗(yàn)在熒光定量PCR儀ABI7500上進(jìn)行，GAPDH 作為內(nèi)參照，2－△△Ct法分析基因相對表達(dá)量。

表1 成骨相關(guān)基因引物序列Table 1 Primer sequences of osteoblast-related genes

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定

分離培養(yǎng)的BMSCs均一性達(dá)到95%以上(見圖1)，膜抗原CD34及CD45呈陰性表達(dá)，CD105呈陽性表達(dá)(見圖2)。

圖1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)學(xué) (×100)Figure 1 Morphology of cultured BMSCs (×100)

2.2 富血小板血漿對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞過程中礦化情況的影響

通過Image-Pro Plus 5.0圖像分析軟件測取每個視野下的鈣結(jié)節(jié)面積并以總像素?cái)?shù)作為量化指標(biāo)，礦化結(jié)節(jié)染色結(jié)果顯示，終濃度0.1 μmol/L地塞米松可誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在分化為成骨細(xì)胞過程中產(chǎn)生礦化結(jié)節(jié)，5%PRP組茜素紅染色陽性率為28.6%，10%PRP組茜素紅染色陽性率為52.8%，顯著高于陰性對照組，證明PRP與BMSCs共培養(yǎng)可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞，10%PRP組茜素紅染色陽性率顯著高于5%PRP 組(P＜0.05，圖3)。

圖2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定Figure 2 Identification of BMSCs by flow cytometry

圖3 富血小板血漿對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)染色的影響Figure 3 The effect of PRP on mineralized nodules staining of BMSCs differentiation into osteoblasts

2.3 富血小板血漿對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞過程中堿性磷酸酶活性的影響

堿性磷酸酶活性試驗(yàn)結(jié)果顯示，終濃度0.1 μmol/L地塞米松可誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在分化為成骨細(xì)胞過程中堿性磷酸酶活性升高，與陰性對照組相比，5%和10%PRP組堿性磷酸酶活性顯著升高(P＜0.05)，證明PRP與BMSCs共培養(yǎng)可上調(diào)堿性磷酸酶活性，促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞。10%PRP組堿性磷酸酶活性顯著高于5%PRP組(P＜0.05，見圖4)。

2.4 富血小板血漿對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞過程中CTGF以及OCN含量的影響

ELISA試驗(yàn)結(jié)果顯示，終濃度0.1 μmol/L地塞米松可誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在分化為成骨細(xì)胞過程中CTGF以及OCN含量升高，與陰性對照組相比，5%和10%PRP組CTGF以及OCN含量顯著升高(P＜0.05)，證明PRP與BMSCs共培養(yǎng)可上調(diào)CTGF以及OCN含量，促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞，10%PRP組CTGF以及OCN含量顯著高于5%PRP組(P＜0.05，見圖5)。

圖4 富血小板血漿對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞過程中堿性磷酸酶活性的影響Figure 4 The effect of PRP on ALP activity in BMSCs differentiation into osteoblasts

2.5 富血小板血漿對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞過程中成骨相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

Real time-PCR試驗(yàn)結(jié)果顯示，終濃度 0.1 μmol/L地塞米松可誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在分化為成骨細(xì)胞過程中 CTGF、ALP、Cbf-α1、Col-Ⅰ和OCN mRNA表達(dá)升高，與陰性對照組相比，5%和10%PRP 組成骨相關(guān)基因 CTGF、ALP、Cbf-α1、Col-Ⅰ和OCNmRNA表達(dá)顯著升高(P＜0.05)，證明PRP與BMSCs共培養(yǎng)可上調(diào)成骨相關(guān)基因表達(dá)，促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞，10%PRP組上述基因mRNA表達(dá)顯著高于5%PRP組(P＜0.05，見圖6)

圖5 富血小板血漿對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞過程中CTGF以及OCN含量的影響Figure 5 The effect of PRP on CTGF and OCN content in BMSCs differentiation into osteoblasts

圖6 富血小板血漿對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞過程中CTGF、ALP、Cbf-α1、Col-Ⅰ和 OCN mRNA 表達(dá)的影響Figure 6 The effect of PRP on mRNA expression of CTGF，ALP，Cbf-α1，Col-Ⅰ and OCN in BMSCs differentiation into osteoblasts.

3 討論

BMSCs由于來源廣泛、易于獲取、擴(kuò)增穩(wěn)定、具有多向分化潛能、在不同誘導(dǎo)條件下能發(fā)生表型轉(zhuǎn)化等特點(diǎn)，已經(jīng)成為組織工程中備受矚目的種子細(xì)胞，也是近年來的研究熱點(diǎn)［4］。已有研究表明，富血小板血漿(PRP)可促進(jìn)BMSCs成骨分化，本文對其機(jī)制進(jìn)行深入探討。

BMSCs成骨分化有以下幾個階段:分化增殖期，以DNA復(fù)制、組蛋白合成為特征;基質(zhì)形成、成熟期，以ALP活性升高、Col-Ⅰ分泌為特征;基質(zhì)鈣化期，以O(shè)CN分泌、鈣離子沉積為特征，同時ALP活性持續(xù)升高。

核心結(jié)合因子α1(core-binding factor alpha 1，Cbf-α1)是成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可激活骨鈣素表達(dá)，調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的成骨速率，并調(diào)控ALP、Col-Ⅰ和OCN等下游分子啟動子活性，是骨骼發(fā)育的決定性基因［5］。堿性磷酸酶(alkaliphosphatase，ALP)由成骨細(xì)胞基質(zhì)小泡釋放，其活性可反映成骨誘導(dǎo)效果，并促進(jìn)細(xì)胞基質(zhì)鈣化［6］;Col-Ⅰ主要功能是可作為組織支持物，誘導(dǎo)礦物質(zhì)沉積，促進(jìn)成骨細(xì)胞吸附、礦物質(zhì)沉積，促進(jìn)礦化過程 ;OCN也稱骨γ－羧基谷氨酸蛋白，是由成骨細(xì)胞特異合成與分泌的一種非膠原蛋白，具有募集、趨化和激活骨吸收細(xì)胞，調(diào)節(jié)骨吸收的作用［8］;CTGF是一種分泌蛋白，可以促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、增加Col-Ⅰ表達(dá)，升高堿性磷酸酶活性以及促進(jìn)鈣鹽沉積［9］。因此，Cbf-α1、ALP、Col-Ⅰ、OCN 以及礦化結(jié)節(jié)的形成既是成骨細(xì)胞的表型特征，也是代表成骨細(xì)胞分化的經(jīng)典標(biāo)志物，表達(dá)越高，說明成骨細(xì)胞分化越明顯［10］。

目前研究多應(yīng)用地塞米松及成骨性添加劑在體外誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞分化，表現(xiàn)出較高的誘導(dǎo)分化能力，已被嘗試應(yīng)用于鼠、兔、羊和狗等動物的骨缺損修復(fù)，但是由于其大量應(yīng)用可能會對機(jī)體造成潛在危害［11］，因此我們期望尋找一種來源于機(jī)體自身的生物材料誘導(dǎo)BMSCs成骨分化。富血小板血漿含有豐富的細(xì)胞因子，可加速骨沉積速度并提高骨生成質(zhì)量，可用于治療種植體周圍骨缺損。因此我們認(rèn)為，富血小板血漿含有多種生長因子，可以在共培養(yǎng)過程中模擬成骨微環(huán)境，促進(jìn)BMSCs成骨分化［12］。本研究通過茜素紅礦化結(jié)節(jié)染色試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)PRP可有效誘導(dǎo)BMSCs定向分化為成骨細(xì)胞，促進(jìn)ALP、Cbf-α1、Col-Ⅰ、OCN 以及 CTGF 表達(dá)增加及礦化結(jié)節(jié)的形成，且10%PRP誘導(dǎo)效果優(yōu)于5%PRP。因此我們認(rèn)為，PRP可刺激 BMSCs分泌CTGF，上調(diào) ALP、Cbf-α1、Col-Ⅰ、OCN 表達(dá)，從而誘導(dǎo) BMSCs 向成骨方向分化，并且其成骨分化能力與PRP濃度有密切關(guān)系。因此，富血小板血漿可有效地誘導(dǎo)兔源骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的定向分化為成骨細(xì)胞，以上結(jié)果可為骨損傷修復(fù)的研究進(jìn)一步提供理論依據(jù)。但是，BMSCs成骨的基礎(chǔ)研究與臨床應(yīng)用還有一段距離，需要解決許多難題，BMSCs分化及其定向誘導(dǎo)分化的機(jī)制有待進(jìn)一步闡明，潛在的危險性有待進(jìn)一步評價等，需要在今后的研究中逐步解決。

［1］ 周游，曾勇李，李新志.干細(xì)胞在骨科中應(yīng)用的研究進(jìn)展［J］.中國矯形外科雜志，2011，19(14):1185－1187.

［2］ Yazdani SO，Pedram M，Hafizi M，et al.A comparison between neurally induced bone marrow derived mesenchymal stem cells and olfactory ensheathing glial cells to repair spinal cord injuries in rat［J］.Tissue Cell，2012，44(4):205－213.

［3］ Pieri F，Lucarelli E，Corinaldesi G，et al.Effect of mesenchymal stem cells and platelet-rich plasma on the healing of standardized bone defects in the alveolar ridge:a comparative histomorphometric study in minipigs［J］.J Oral Maxillofac Surg，2009，67(2):265－272.

［4］ 徐佳元，楊衛(wèi)良.干細(xì)胞在軟骨組織工程中的研究現(xiàn)狀及進(jìn)展［J］.中國矯形外科雜志，2011，19(21):1803－1806.

［5］ Huang J，Deng F，Wang L，et al.Hypoxia induces osteogenesis-related activities and expression of core binding factor α1 in mesenchymal stem cells［J］.Tohoku J Exp Med，2011，224(1):7－12

［6］ Liu J，Chen W，Zhao Z，et al.Reprogramming of mesenchymal stem cells derived from iPSCs seeded on biofunctionalized calcium phosphate scaffold for bone engineering［J］.Biomaterials，2013，34(32):7862－72.

［7］ Yan X，Yan X，Morrison A，et al.Fluoride induces apoptosis and alters collagen I expression in rat osteoblasts［J］.Toxicol Lett，2011，200(3):133－138.

［8］ Fei L，Wang C，Xue Y，et al.Osteogenic differentiation of osteoblasts induced by calcium silicate and calcium silicate/β-tricalcium phosphate composite bioceramics［J］.J Biomed Mater Res B Appl Biomater，2012，100(5):1237－1244.

［9］ Smerdel-Ramoya A，Zanotti S，Canalis E.Connective tissue growth factor(CTGF)transactivates nuclear factor of activated T-cells(NFAT)in cells of the osteoblastic lineage［J］.J Cell Biochem，2010，110(2):477－483.

［10］ Kalinina NI，Sysoeva VY，Rubina KA，et al.Mesenchymal stem cells in tissue growth and repair［J］.Acta Naturae，2011，3(4):30－37.

［11］ Steiner D，Lampert F，Stark GB，et al.Effects of endothelial cells on proliferation and survival of human mesenchymal stem cells and primary osteoblasts［J］.J Orthop Res，2012，30(10):1682－1689.

［12］ Shen Y，Nilsson SK.Bone，microenvironment and hematopoiesis［J］.Curr Opin Hematol，2012，19(4):250－255.