分子印跡技術(shù)在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域中的研究進(jìn)展

高楊菲，化占勇，沈利明

（江蘇省吳江市農(nóng)業(yè)委員會(huì)，江蘇 吳江 215200）

隨著全球經(jīng)濟(jì)一體化和食品貿(mào)易國(guó)際化發(fā)展，食品安全問(wèn)題已成為全世界關(guān)注的熱點(diǎn)。近年來(lái)，我國(guó)的食品安全問(wèn)題頻發(fā)，對(duì) 環(huán)境和人類造成危害，這對(duì)食品安全檢測(cè)水平和技術(shù)提出了挑戰(zhàn)。目前應(yīng) 用于食品安全檢測(cè)的技術(shù)手段或方法主要有：色譜 法、酶法、免疫法、傳感器法和生物檢測(cè)方法等，這些方法都需要對(duì)樣品進(jìn)行前處理，去 除干擾雜質(zhì)； 但在樣品量大，成分復(fù)雜的情況下上述方法不適宜 現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，而且存在檢測(cè)成本高，檢測(cè)重現(xiàn)性 不好等問(wèn)題。研發(fā)更為快速、準(zhǔn)確、靈敏的檢測(cè)方法已經(jīng)變得迫切需要。在此背景下，許多學(xué)者積極 開(kāi)發(fā)新的檢測(cè)技術(shù)或待檢樣品分離技術(shù)，分子印跡 技術(shù)(molecularly imprinting technology,MIT)應(yīng)運(yùn)而 生。該技術(shù)是一種新型高效分離及分子識(shí)別技術(shù)，由于其具有優(yōu)越的識(shí)別性和選擇性，在食品安全檢 測(cè)中發(fā)揮著重要的作用。

1 分子印跡技術(shù)

分子印記技術(shù)源于1940年P(guān)auling[1]在免疫學(xué)研 究中提出的抗體形成學(xué)說(shuō)，即用抗原作為模板來(lái)鑄 造對(duì)應(yīng)抗體空間結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合理論。到1973年，Wulf等[2]成功發(fā)展了用于色譜手性拆分印記聚合 物。分子印跡的基本原理是[3]：在目標(biāo)底物的存在下，充當(dāng)分子模板的印記分子與功能性單體混合，在一定的溶液中利用交聯(lián)劑與功能性單體聚合，從 而在模板分子周?chē)紦?jù)著高度交聯(lián)的聚合結(jié)構(gòu)；隨 后印記分子移去，暴露出一個(gè)相對(duì)于模板分子空間 構(gòu)型相互匹配的具有多重作用點(diǎn)的空穴，此空穴與 印記分子在形狀、大小等方面具有良好的互補(bǔ)性，因而這種聚合物具有特異性識(shí)別印記分子的功能。

近幾年發(fā)展起來(lái)的分子印記技術(shù)[4]所得到的模 擬生物聚合物(MIPs)與生物識(shí)別元件(如酶、抗體、核酸等)相比具有很多優(yōu)點(diǎn)：(1)MIPs的穩(wěn)定性好，能反復(fù)使用50次以上；在室溫干燥環(huán)境中可保存數(shù)年，水中保存4周以上不會(huì)影響其性質(zhì)；用酸性、堿 性、金屬離子和其它多種溶液處理時(shí)不會(huì)降低其識(shí) 別特性；能耐受一定的機(jī)械強(qiáng)度、高溫及高壓。(2)MIPs具有很高的選擇性，它對(duì)印記分子而言是“量身定做”的，而且理論上任何一個(gè)分子均可制 備相應(yīng)的MIPs[5]。(3)生物識(shí)別元件來(lái)自于生物源，在生產(chǎn)過(guò)程中往往要使用動(dòng)物，而分子印記技術(shù)完 全是化學(xué)合成過(guò)程。(4)生物分子識(shí)別系統(tǒng)不易建立 批量生產(chǎn)工藝，所以價(jià)格昂貴，而MIPs則費(fèi)用低，對(duì)于某些小分子化合物如藥物來(lái)說(shuō)，制備其MIPs相 當(dāng)簡(jiǎn)單省時(shí)，容易建立大規(guī)模生產(chǎn)[6]。

1.1 分子印跡技術(shù)的原理和方法

分子印記技術(shù)的原理：(1)功能單體與目標(biāo)分子的功能基團(tuán)在適當(dāng)?shù)臈l件下可逆結(jié)合，形 成復(fù)合物；(2)加入交聯(lián)劑，使其與功能單體聚合，形成的聚合 物將目標(biāo)分子包埋在內(nèi)；(3)用一定的物理和化學(xué)方法，將模板分子(即目標(biāo)分子)從聚合物中洗脫，以獲得具有識(shí)別功能并與之相匹配的三維空穴。這樣，可以再次選擇性地與模板分子結(jié)合，從而具有專一識(shí)別模板分子的功能[7]。過(guò)程如圖1所示[8]。

圖1 分子印跡聚合物的制備流程

迄今為止，分子印記技術(shù)主要有兩種：（1）共價(jià)鍵法（預(yù)組裝）共價(jià)鍵法是由Wulff等人創(chuàng)立 發(fā)展起來(lái)的。該方法中印記分子(目標(biāo)分子)和功能 單體以共價(jià)鍵的形式結(jié)合生成印記分子的衍生物，該聚合物進(jìn)一步在化學(xué)條件下打開(kāi)共價(jià)鍵使印記分子脫離。功能單體一般采用小分子化合物。共價(jià)鍵 結(jié)合作用包括硼酸酯、西佛堿、縮醛(酮)、酯、螯 合鍵作用等。共價(jià)鍵法主要應(yīng)用于制備各種具有特 異識(shí)別功能的聚合物，如糖類及其衍生物、甘油酸 及其衍生物、氨基酸及其衍生物、扁桃酸、芳香酮、二醛、三醛、鐵轉(zhuǎn)移蛋白、聯(lián)輔酶及甾醇類物質(zhì)[9]。（2）非共價(jià)鍵法（自組織法）非共價(jià)鍵法是由Mosbach等[10]發(fā)展起來(lái)的。即把適當(dāng)比例的印記分子與功能單體和交聯(lián)劑混合，通過(guò)非共價(jià)鍵結(jié)合在一起生成非共價(jià)鍵印記分子聚合物。這些非共價(jià)鍵 包括氫鍵、靜電引力、金屬螯合作用、電荷轉(zhuǎn)移、疏水作用以及范德華力等。此法主要應(yīng)用于下列物 質(zhì)的分離中：染料、二胺、維生素、氨基酸衍生物、多肽、腎上腺素功能藥物阻抑劑、茶堿、二氮雜苯、核苷酸堿基、非甾醇類抗感染藥萊普生和芐胺等。

共價(jià)鍵法和非共價(jià)鍵法的主要區(qū)別在于單體與 模板分子的結(jié)合機(jī)理不同[11](圖2)。

1.2 分子模擬在分子印跡技術(shù)中的應(yīng)用

隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)和量子化學(xué)理論的發(fā)展，分子 模擬的方法已被用于解釋分子印跡聚合物的分子識(shí) 別的機(jī)理、選擇功能單體、確定模板分子與功能單 體的比例和優(yōu)化分子印跡的體系等。

1.2.1 解釋聚合物識(shí)別機(jī)理 Wulff[12]利用MolCAD 1.0 分別計(jì)算以α-D-甘露吡喃糖苯苷為 模板，4-乙烯基苯硼酸為功能單體的共價(jià)型分子印 跡聚合物和以L-苯丙氨基酰替苯胺為模板，α-甲基 苯烯酸為功能單體的非共價(jià)型分子印跡聚合物的模 板-功能單體復(fù)合物的靜電勢(shì)能面，并 且認(rèn)為靜電勢(shì) 能面可以很好地并且直觀地描述分子印跡聚合物中對(duì)模板分子具有特異性識(shí)別作用的孔穴，且孔穴的大小與模板分子的大小在同一個(gè)數(shù)量級(jí)。

1.2.2 證實(shí)和預(yù)測(cè)功能單體與模板分子之間相互作用力Takeuehi等[13]用Monte Carlo構(gòu)象搜索的方法，找到了在以生物素甲酯為模板的預(yù)組裝溶液中 可能存在的模板-功能單體復(fù)合物的構(gòu)象，從 構(gòu)象圖 中可以清楚地看到模板-功能單體之間氫鍵相互作 用的情況。李 萍[14]等 用Hypeehem軟件模擬了以右旋 鄰氯扁桃酸為模板，以丙烯酰胺為功能單體的分子 印跡預(yù)聚合物。2005年Dumitru等[15]用state-of-the-art工具篩選功能單體制備茶堿及其衍生物的分子 印跡聚合物。后 來(lái)，D umitru等[16]用模擬的方法發(fā)現(xiàn) 靜電力在分子印跡聚合物聚合過(guò)程中扮演重要的角 色。

圖2 分子印跡聚合物共價(jià)結(jié)合和非共價(jià)結(jié)合的兩種途徑

1.2.3 分子模擬用于功能單體的選擇和功能單體與模板分子比例的確定Piletsky等用分子模擬研究 分子印跡的重點(diǎn)就是功能單體的選擇和功能單體- 模板比例的確定。其核心思想是功能單體與模板之 間具有較強(qiáng)的相互作用，而且功能單體－模板處于合適的計(jì)量比時(shí)，合成的MIPs具有最高的識(shí)別性 能。模板分子與功能單體的相互作用可用以下公式 計(jì)算：△E=E（模板-功能單體復(fù)合物）－E（模板）－∑E（功能單體）

在上述指導(dǎo)下，S ergeyeva等[17]先 利用Hypeche于1999年研究了阿特拉津和甲基丙烯酸的復(fù)合物，發(fā)現(xiàn)模板和功能單體之間可以形成2個(gè)離子鍵、2 至3個(gè)氫鍵，說(shuō)明模板和功能單體之間具有較強(qiáng)的相互作用，所 以選擇 MAA作為功能單體是合適的。隨后 Piletsky等[18]使 用SYBYL軟件在SGI工作站 上建立了模板（麻黃素）和20個(gè)通常使用的功能單 體的構(gòu)象，這些功能單體就組成了虛擬的功能單體 庫(kù)，然后通過(guò) MAX1MIN2 關(guān)鍵字利用分子力場(chǎng)的方法優(yōu)化模板和功能單體的構(gòu)象，并且用Gasteiger-Huckel 方法計(jì)算電荷，再 用Leapfrog算法 依次將功能單體與模板分子在各種可能的部位對(duì) 接。

1.2.4 分子模擬的研究對(duì)印跡體系的優(yōu)化武利慶[19]用分子模擬系統(tǒng)全面地研究了幾種 MIPs 體系，建 立 MIPs 選擇性預(yù)測(cè)的理論模型。在此基礎(chǔ)上，他 將所建立的分子模擬方法應(yīng)用到功能單體種類的篩 選、功能單體比例的優(yōu)化以及致孔劑的篩選上。

2 在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用

Chapuis等[20]報(bào) 道了以特丁津和莠滅凈為模板 分子，采用低溫紫外引發(fā)制備印跡聚合物，用該聚 合物裝填 3mL 固相萃取柱，能從復(fù)雜基質(zhì)葡萄酒 和土壤中選擇性萃取加標(biāo)莠去津及其代謝物，在10-8級(jí)檢測(cè)中，能達(dá)到基線平穩(wěn)、定量準(zhǔn)確。分離 效果與免疫親和層析柱(immunosorbents IS)相當(dāng)。De Prada等[21]研 究了一種在線 MISPE 過(guò)程用來(lái)選 擇性富集和伏安法測(cè)定牛奶中衡量的磺胺甲基嘧 啶，通過(guò)實(shí)驗(yàn)得到的濃縮因子為45。這種方法的檢 測(cè)限低于國(guó)際食品法典委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定(牛奶中磺 胺甲基嘧啶的最大殘留量 25mg/L)，因此可以定量的檢測(cè)牛奶中的磺胺甲基嘧啶殘留。Puoci等[22]建 立一個(gè)簡(jiǎn)單的MISPE，方法從食品中預(yù)富集痕量的蘇丹紅，結(jié)果表明當(dāng)使用HPLC 不能檢測(cè)到蘇丹 紅時(shí)，M ISPE是一個(gè)有效地檢測(cè)痕量蘇丹紅的方法。周文輝等[23]采 用以三聚氰胺為模板分子合成了對(duì)三聚氰胺具有較好選擇性的分子印跡聚合物。以該分子印跡聚合物為固相萃取材料填充固相萃取小柱，可以從奶粉、純 牛奶等奶制品中選擇性地分離、富集三聚氰胺，并有效地去除奶制品中的復(fù)雜基質(zhì)，取得了良好的效果。對(duì)奶粉和液態(tài)奶提取液的加標(biāo) 回收率分別為 91%～103%、93%～98%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏 差(n=3)分別為 719%和111%。該 分子印跡聚合物還有望用于其它奶制品的分析。Maier等[24]用MISPE 方法來(lái)檢測(cè)紅酒中的致癌物質(zhì)毒汁菌素赭曲霉素，他們發(fā)現(xiàn)非印跡聚合物與 MIPs對(duì)模板分子具有相 類似的選擇性，并 且將NIPs 代替 MIPs 作為 SPE的吸附劑來(lái)避免模板分子的流出。Z hou等[25]發(fā) 明了一種在線 MISPE2PE 方法，使用熒光檢測(cè)器來(lái)快速檢 測(cè)小麥中的赭曲霉素A，每一個(gè)分析過(guò)程低于5min。而且，M ISPE2PE 與 LC/MS 聯(lián)用可以對(duì)赭曲霉素 A 進(jìn)行快速的定性和定量分析。

3 展 望

分子印跡技術(shù)經(jīng)過(guò)近十多年的發(fā)展，其優(yōu)良的性能 以及對(duì)目標(biāo)物的特異性吸附其在手性物質(zhì)分離、仿 生傳感、固相萃取、抗體模擬和催化等領(lǐng)域被得到 了廣泛應(yīng)用。分子印跡技術(shù)憑借其具有的特異結(jié)合 性和較強(qiáng)的耐受能力，回收率高等優(yōu)點(diǎn)，在食品安 全檢測(cè)領(lǐng)域已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用。但仍然存在一些問(wèn)題，如：聚合物的形態(tài)和傳質(zhì)機(jī)理還不夠明晰； 功能單體、交聯(lián)劑和聚合方法的選擇使用都有較大的局限性；吸附動(dòng)力學(xué)過(guò)程緩慢；吸附過(guò)程機(jī)理不 明確、不能廣泛應(yīng)用于水相體系；對(duì)大分子物質(zhì)的印跡仍然是一個(gè)難題等在某種程度上阻礙了分子印 跡技術(shù)的應(yīng)用。

隨著各種新型材料的不斷涌現(xiàn)，結(jié)合新型材料的分子印跡技術(shù)己成為分子印跡研究的熱點(diǎn)。結(jié)合 新型材料的特性，發(fā)揮不同材料的優(yōu)點(diǎn)以解決分子 印跡技術(shù)存在的問(wèn)題是今后分子印跡發(fā)展的趨勢(shì)之 一。分子印跡方法的不斷改進(jìn)、新的功能單體不斷 出現(xiàn)、各種新型材料不斷引入都將不斷推動(dòng)分子印 跡技術(shù)在更高層次上繼續(xù)發(fā)展?？傊S著生物技 術(shù)、電子技術(shù)、合成手段和現(xiàn)代分析檢測(cè)手段的迅 猛發(fā)展，分子印跡技術(shù)將日益完善，其必將在食品 安全檢測(cè)中發(fā)揮更大的作用。

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