脫殼病和吻腫病東風(fēng)螺體內(nèi)致病菌及條件致病菌菌相研究

李淑芳，邱德全，張繼東*，楊世平，賈春紅，邱明生

(1.廣東海洋大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，廣東 湛江 524088；廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088)

東風(fēng)螺(Babyloniaareolata)屬軟體動(dòng)物腹足綱、蛾螺科、東風(fēng)螺屬。我國(guó)的主要養(yǎng)殖品種有方斑東風(fēng)螺(Babyloniaareolata)、泥東風(fēng)螺(Babylonialutosa)和臺(tái)灣東風(fēng)螺(Babyloniaformosae)三種。2000年以來(lái)，東風(fēng)螺在我國(guó)廣東、海南、福建等南海地區(qū)已實(shí)現(xiàn)人工規(guī)?；B(yǎng)殖。目前，對(duì)東風(fēng)螺規(guī)?；B(yǎng)殖危害嚴(yán)重的主要疾病為脫殼病和吻腫病。東風(fēng)螺脫殼病在我國(guó)首次發(fā)生于2002年，且在2004年出現(xiàn)較大規(guī)模暴發(fā)，至今在東風(fēng)螺養(yǎng)殖場(chǎng)時(shí)有發(fā)生，發(fā)病率可高達(dá)80%以上，具有傳染性和復(fù)發(fā)性[1]。為探討東風(fēng)螺脫殼病和吻腫病與條件致病菌的相關(guān)性，從2011年開(kāi)始，本課題組對(duì)廣東省湛江市某大型東風(fēng)螺規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)病螺池和未發(fā)病螺池的水樣進(jìn)行了異養(yǎng)菌菌落總數(shù)檢測(cè)，并對(duì)脫殼病和吻腫病病螺以及健康螺進(jìn)行了條件致病菌的分離與鑒定，以期找出東風(fēng)螺脫殼病、吻腫病與致病菌及條件致病菌感染的相關(guān)關(guān)系，為東風(fēng)螺疾病的病因?qū)W研究和防治技術(shù)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品采集

2011年，湛江市某東風(fēng)螺養(yǎng)殖場(chǎng)(循環(huán)水養(yǎng)殖)，方斑東風(fēng)螺發(fā)生脫殼病，同場(chǎng)養(yǎng)殖的泥東風(fēng)螺發(fā)生脫殼病和吻腫病混合感染。選擇脫殼病方斑東風(fēng)螺養(yǎng)殖池、脫殼病-吻腫病混合感染的泥東風(fēng)螺養(yǎng)殖池和未發(fā)病的方斑東風(fēng)螺養(yǎng)殖池各1個(gè)，每池采集水樣各200 mL。從脫殼病方斑東風(fēng)螺池選取5只脫殼后健活的軟體螺，從脫殼病-吻腫病混合感染螺池選取5只吻腫病螺，從未發(fā)病方斑東風(fēng)螺螺池選擇臨床健康螺5只，分別放入盛有適量原池水的滅菌三角瓶備檢。

1.1.2 主要試劑與培養(yǎng)基

MightyAmp?DNA Polymerase 試劑盒及 DNA Marker，購(gòu)自Takara 公司大連分公司；細(xì)菌16S rDNA鑒定通用引物，由上海英駿生物技術(shù)有限公司廣州分公司合成?？片敿位【@色培養(yǎng)基，購(gòu)于上?？片敿挝⑸锛夹g(shù)有限公司；TCBS培養(yǎng)基，購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；弧菌科細(xì)菌生化鑒定管，購(gòu)于浙江天和微生物試劑有限公司；5%兔血瓊脂平板，由本試驗(yàn)室自行制備。

1.1.3 主要儀器

PCR儀，Biometra Tg PCR；DYY-8C型電泳儀，北京六一儀器廠；SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 水體異養(yǎng)菌菌落總數(shù)測(cè)定

采用常規(guī)平皿傾注計(jì)數(shù)法，測(cè)定發(fā)病池和未發(fā)病池內(nèi)異養(yǎng)菌的菌落總數(shù)。培養(yǎng)溫度35 ℃，培養(yǎng)時(shí)間48 h。

1.2.2 條件致病菌的分離

將脫殼病病螺軟體、帶殼吻腫病病螺及健康螺樣品用滅菌生理鹽水沖洗，采用無(wú)菌鉗破碎螺殼，取出完整軟體，分別用滅菌生理鹽水沖洗3遍后，用滅菌手術(shù)剪剪斷螺的足部肌肉，將新鮮斷面涂布接種于5%兔血瓊脂平板，并用滅菌接種環(huán)蘸取螺生殖腺內(nèi)容物劃線(xiàn)接種于另一兔血瓊脂平板。35 ℃培養(yǎng)18～24 h。

1.2.3 TCBS培養(yǎng)基和科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)

從上述兔血瓊脂平板上挑選溶血和不溶血的單個(gè)菌落，每板挑選3～5個(gè)菌落，分別劃線(xiàn)接種于3.5%NaCl營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(pH6.8)進(jìn)行純化培養(yǎng)。然后，從營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上分別轉(zhuǎn)接至TCBS培養(yǎng)基和科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基，35 ℃培養(yǎng)18～24 h。根據(jù)細(xì)菌在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)特性和菌落特征，初步判定細(xì)菌種類(lèi)。

1.2.4 16S rDNA PCR擴(kuò)增與序列分析

將上述試驗(yàn)分離得到的菌株，用其18 h的新鮮培養(yǎng)菌落，進(jìn)行16S rDNA PCR擴(kuò)增與序列分析。

1.2.4.1 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)E.coli16S rDNA基因序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)兩段引物(16SF:5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AGA ACG AAC GCT-3′；16SR:5′-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT TCA CCC C-3′)，由上海英駿生物技術(shù)有限公司廣州分公司合成。

1.2.4.2 16S rDNA擴(kuò)增與瓊脂糖凝膠電泳

將分離菌株分別劃線(xiàn)接種于3.5%NaCl營(yíng)養(yǎng)瓊脂(pH7.8)，35 ℃培養(yǎng)18 h，用于16S rDNA擴(kuò)增。

根據(jù)TaKaRa公司產(chǎn)品MightyAmp?DNA Poiymerase Ver.2使用說(shuō)明，用菌落PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系包括2×MightyAmp buffer25 μL，Primer 1和Primer 2各15 pmol， MightyAmp DNA Polymerase 1 μL(0.025 U/μL)，加ddH2O至50 μL。

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?8 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s，55 ℃退火15 s，68 ℃延伸90 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；68 ℃延伸90 s; 4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.4.3 16S rDNA PCR產(chǎn)物測(cè)序

將16S rDNA擴(kuò)增反應(yīng)體系與引物一同系送上海英駿生物技術(shù)有限公司廣州分公司測(cè)序部測(cè)序。

1.2.5 生化反應(yīng)試驗(yàn)

將分離菌株的新鮮固體培養(yǎng)物，分別接種于葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、甘露糖、肌醇、VP試驗(yàn)、蛋白胨水、賴(lài)氨酸、精氨酸、0%NaCl胨水、3%NaCl胨水、6%NaCl胨水、8%NaCl胨水、10% NaCl胨水等生化反應(yīng)試驗(yàn)管，35 ℃培養(yǎng)，按規(guī)定時(shí)間觀察并記錄結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 水體菌落總數(shù)測(cè)定

水體異養(yǎng)菌菌落總數(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，未發(fā)病方斑東風(fēng)螺螺池水體異養(yǎng)菌菌落總數(shù)為7.6×104cfu/mL，脫殼病方斑東風(fēng)螺螺池水體異養(yǎng)菌菌落總數(shù)為1.34×106cfu/mL，泥東風(fēng)螺脫殼病-吻腫病螺池水體異養(yǎng)菌菌落總數(shù)為1.46×107cfu/mL。由檢測(cè)結(jié)果可見(jiàn)，發(fā)病東風(fēng)螺池內(nèi)異養(yǎng)菌數(shù)量明顯高于未發(fā)病池內(nèi)異養(yǎng)菌數(shù)量。

2.2 細(xì)菌分離鑒定

用兔血瓊脂平板從2種發(fā)病東風(fēng)螺、健康東風(fēng)螺體內(nèi)共分離到131株細(xì)菌，該131株細(xì)菌在TCBS培養(yǎng)基和科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)。根據(jù)細(xì)菌在TCBS培養(yǎng)基和弧菌顯色培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)特性，結(jié)合生化試驗(yàn)和16S rDNA序列分析，共110株細(xì)菌得到鑒定，結(jié)果如下：脫殼病方斑東風(fēng)螺樣品分離得到37株細(xì)菌，鑒定結(jié)果為副溶血弧菌10株、哈氏弧菌17株、創(chuàng)傷弧菌2株、河流弧菌2株、Vibriohepatarius2株、腐敗希瓦氏菌1株、海藻希瓦氏菌2株、芽孢桿菌1株，其中優(yōu)勢(shì)菌株為哈氏弧菌和副溶血弧菌(溶血菌株)；吻腫病泥東風(fēng)螺樣品分離得到33株細(xì)菌，分別是副溶血弧菌3株、哈氏弧菌7株、鮑魚(yú)希瓦氏菌9株、海藻希瓦氏菌12株、芽孢桿菌2株，其中優(yōu)勢(shì)菌株為海藻希瓦氏菌、鮑魚(yú)希瓦氏菌和哈氏弧菌；健康方斑東風(fēng)螺樣品分離得到40株細(xì)菌，分別是副溶血弧菌26株、創(chuàng)傷弧菌1株、Vibriohepatarius10株、海藻希瓦氏菌1株、美人魚(yú)發(fā)光桿菌2株，其中優(yōu)勢(shì)菌株為副溶血弧菌(非溶血菌株)和Vibriohepatarius。其余21株細(xì)菌因測(cè)序失敗和生化反應(yīng)不確定，未能作出鑒定。各類(lèi)試驗(yàn)樣品中細(xì)菌種類(lèi)及溶血菌株的分布情況見(jiàn)表1。

表1東風(fēng)螺體內(nèi)條件致病菌分離鑒定結(jié)果(株)Table 1 The Isolated and Identified Results of the conditional pathogenic bacteria in abylonia areolate (strains)

注：a:脫殼病螺樣品分離的3株希瓦氏菌包括:腐敗希瓦氏菌1株，海藻希瓦氏菌2株；b:吻腫病螺樣品分離的21株希瓦氏菌包括：鮑魚(yú)希瓦氏菌9株、海藻希瓦氏菌12株；c:健康螺樣品分離的1株希瓦氏菌為海藻希瓦氏菌

2.3 16S rDNA序列分析

分離菌株的16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，均擴(kuò)增出1 490 bp的基因片段，其16S rDNA測(cè)序結(jié)果，通過(guò)NCBI的Blast程序(http:∥blast.ncbi.nih.gov/blast)進(jìn)行核苷酸序列比對(duì)分析，結(jié)果表明，有共39株細(xì)菌與副溶血性弧菌ATCC 1782菌株(GenBank序列注冊(cè)號(hào)為NR 041838)同源性100%，24株細(xì)菌與哈氏弧菌NCIMB 1 280菌株(GenBank 序列注冊(cè)號(hào)為NR 043165)同源性100%，3株細(xì)菌與創(chuàng)傷弧菌324號(hào)菌株(GenBank序列注冊(cè)號(hào)為NR 036888)同源性99%，2株細(xì)菌與河流弧菌VL 5125菌株(GenBank序列注冊(cè)號(hào)為NR 036790)同源性98%，12株細(xì)菌與Vibriohepatarius與LMG 20362菌株(GenBank序列注冊(cè)號(hào)為NR 025491)同源性為100%，1株細(xì)菌與腐敗希瓦氏菌LMG 26268菌株(GenBank序列注冊(cè)號(hào)別為NR 044863)同源性100%，15株細(xì)菌與海藻希瓦氏菌同源性O(shè)K-1菌株(GenBank序列注冊(cè)號(hào)NR028673)同源性99%，9株細(xì)菌與鮑魚(yú)希瓦氏菌DW.1菌株(GenBank序列注冊(cè)號(hào)為NR 044134)同源性99%，另有3株細(xì)菌與aerius芽胞桿菌 NBRC15535菌株(GenBank序列注冊(cè)號(hào)為NR 041455)同源性100%，2株與美人魚(yú)發(fā)光桿菌與ATCC 33539菌株(GenBank序列注冊(cè)號(hào)為NR 040831)同源性100%。其他菌株因測(cè)序失敗沒(méi)有進(jìn)行分類(lèi)。

131株分離菌株經(jīng)16S rDNA序列分析，共鑒定出弧菌屬細(xì)菌5種，希瓦氏菌屬細(xì)菌3種,芽胞桿菌屬細(xì)菌1種和美人魚(yú)發(fā)光桿菌1種。各類(lèi)細(xì)菌在不同試驗(yàn)樣品中的分布見(jiàn)表1。

2.4 溶血特性及生化反應(yīng)特性

分離菌株在兔血瓊脂平板上的生長(zhǎng)情況顯示，脫殼病方斑東風(fēng)螺體內(nèi)分離的副溶血弧菌多數(shù)菌株對(duì)兔紅細(xì)胞具有溶血活性(8/10)，健康螺螺體內(nèi)分離的副溶血弧菌僅有少數(shù)菌株具有溶血活性(4/26)。脫殼病和吻腫病病螺體內(nèi)分離的哈氏弧菌僅有少數(shù)菌株具有溶血活性(5/24)，且溶血菌株在兔血瓊脂平板上形成狹窄的透明溶血環(huán)。Vibriohepatarius多沒(méi)有溶血活性，創(chuàng)傷弧菌、河流弧菌、所有希瓦氏菌、芽胞桿菌、美人魚(yú)發(fā)光桿菌均呈完全溶血，詳見(jiàn)表2。

除芽胞桿菌和美人魚(yú)發(fā)光桿菌外，其余菌株的生化反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果表明，分離到的副溶血弧菌、哈氏弧菌、創(chuàng)傷弧菌、河流弧菌的生化反應(yīng)特性與資料記載相符[2]。希瓦氏菌生化反應(yīng)結(jié)果顯示，有3種生化反應(yīng)類(lèi)型，分別為腐敗希瓦氏菌、海藻希瓦氏菌和鮑魚(yú)希瓦氏菌，結(jié)果詳見(jiàn)表2。

表2 分離細(xì)菌的生化反應(yīng)特性Table 2 Biochemical characteristics of isolated bacteria

注：“+/-”表示產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；“-/-” 表示不產(chǎn)酸不產(chǎn)氣； “±”表示多數(shù)菌株試驗(yàn)陽(yáng)性，少數(shù)陰性；“-/+”表示多數(shù)菌株試驗(yàn)陰性，少數(shù)陽(yáng)性

3 討 論

3.1 脫殼病和吻腫病東風(fēng)螺體內(nèi)細(xì)菌菌相分析

本試驗(yàn)從脫殼病和吻腫病病螺及健康螺體內(nèi)分離到的細(xì)菌多為條件致病菌，脫殼病和吻腫病病螺樣品以及健康螺樣品中細(xì)菌種類(lèi)各不相同，而且各類(lèi)試驗(yàn)螺樣品中，各自的優(yōu)勢(shì)菌株種類(lèi)也存在較大差異。脫殼病方斑東風(fēng)螺體內(nèi)分離出8種細(xì)菌，優(yōu)勢(shì)菌株為副溶血弧菌(溶血菌株)和哈氏弧菌；吻腫病泥東風(fēng)螺體內(nèi)分離出4種細(xì)菌，優(yōu)勢(shì)菌株為海藻希瓦氏菌、鮑魚(yú)希瓦氏菌和哈氏弧菌；健康方斑東風(fēng)螺體分離出5種細(xì)菌，優(yōu)勢(shì)菌株為副溶血弧菌(非溶血菌株)和Vibriohepatarius。哈氏弧菌、河流弧菌、海藻希瓦氏菌、鮑魚(yú)希瓦氏菌僅分離于病螺體內(nèi)，副溶血弧菌同時(shí)存在于病螺和健康螺體內(nèi)，健康螺體內(nèi)副溶血弧菌數(shù)量雖然多于病螺體內(nèi)的數(shù)量，但病螺體內(nèi)副溶血弧菌以能夠溶解兔紅細(xì)胞的溶血性菌株占多數(shù)(9/13)，健康螺體內(nèi)副溶血弧菌的溶血菌株較少(4/26)，因此認(rèn)為，副溶血弧菌(溶血菌株)、哈氏弧菌、河流弧菌、鮑魚(yú)希瓦氏菌和海藻希瓦氏菌可能與東風(fēng)螺脫殼病與吻腫病有關(guān)。哈氏弧菌是存在于兩種病螺體內(nèi)的共同優(yōu)勢(shì)菌株，可能在疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中是主要致病性細(xì)菌。

3.2 東風(fēng)螺脫殼病和吻腫病病因分析

東風(fēng)螺脫殼病的病因至今尚不清楚，楊章武等[3]通過(guò)試驗(yàn)將正在發(fā)生脫殼病的東風(fēng)螺與健康螺養(yǎng)在同一個(gè)水池混合飼養(yǎng)，觀察17～40 d后，健康螺生長(zhǎng)、攝食、存活基本正常，未出現(xiàn)感染脫殼病的癥狀。王國(guó)福等[1]利用抗菌藥物對(duì)方斑東風(fēng)螺脫殼病進(jìn)行治療試驗(yàn)，結(jié)果表明土霉素、新諾明等多種抗生素對(duì)脫殼病無(wú)明顯治療效果。關(guān)于東風(fēng)螺吻腫病發(fā)病原因的報(bào)道不多，2009年黃郁蔥等[4]從吻腫病方斑東風(fēng)螺體內(nèi)分離到一株哈氏弧菌，經(jīng)肌肉注射和浸浴法人工感染健康東風(fēng)螺均獲得成功，分離菌株對(duì)東風(fēng)螺的LD50值為6.8×105cfu/g，證明哈氏弧菌能引發(fā)方斑東風(fēng)螺吻管水腫病。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，脫殼病和吻腫病東風(fēng)螺養(yǎng)殖水體中異養(yǎng)菌數(shù)量顯著高于健康螺養(yǎng)殖水體中細(xì)菌的數(shù)量，且兩種病螺體內(nèi)致病菌和條件致病菌的種類(lèi)和數(shù)量與健康螺體內(nèi)的存在較大差異，表明東風(fēng)螺脫殼病和吻腫病的發(fā)生、發(fā)展與水體環(huán)境中異養(yǎng)菌的數(shù)量及體內(nèi)條件致病菌的感染程度具有密切關(guān)系,其原因:一方面,由于水體環(huán)境異養(yǎng)菌數(shù)量的增加，水體環(huán)境正常微生物區(qū)系平衡破壞，致使致病菌和條件致病菌大量繁殖，而引起東風(fēng)螺發(fā)病或加重病情發(fā)展；另一方面，由于氣候改變、飼料轉(zhuǎn)換等其他原因誘發(fā)東風(fēng)螺發(fā)病，導(dǎo)致病螺代謝產(chǎn)物在水體積累引起環(huán)境中異養(yǎng)菌數(shù)量增加，體內(nèi)條件致病菌的大量繁殖，加重病情發(fā)展，引起發(fā)病率和死亡率的增高。在本試驗(yàn)中，哈氏弧菌作為脫殼病和吻腫病病螺體內(nèi)共同的優(yōu)勢(shì)菌株，可能與脫殼病和吻腫病發(fā)生有關(guān)。

溶血素被認(rèn)為是致病性弧菌中分布最廣泛的毒素之一[5-8]，本試驗(yàn)利用兔血瓊脂平板從試驗(yàn)螺體內(nèi)分離致病性細(xì)菌，兩種病螺體內(nèi)分離到的副溶血弧菌多數(shù)菌株、河流弧菌、創(chuàng)傷弧菌、希瓦氏菌均具有較強(qiáng)的溶血活性。但是，從脫殼病和吻腫病病螺分離到的哈氏弧菌多數(shù)菌株在兔血瓊脂平板上卻沒(méi)有溶血活性，僅有少數(shù)菌株在兔血瓊脂平板上形成狹窄的β溶血環(huán)。哈氏弧菌含有熱不穩(wěn)定性溶血素TLH，不含熱穩(wěn)定性溶血素TDH[5]，其溶血素的主要致病作用機(jī)理為破壞紅細(xì)胞，釋放出血紅素以及結(jié)合鐵成分，鐵濃度高時(shí)能催化形成致死性的羥自由基，對(duì)細(xì)胞具有很強(qiáng)毒害作用[9]。Zhang 等[6-7]研究發(fā)現(xiàn)致病性哈氏弧菌VIB645 胞外產(chǎn)物對(duì)大西洋鮭和虹鱒的紅細(xì)胞具有高滴度(1:32)的溶血活性，而且胞外產(chǎn)物對(duì)兔紅細(xì)胞的溶血活性比對(duì)綿羊、馬及驢的紅細(xì)胞的溶血作用更強(qiáng)，并認(rèn)為該哈氏弧菌胞外產(chǎn)物的溶血活性在鮭科魚(yú)類(lèi)的發(fā)病中起重要作用。但是，王斌等[10-11]研究證明，哈氏弧菌分泌的胞外酶含量和活性高低與細(xì)菌培養(yǎng)溫度關(guān)系不大，而與培養(yǎng)時(shí)間有一定關(guān)系，哈氏弧菌在35 ℃培養(yǎng)36 h時(shí)分泌的胞外酶含量和活性最高。因此，本試驗(yàn)分離所得哈氏弧菌致病因子及其致病機(jī)理有待進(jìn)一步深入研究。

海藻希瓦氏菌和鮑魚(yú)希瓦氏菌是脫殼病-吻腫病共患泥東風(fēng)螺的主要優(yōu)勢(shì)菌，在脫殼病病螺體內(nèi)也分離到海藻希瓦氏菌，但不是優(yōu)勢(shì)菌株，海藻希瓦氏菌是否與吻腫病發(fā)生有關(guān)還有待深入研究。海藻希瓦氏菌能夠分泌河豚毒素[12]，是能夠感染人的一種條件有致病性細(xì)菌[13]。鮑魚(yú)希瓦氏菌的生物學(xué)特性及其致病性目前尚未見(jiàn)報(bào)道。

東風(fēng)螺脫殼病和吻腫病的病因與發(fā)病機(jī)制雖然至今不明，但本試驗(yàn)通過(guò)分析病螺體內(nèi)致病菌及條件致病菌的菌相，證明環(huán)境中及體內(nèi)致病菌及條件致病菌對(duì)脫殼病和吻腫病的發(fā)生、發(fā)展具有一定影響。因此，在脫殼病與吻腫病防治過(guò)程中，應(yīng)重視和加強(qiáng)養(yǎng)殖環(huán)境中異養(yǎng)菌數(shù)量及條件致病菌的檢測(cè)與控制。本試驗(yàn)分離到致病菌及條件致病菌對(duì)東風(fēng)螺脫殼病和吻腫病的致病作用及機(jī)理，有待后續(xù)動(dòng)物感染試驗(yàn)及相關(guān)試驗(yàn)進(jìn)一步深入研究。

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