極端嗜鹽古菌TRM 51T的多相分類研究

任 敏 歹明輝 夏占峰

(新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300)

極端嗜鹽古菌(Extremely halophilic archaea)是一類生活在高鹽環(huán)境的微生物類群，其獨(dú)特的遺傳特質(zhì)、生理生化特性以及進(jìn)化世系使其具有重要的理論研究意義和應(yīng)用研究?jī)r(jià)值。目前，極端嗜鹽古菌資源與分類學(xué)研究主要采用多相分類學(xué)的理論與技術(shù)集中在三個(gè)層次特征:表型特征、化學(xué)特征(主要是極性脂的組分)、基因型特征(16S rDNA 和DNA–DNA 雜交、G+C 含量mol%)［6］的研究。到目前為止，嗜鹽菌科包括36 個(gè)屬，129 個(gè)種［7］。

新疆擁有豐富的鹽湖資源，不同類型的鹽湖蘊(yùn)藏著各不相同的嗜鹽古菌資源。為豐富嗜鹽古菌物種多樣性，并為進(jìn)一步的理論與應(yīng)用研究提供菌種資源。本研究采集新疆阿圖什市境內(nèi)的硝爾庫(kù)勒湖鹽湖土壤樣品［1］，利用純培養(yǎng)技術(shù)分離其土壤樣品得到多株極端嗜鹽古菌，通過對(duì)分離菌株的16S rDNA 基因擴(kuò)增測(cè)序后，對(duì)潛在新物種TRM51T進(jìn)行形態(tài)鑒定、革蘭氏染色、生長(zhǎng)鹽濃度試驗(yàn)、Mg2+濃度試驗(yàn)、生長(zhǎng)pH 范圍、生理生化鑒定、極性脂組成、16S rDNA 基因序列等分析，確定TRM 51T屬于極端嗜鹽古菌科中的新屬類群。

1 材料與方法

1.1 菌株

菌株TRM 51T從新疆硝爾庫(kù)勒湖(76°53＇E，40°10＇N)中分離得到純培養(yǎng)物(GenBank/EMBL/DDBJ登錄號(hào)為 JN166404);標(biāo)準(zhǔn)菌株 Haloterrigena turkmenica CGMCC 1.2364T、Haloarcula vallismortis CGMCC1.2048T、Halopiger xanaduenensis CGMCC 1.6379T(=Halopiger xanaduensis JCM 14033T)、Halopiger aswanensis JCM 11628T等購(gòu)自中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC)和日本菌種保藏中心(Japan Collection of Microorganisms，JCM)。所有菌株均在CM 培養(yǎng)基上進(jìn)行多相分類鑒定［3］。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 形態(tài)學(xué)特征 細(xì)胞形態(tài)及運(yùn)動(dòng)性按照文獻(xiàn)［3］進(jìn)行。

1.2.2 生理生化鑒定 生長(zhǎng)所需鹽濃度范圍及最適NaCl、MgCl2濃度、生長(zhǎng)pH 及溫度范圍依照極端嗜鹽古菌新分類單元描述標(biāo)準(zhǔn)中的方法［5－6］。

1.2.3 生長(zhǎng)條件實(shí)驗(yàn) 硝酸鹽、精氨酸和二甲基亞砜的厭氧實(shí)驗(yàn)，硝酸鹽、亞硝酸鹽還原，硝酸鹽產(chǎn)氣，H2S 產(chǎn)氣，碳氮源利用及抗生素敏感實(shí)驗(yàn)均按照文獻(xiàn)［3］進(jìn)行。

1.2.4 基因型分類特征

1.2.4.1 菌株16S rDNA 基因序列分析

根據(jù)文獻(xiàn)［2］提取菌體DNA，沉淀溶于滅菌的超純水中;嗜鹽古菌16S rDNA 基因序列的PCR 擴(kuò)增使用特異性引物F1:5＇－TTCCGGTTGATCCTGCC－3＇;R1::5＇－AAGGAGGTGATCCAGCC－3＇［3］。PCR 反應(yīng)體系:10 ×Taq Buffer 2.5 μL，dNTP Mixture(2.5 mM each)3μL，F(xiàn)1(10 μM)0.5 μL，R1(10 μM)0.5 μL，Taq 酶(5 U/μL)0.3 μL，模板DNA 0.5 μL，ddH2O 補(bǔ)至25 μL。PCR 反應(yīng)條件:95℃5 min ;95℃1 min ;51℃1 min ;72℃1.5 min ;30 個(gè)循環(huán);72℃10 min。

取3 μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物與一定比例的上樣緩沖液混合后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(1%瓊脂糖凝膠，1 ×TAE 電泳緩沖液，100 V 電泳30 min)，EB(0.5 μg/mL)染色后在凝膠成像系統(tǒng)用紫外光透射觀察結(jié)果，拍攝電泳圖，PCR 產(chǎn)物為約1.5 kb，PCR 產(chǎn)物膠回收后與pMD18－T 載體連接，轉(zhuǎn)化入DH5α 大腸桿菌中，菌落PCR 驗(yàn)證后，選取陽(yáng)性克隆12 個(gè)，送由上海生物工程有限公司測(cè)序。

1.2.4.2 基于16S rDNA 基因的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

測(cè)序結(jié)果用DNAStar 軟件包中的SeqMan 軟件剪輯，所得序列通過Eztaxon server 2.1 在線分析，確定其潛在的分類地位，下載相關(guān)序列，并采用MEGA5.0［9］軟件包中的Clustal W 進(jìn)行多序列比對(duì)，運(yùn)用Kimura 2－Parameter Distance 模型及Neighbor－Joining 法，設(shè)定Bootstrap 值為1000 次來(lái)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹［9］。

1.2.4.3 DNA G+C mol%含量的測(cè)定

基因組DNA的提取方法參見Marmur (1961)，G+C mol%含量通過反相HPLC 法(Mesbah et al，1989)測(cè)定。根據(jù)樣品色譜圖中各種脫氧核糖核苷酸的峰面積對(duì)DNA G+C mol %進(jìn)行計(jì)算。

DNA G+C mol %含量的計(jì)算公式:

1.2.5 化學(xué)分類特征

根據(jù)崔恒林的方法［3］，對(duì)培養(yǎng)好的200 ml 菌液(OD600為1.0 以上)提取極性脂，取6 uL 在10 cm×10 cm的硅膠板(Merk 公司，25TLC aluminium sheets 20 ×20 cmSilica gel 60F254)進(jìn)行單向TLC 檢測(cè)菌體的磷脂。同時(shí)取等量上述極性脂在10 cm×20 cm的硅膠板雙向TLC，檢測(cè)糖脂組份。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)與生長(zhǎng)特征

菌株TRM 51T為革蘭氏陰性菌(圖2)，牛奶鹽平板上培養(yǎng)至7d 時(shí)菌落呈圓形，淡粉色，表面光滑濕潤(rùn)，有黏性，邊緣較整齊，菌落直徑約為1～2 mm(圖1)。細(xì)胞呈桿狀，菌株大小2.73～18.81 μm，無(wú)鞭毛，能運(yùn)動(dòng)(圖3)。

圖1 TRM 51T 菌落形態(tài)

圖2 TRM 5T 革蘭氏染色

圖3 TRM 51T 電鏡照片

2.2 營(yíng)養(yǎng)特性

菌株TRM 51T生長(zhǎng)的NaCl 濃度為2.1～4.3 M，最適生長(zhǎng)NaCl 濃度為3.1 M，pH 生長(zhǎng)范圍6.0～9.0(最適pH 8.0)，溫度范圍28～50℃(最適生長(zhǎng)溫度 37℃)，而相近菌株 Halopiger xanaduenensis CGMCC 1.6379T和 Haloterrigena turkmenica CGMCC 1.2364T的NaCl 濃度分別為2.5～5.0 M、2.2～4.0 M，它們的最適生長(zhǎng)NaCl 濃度分別為4.3 M、3.1 M，其pH 范圍6.0～11.0(最適pH7.5～8.0)、6.5～9.0(最適pH7.0)，其生長(zhǎng)溫度范圍28～45℃(最適生長(zhǎng)溫度37℃)、35～58℃(最適生長(zhǎng)溫度50℃)。

2.3 生化特征

菌株TRM 51T進(jìn)行生理生化特性表現(xiàn)為:水解淀粉，液化明膠，不生成H2S，不水解吐溫80，吲哚實(shí)驗(yàn)陰性，氧化酶、過氧化氫酶陽(yáng)性，硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，不能利用硝酸鹽、精氨酸和DMSO。

TRM51T利用葡萄糖、果糖、D－ 核糖、阿拉伯糖、麥芽糖、蔗糖、淀粉、甘油、甘露醇、D－山梨醇、醋酸鹽、DL－乳酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、L－鳥氨酸、L－脯氨酸、L－谷氨酸、鹽酪氨酸、精氨酸等作為唯一碳源、能源生長(zhǎng);不能利用甘露糖、半乳糖、L－山梨糖、D－木糖、L－天冬氨酸、L－谷氨酸、L－賴氨酸、L－絲氨酸、L－亮氨酸等;TRM51T與相近物 種 Halopiger xanaduenensis CGMCC 1.6379T、Haloterrigena turkmenica CGMCC 1.2364T在碳、氮源的利用上存在差異(如表1)。

表1 TRM 51T 與相近種的生化特征

2.4 抗生素敏感

TRM51T對(duì)桿菌肽、新生霉素、甲氧芐氨嘧啶敏感;對(duì)紅霉素、新霉素、利福平、氯霉素、氨芐青霉素、諾氟沙星、鏈霉素、卡那霉素、四環(huán)素、萬(wàn)古霉素、制霉菌素、呋喃妥因、萘啶酸等不敏感。而Halopiger xanaduenensis CGMCC 1.6379T對(duì)甲氧芐氨嘧啶不敏感和對(duì)利福平敏感，與 TRM51T不同;Haloterrigena turkmenica CGMCC 1.2364T對(duì) 利 福平、呋喃妥因敏感，與TRM51T不同。

2.5 基因型特征

2.5.1 16S rDNA 基因擴(kuò)增

采用古菌通用引物，對(duì)TRM51T所提取的基因組DNA 進(jìn)行16SrDNA 基因序列進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序，得到幾乎全長(zhǎng)的16S rDNA 基因序列，經(jīng)過電泳檢測(cè)，條帶大小約為1.5kb(如圖4)。序列提交NCBI并獲得GenBank 登錄號(hào)(JN166404)。

圖4 TRM 51T 16S rDNA的PCR 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

2.5.2 16S rDNA 基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹分析

克隆測(cè)序后，所得序列進(jìn)行拼接，TRM 51T的16S rDNA 基因序列為1472 bp，與有效發(fā)表的參比菌株Halopiger 同源性處于94.2%～95.3%之間，從各菌株以16S rDNA 基因序列為基礎(chǔ)構(gòu)成的系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖5)，可以看出相比較于Haloterrigena、Halopiger、Natrinema 等屬，TRM 51T形成一獨(dú)立分支，將TRM 51T歸入新的屬級(jí)分類單元。(采用鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹，表明菌株TRM51T在嗜鹽菌科的分類地位。Methanospirillum hungatei JF－1(NR 042789)作為外群。自舉值選取1000(1000 次重復(fù)取樣，大于50%的數(shù)值被標(biāo)出)。標(biāo)尺0.02 代表200 個(gè)核苷酸。

圖5 基于16S rDNA 基因序列構(gòu)建的極端嗜鹽古菌系統(tǒng)發(fā)育N－J 樹)

2.5.3 基因組DNA的G+C mol%含量

菌株TRM 51T、Halopiger xanaduenensis CGMCC 1.6379T、Haloterrigena turkmenica CGMCC 1.2364T基因組DNA G+C mol% 含量分別為63.2%(Tm)、63.1%(Tm)、61.9%(Tm)，其值均大于60，屬于高G+C的革蘭氏陰性菌。

2.6 嗜鹽古菌細(xì)胞極性脂組分

TRM 51T單向TLC 條帶與參比菌株的條帶相比，TRM 51T含有TGD－2(如圖6);菌株TRM51T細(xì)胞中主要的磷脂組分為PG(磷脂酰甘油)、PGPMe(磷脂酰甘油磷酸甲基酯)、TGD－2(葡糖苷甘露糖苷葡糖二醚)，明顯與相近菌株Halopiger aswanensis JCM 11628T雙向TLC 不同(如圖7)。

圖6 嗜鹽古菌菌株TRM51T 糖脂TLC 圖譜

圖7 嗜鹽古菌菌株TRM51T(a)和Halopiger aswanensis JCM 11628T(b)磷脂TLC 圖譜

3 討論

極端嗜鹽古菌屬于嗜鹽菌科，屬于生命三域中的古菌域［6，8］。本研究表明TRM51T革蘭氏陰性，可運(yùn)動(dòng)，菌株呈現(xiàn)粉紅色/白色，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞呈現(xiàn)長(zhǎng)短不一的桿狀，NaCl 濃度為2.1～4.3 M，最適生長(zhǎng)NaCl 濃度為3.1 M，不需要鎂離子即可生長(zhǎng)，最適Mg2+濃度0.3 M，生長(zhǎng)pH 6.0～7.0;根據(jù)16 S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育分析TRM51T與Halopiger 屬［7］的同源性最高，達(dá)95.3%，確認(rèn)為屬于嗜鹽菌科的一個(gè)新屬。

硝爾庫(kù)勒湖總鹽濃度接近于飽和狀態(tài)，前期的土樣分離工作中，得到了鹽堿球菌屬(Natronococcus)、鹽無(wú)色菌屬(Natrialba)、鈉白菌屬(Natrinema)、鹽東方菌屬(Halorientalis)、鹽陸生菌屬 (Haloterrigena)、鹽堿單胞菌屬(Natronomonas)、鹽池棲菌屬(Halostagnicola)、鹽惰菌屬(Halopiger)、鹽粒菌屬(Halogranum)7 個(gè)屬，34 株極端嗜鹽古菌，其中鹽堿球菌屬(Natronococcus)、鹽陸生菌屬(Haloterrigena)占的數(shù)量最多，菌落顏色呈現(xiàn)黃色、白色、紅色、橙色等，多數(shù)菌株有淀粉酶活性，少數(shù)有纖維素酶活性(文章另待發(fā)表)，有16 株潛在新種，菌株編號(hào)TRM51T就是一株。所有的分離的極端嗜鹽古菌的理化特征，更多酶活特點(diǎn)還在進(jìn)行中。

本研究首次對(duì)該地區(qū)鹽湖的極端嗜鹽古菌進(jìn)行了多相分類鑒定，是對(duì)該地區(qū)鹽湖微生物物種的資源的開發(fā)。該菌種資源可進(jìn)一步作為微生物遺傳、生態(tài)和分類學(xué)等研究的材料，有一定的理論和應(yīng)用價(jià)值。

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