根除幽門螺旋桿菌四聯(lián)療法中奧美拉唑?qū)Ρ雀袢G吸收的影響

郝瑞家，劉有平，梁 寧，曾文琴，楊雪明，邸 欣

(沈陽藥科大學(xué)1.藥物代謝與藥物動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)室，2.環(huán)境化學(xué)教研室，遼寧沈陽 110016)

幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori，Hp)感染是慢性胃炎和消化性潰瘍的主要病因，由質(zhì)子泵抑制劑聯(lián)合兩種抗生素組成的三聯(lián)療法一直被推薦作為根除Hp的一線治療方案。但隨著抗生素在臨床上的廣泛使用，Hp耐藥菌株不斷增加，三聯(lián)療法對(duì)Hp的根除率明顯下降。研究表明，以質(zhì)子泵抑制劑和鉍劑聯(lián)合兩種抗生素的四聯(lián)療法可顯著提高Hp的根除率，并在一定程度上克服Hp的原發(fā)耐藥和避免繼發(fā)耐藥的產(chǎn)生[1－6]。2005年由歐洲 Hp研究小組制定的MaastrichtⅢ共識(shí)報(bào)告中將質(zhì)子泵抑制劑+鉍劑+甲硝唑+四環(huán)素的四聯(lián)療法推薦為根除Hp感染的一線替代方案[7]，2007年我國(guó)廬山共識(shí)報(bào)告中也將質(zhì)子泵抑制劑合并鉍劑的四聯(lián)療法作為一線治療方案進(jìn)行推薦[8]。值得注意的是，四聯(lián)療法中質(zhì)子泵抑制劑和鉍劑雖都能有效抑制和殺滅Hp，但因鉍的作用機(jī)制和體內(nèi)吸收依賴于胃內(nèi)的酸環(huán)境，而質(zhì)子泵抑制劑能抑制胃酸分泌，因此，二者合用時(shí)可能發(fā)生藥物間的相互作用。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，鉍劑主要在局部發(fā)揮治療作用，吸收甚微，一旦過多的鉍進(jìn)入生物體內(nèi)，將會(huì)引起腎和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的毒性反應(yīng)[9]。

本研究擬采用火焰原子吸收光譜法對(duì)比格犬口服膠體果膠鉍(bismuth，B)+甲硝唑(metronidazole，M)+四環(huán)素(tetracycline，T)(BMT)和奧美拉唑(omeprazole，Ome)+BMT(Ome+BMT)后鉍的藥代動(dòng)力學(xué)進(jìn)行比較，旨在探討根除Hp四聯(lián)療法中奧美拉唑?qū)Ρ雀袢G吸收的影響，為四聯(lián)療法的臨床合理應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、藥品、試劑和儀器

健康比格犬，雌雄各半，體質(zhì)量8～12 kg，由沈陽康平實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供，動(dòng)物合格證號(hào):2009－0005。

膠體果膠鉍膠囊，規(guī)格:每粒鉍35 mg;甲硝唑片，規(guī)格:每片甲硝唑125 mg;鹽酸四環(huán)素片，規(guī)格:每片四環(huán)素125 mg和奧美拉唑腸溶膠囊，規(guī)格:每粒奧美拉唑20 mg，購自山西安特生物制藥股份有限公司。

高純金屬鉍，純度≥99.99%，由中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心提供;鹽酸，優(yōu)級(jí)純，購自沈陽經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)試劑廠;硝酸，優(yōu)級(jí)純，購自北京化工廠;高氯酸，優(yōu)級(jí)純，天津市鑫源化工有限公司;純凈水，購自杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司;硼氫化鉀，分析純，購自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司;氫氧化鈉，分析純，購自天津市大茂化學(xué)試劑廠。

WFX－120A型火焰原子吸收分光光度計(jì)，北京瑞利分析儀器公司;WHG－103A型流動(dòng)注射氫化物發(fā)生器，北京浩天暉科貿(mào)有限公司;空心陰極鉍燈，北京真空電子技術(shù)研究所;WEA－3B型數(shù)顯精密加熱板，上海群尚儀器儀表有限公司。

1.2 給藥與生物樣本采集

結(jié)合臨床人用藥物劑量推算比格犬用藥劑量，參考所用藥物制劑規(guī)格最終確定每只比格犬總給藥量。采用雙周期隨機(jī)交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將6只健康比格犬隨機(jī)分為2組，分別先后po給予膠體果膠鉍膠囊2粒(70 mg)+鹽酸四環(huán)素片2片(250 mg)+甲硝唑片2片(250 mg)或奧美拉唑腸溶膠囊2粒(40 mg)+膠體果膠鉍膠囊2粒(70 mg)+鹽酸四環(huán)素片2片(250 mg)+甲硝唑片2片(250 mg)。給藥前禁食12 h，分別于給藥前(0 h)和給藥后0.5，1，2，3，4，6，8，10，12 和14 h自犬前肢靜脈取血約3 ml，立即移入經(jīng)肝素處理的離心試管中，2109×g離心10 min，分離血漿，于－20℃冰箱中保存，待測(cè)。

1.3 血漿樣品預(yù)處理

取比格犬血漿樣品500 μl，置于聚四氟乙烯坩堝中，加入消解液(硝酸∶高氯酸4∶1 ，V∶V)5 ml，加蓋靜置過夜，次日將坩堝置于沙浴電熱板上，加蓋加熱至120℃并維持0.5 h，然后再將溫度升高至180℃并維持2 h，開蓋待液體揮至近干，加純凈水1 ml，將酸揮盡，待液體再次近干后，加入20%鹽酸溶解殘留物并轉(zhuǎn)移至10 ml量瓶中，用20%鹽酸稀釋至刻度，搖勻，迅速轉(zhuǎn)移至塑料離心管中，待測(cè)。按相同的處理方法制備不含鉍的空白溶液。

1.4 建立火焰原子吸收光譜法測(cè)定血漿中鉍濃度

1.4.1 火焰原子吸收光譜法條件

采用火焰原子吸收光譜法測(cè)定比格犬血漿中鉍的濃度。采用高性能鉍燈，吸收線波長(zhǎng)為223.1 nm，燈電流為3 mA，狹縫寬度為0.4 nm，電熱吸收管工作電壓為160 V，載氣流量為200 m·lmin－1，峰高讀數(shù)，積分時(shí)間為15 s。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備和定量下限的測(cè)定

取比格犬空白血漿500 μl，分別加入一系列不同濃度的鉍標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成相當(dāng)于鉍血漿濃度為2.0，4.0，10.0，20.0，40.0 和 80.0 μg·L－1的血漿樣品，按1.3項(xiàng)下方法操作，每一濃度進(jìn)行雙樣本分析。以待測(cè)物濃度為橫坐標(biāo)(c)，待測(cè)物扣除空白的鉍吸收值為縱坐標(biāo)(y)，用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行線性回歸運(yùn)算。按上述方法配制鉍血漿濃度為2.0 mg·L－1的樣品，進(jìn)行 6 樣本分析，計(jì)算精密度和準(zhǔn)確度。

1.4.3 準(zhǔn)確度和精密度的測(cè)定

取比格犬空白血漿500 μl，配制血漿濃度分別為4.0，20.0 和 70.0 μg·L－1的質(zhì)量控制樣品，每一濃度進(jìn)行6樣本分析，連續(xù)測(cè)定3 d。根據(jù)當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算質(zhì)控樣品的測(cè)得濃度，并計(jì)算準(zhǔn)確度和精密度。

1.4.4 鉍的穩(wěn)定性考察

取空白血漿500 μl，配制鉍血漿濃度分別為4.0和70.0 μg·L－1的樣品，每一濃度進(jìn)行 3 樣本分析，考察血漿樣品于－20℃放置60 d、經(jīng)歷3次冷凍－解凍循環(huán)、室溫放置4 h以及血漿樣品經(jīng)預(yù)后處理的血漿樣品室溫放置48 h的穩(wěn)定性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 火焰原子吸收光譜法測(cè)定鉍的方法學(xué)確證

2.1.1 鉍的標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量限

鉍的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=1.238×10－3c+1.314 ×10－3，鉍的線性范圍為2.0～80.0 μg·L－1。所建立的火焰原子吸收光譜法測(cè)定比格犬血漿中鉍的定量下限可達(dá) 2.0 μg·L－1。

2.1.2 鉍的準(zhǔn)確度和精密度

鉍濃度為4.0，20.0 和 70.0 μg·L－1的質(zhì)控樣品6樣本，經(jīng)預(yù)處理后測(cè)定鉍的血藥濃度，并計(jì)算其精密度和準(zhǔn)確度(表1)。

Tab.1 Accuracy and precision of bismuth in plasma of Beagle dog by flame atomic absorption spectrometry

2.1.3 鉍的穩(wěn)定性

血漿樣品在經(jīng)過－20℃放置60 d，3次冷凍－解凍循環(huán)，室溫放置4 h和處理后室溫放置48 h等處理后，測(cè)得鉍血藥濃度的RE均在±6.5%之間，提示鉍比較穩(wěn)定。

上述結(jié)果表明，所建立的測(cè)定比格犬血漿中鉍分析方法符合實(shí)驗(yàn)要求，可用于鉍的藥代動(dòng)力學(xué)研究。

2.2 奧美拉唑?qū)︺G的藥代動(dòng)力學(xué)的影響

比格犬po給予BMT(70+250+250)mg和Ome+BMT(40+70+250+250)mg后鉍的平均血藥濃度－時(shí)間曲線(圖1)。

比格犬口服BMT或Ome+BMT后，血漿中鉍的濃度約在3 h達(dá)峰濃度，隨后鉍的濃度快速下降，12 h時(shí)鉍的濃度已降至較低水平?？诜﨎MT后鉍的 cmax為(21.7±5.3)μg·L－1，AUC0－t為(116.3±27.4)μg·h·L－1。口服 Ome+BMT(40+70+250+250)mg后鉍的 cmax為(37.5±5.4)μg·L－1，AUC0－t為(170.1±30.4)μg·h·L－1。將 cmax，AUC0－t進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行配對(duì) t檢驗(yàn)，將 tmax進(jìn)行非參數(shù)法(配對(duì)Wilcoxon法)檢驗(yàn)，結(jié)果表明，BMT 和 Ome+BMT 組的 cmax、AUC0－t具有顯著性差異(P＜0.05)，tmax無顯著性差異。比格犬口服Ome+BMT 后鉍的 cmax提高約 73%，AUC0－t提高約46%，說明根除Hp四聯(lián)療法中，奧美拉唑能顯著增加比格犬體內(nèi)鉍的吸收。

Fig.1 Concentration－time curves of bismuth in plasma after po administration BMT and Ome+BMT to Beagle dogs.Beagle dogs were po given BMT(bismuth 70+metronidazole 250+tetracycline250)mg and omeprazole(40 mg)+BMT(bismuth 70+metronidazole 250+tetracycline 250)mg，blood samples were collected before administration and at 0.5，1，2，3，4，6，8，10，12 and 14 h after administration，bismuth concentrations were detected by flame atomic absorption spectrometry.±s，n=6.

3 討論

文獻(xiàn)報(bào)道血漿中鉍的測(cè)定方法主要有原子吸收光譜法、原子熒光光譜法、電化學(xué)法和電感耦合等離子體質(zhì)譜法等[10－15]。但是電化學(xué)法操作與計(jì)算均比較復(fù)雜，不能滿足生物樣品高通量分析的要求;而原子熒光光譜法和電感耦合等離子體質(zhì)譜法雖具有操作簡(jiǎn)單和靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，但實(shí)驗(yàn)儀器昂貴而且實(shí)驗(yàn)成本較高;本文采用火焰原子吸收光譜法測(cè)定比格犬血漿中鉍的濃度，方法簡(jiǎn)便、快速和準(zhǔn)確，且實(shí)驗(yàn)成本低，其檢測(cè)靈敏度能夠滿足藥代動(dòng)力學(xué)研究要求。

本實(shí)驗(yàn)選擇硝酸－高氯酸(4∶1，V∶V)為樣品的消解液，并采用120℃下加熱0.5 h，然后升溫至180℃下加熱2 h的消解方法;目的先在較低溫度下使血漿和消解液充分反應(yīng)，然后升高溫度將血漿中有機(jī)成分消解完全并將酸快速揮干。

鉍劑必須在酸性環(huán)境中才能起作用，而質(zhì)子泵抑制劑能抑制胃酸，因此，二者合用時(shí)可能發(fā)生藥物間的相互作用。Spénard等[16]報(bào)道，健康志愿者同時(shí)口服甲硝唑、四環(huán)素、枸櫞酸鉍鉀三合一膠囊和奧美拉唑之后，鉍的吸收明顯高于不服用奧美拉唑的對(duì)照組，AUC提高了約200%，但因僅連續(xù)給藥10 d，血漿中鉍在 100 μg·L－1的中毒閾值以下，無鉍中毒現(xiàn)象出現(xiàn)。四聯(lián)療法的一般服用時(shí)間不會(huì)超過15 d，因此并未見過四聯(lián)療法長(zhǎng)期用藥后導(dǎo)致鉍中毒的報(bào)道。張澍田等[17]對(duì)大鼠單用膠體果膠鉍和采用四聯(lián)療法(蘭索拉唑+膠體果膠鉍+甲硝唑+阿莫西林)14 d，停藥后，鉍在心、腦、腎和肝中的蓄積量，結(jié)果表明，四聯(lián)療法顯著增加了鉍在腎中的蓄積。張莉等[18]發(fā)現(xiàn)，四聯(lián)療法(奧美拉唑+膠體果膠鉍+甲硝唑+阿莫西林)中的奧美拉唑能增加鉍在大鼠腎中的蓄積，損傷腎小管細(xì)胞的功能。

本研究通過對(duì)比格犬口服BMT和Ome+BMT后鉍的藥代動(dòng)力學(xué)行為的比較，考察了四聯(lián)療法中奧美拉唑?qū)Ρ雀袢w內(nèi)鉍吸收的影響。結(jié)果表明，BMT和 Ome+BMT組的tmax無顯著性差異，但cmax，AUC0－t具有顯著性差異，說明四聯(lián)療法中奧美拉唑能顯著增加比格犬體內(nèi)鉍的吸收，提示在臨床應(yīng)用四聯(lián)療法時(shí)應(yīng)小心慎重，注意觀察是否有不良反應(yīng)，必要時(shí)進(jìn)行鉍血藥濃度監(jiān)測(cè)，適時(shí)調(diào)整鉍劑的給藥量或者避免長(zhǎng)期用藥，以減少不良反應(yīng)。

在本研究中并未給出消除半衰期和MRT等參數(shù)，Benet等[19]對(duì)健康志愿者長(zhǎng)期給予鉍劑血漿中鉍達(dá)到穩(wěn)態(tài)濃度后體內(nèi)鉍的處置進(jìn)行了詳細(xì)的研究，認(rèn)為鉍的處置分為3部分，首先是“分布”半衰期為1～4 h，僅對(duì)應(yīng)4.8%的藥時(shí)AUC，其次有一延長(zhǎng)半衰期為5～11 d，與67.9%的藥時(shí)AUC相關(guān)，最后有一個(gè)更加延長(zhǎng)的半衰期，為20～72 d，與27.3%的藥時(shí)AUC相關(guān)，由上可知在鉍的消除過程中，第二個(gè)延長(zhǎng)半衰期間對(duì)應(yīng)的藥時(shí)AUC占有最大比例，代表鉍的主要消除與排泄，在鉍的處置中最重要，因此，采用第二個(gè)延長(zhǎng)半衰期對(duì)鉍在體內(nèi)的穩(wěn)態(tài)濃度和蓄積情況進(jìn)行描述是最合適的，但通常需要多次給藥，長(zhǎng)期采集血漿和尿樣來計(jì)算穩(wěn)態(tài)消除半衰期，而以單次給藥計(jì)算鉍的消除半衰期是不準(zhǔn)確的，也是沒有意義的。本研究的目的是考察四聯(lián)療法中奧美拉唑?qū)Ρ雀袢w內(nèi)鉍吸收的影響，因此僅設(shè)計(jì)了單次給藥，未能給出半衰期。

有文獻(xiàn)曾對(duì)枸櫞酸鉍鉀在人體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)進(jìn)行過研究，而本研究采用的是膠體果膠鉍，不同鉍劑的吸收速度和吸收程度是存在差異的，通常膠體果膠鉍的吸收程度要遠(yuǎn)低于枸櫞酸鉍鉀，其吸收速度也慢于枸櫞酸鉍鉀，有關(guān)含膠體果膠鉍的四聯(lián)療法中奧美拉唑?qū)w內(nèi)鉍吸收影響的研究尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本文首次對(duì)含膠體果膠鉍的三聯(lián)和四聯(lián)療法中鉍在比格犬體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)進(jìn)行了研究。比格犬單次口服BMT后鉍的 cmax為 14.0～29.3 μg·L－1，單次口服 Ome+BMT 后鉍的cmax為29.2～42.7 μg·L－1，上述峰值雖未超過中毒濃度，但考慮到僅單次給藥的cmax即提高約73%，下一步有必要進(jìn)行四聯(lián)療法多次給藥的藥動(dòng)學(xué)研究，以考察鉍的穩(wěn)態(tài)血藥濃度和鉍的蓄積程度，為臨床制定安全有效的四聯(lián)療法用藥方案提供參考。

文獻(xiàn)[20]報(bào)道，健康志愿者在口服奧美拉唑后胃液的pH值從2.1升高至4.7，進(jìn)而能夠改變一些pH依賴性藥物在胃內(nèi)的吸收，因鉍在胃內(nèi)的吸收即為pH依賴性，故奧美拉唑與鉍劑合用會(huì)增加人體內(nèi)鉍的吸收量。在禁食狀態(tài)下，比格犬的胃液和小腸液的pH值、胃排空時(shí)間等與人體相近，但比格犬的小腸轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間稍小于人體，因而鉍在比格犬和人體內(nèi)的吸收可能有一定差異，鑒于此，含膠體果膠鉍的四聯(lián)療法中奧美拉唑?qū)θ梭w內(nèi)鉍吸收的實(shí)際影響最終還是需要進(jìn)行臨床研究來驗(yàn)證。

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