重樓皂苷的制備及其抗A型流感病毒活性

蒲秀瑛，劉 宇，李 言，張偉杰，王恒瑞

(1.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州 730050;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅蘭州 730050)

流感是由流感病毒引起的嚴(yán)重危害人類健康的急性呼吸道傳染病。目前，防治流感的藥物雖有離子通道M2阻滯劑和神經(jīng)氨酸酶抑制劑，但存在耐藥性和副作用等問題。由于流感病毒的抗原變異和跨種重組，疫苗也會失去預(yù)防作用。因此，抗流感病毒藥物的研究已迫在眉睫。重樓(Paris polyphylla)是百合科重樓屬植物的泛稱，現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)研究表明，重樓具有抗腫瘤、抗菌、消炎、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、止咳和平喘等作用[1－4]。此外，雖然醫(yī)學(xué)教材《中醫(yī)學(xué)》中明確記載，重樓對亞洲A型流感病毒(influenza A virus，IAV)有較強(qiáng)的抑制作用，但目前國內(nèi)外對重樓的研究仍主要集中于其抗腫瘤作用，未見其抗流感作用的研究報(bào)道。本研究結(jié)合現(xiàn)代提取和純化工藝，從重樓中提取重樓皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ和Ⅶ，觀察其在體內(nèi)外抗IAV的作用，探討重樓皂苷防治流感的作用，為重樓皂苷的臨床試驗(yàn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、細(xì)胞和病毒株

昆明種小鼠，體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半，購自蘭州大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，動物許可證號:SCXK(甘)2009-0004。MDCK細(xì)胞(狗腎傳代細(xì)胞)，由甘肅省疾病預(yù)防控制中心流感病毒實(shí)驗(yàn)室提供。細(xì)胞生長液為含10%胎牛血清的DMEM，維持液為含2%胎牛血清的 DMEM;病毒分離液為含胰蛋白酶40 mg·L－1的MEM，購自Gibco公司。IAV 鼠肺適應(yīng)株(A/PR/8/1934)，由中國疾病預(yù)防控制中心提供，經(jīng)10日齡雞胚尿囊腔接種培養(yǎng)傳代，微量血凝實(shí)驗(yàn)滴定病毒效價(jià)。血凝效價(jià)1∶256的病毒株用于體外實(shí)驗(yàn)，Reed-Muench法測定其半數(shù)感染量(median infective dose，TCID50)為10－4.59/0.1 ml，體外實(shí)驗(yàn)時(shí)病毒攻擊量為100×TCID50[5]。1∶512的病毒株用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，小鼠病毒半數(shù)致死量(LD50)為 10－3.5/0.05 ml，體內(nèi)感染小鼠的病毒攻擊量為10×LD50。

1.2 藥材、試劑和儀器

重樓購于四川成都荷花池中藥材市場，經(jīng)甘肅省藥品檢驗(yàn)所鑒定為百合科重樓屬植物云南重樓〔Paris polyphylla Smith var. yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz.〕的干燥根莖;奧司他韋(oseltamivir)由宜昌長江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字H20065415;重樓皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ和Ⅶ對照品購于中國藥品生物制品檢定所。

胎牛血清:杭州四季青生物工程材料有限公司;胰蛋白酶:福建華燦生物科技有限公司;MTT和二甲亞砜(DMSO):Sigma公司;乙腈為色譜純，美國Fisher公司;乙醇和甲醇等其他試劑:北京化工廠，均為分析純。RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:北京東南儀誠實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司;KP-01真空泵:無錫市四方真空設(shè)備有限公司;柱層析用硅膠，粗孔，60～200目，青島海洋化工廠;高效液相系統(tǒng):美國瓦里安公司;高效液相色譜儀，寧波市鎮(zhèn)海玻璃儀器廠;3517-2型 CO2培養(yǎng)箱:美國 Shellab公司;IX71-F22PH 3型倒置顯微鏡:日本Olympus公司;生物安全柜:上海瑞仰凈化裝備有限公司;Thermo Multiskan MK3型酶標(biāo)儀:芬蘭雷勃公司。

1.3 重樓皂苷的制備

1.3.1 重樓總皂苷的提取

重樓藥材500 g，碎成小塊狀，95%乙醇抽提，濃縮后將提取物溶于水中，濾除不溶物后于水溶液中加石油醚脫脂，萃取除去脂溶性雜質(zhì)后，再用正丁醇進(jìn)一步萃取，減壓濃縮得總皂苷粗品48 g。

1.3.2 總皂苷的硅膠柱層析分離

硅膠800 g，氯仿濕法裝柱，靜置過夜。總皂苷20 g，加甲醇溶解，加硅膠適量攪拌，揮干溶劑，置柱頂端，以氯仿-甲醇-水梯度洗脫，洗脫過程中以薄層色譜法檢查各收集部分，合并相同組分，得2個(gè)主要部分。

1.3.3 單體皂苷的分離

采用反相液相色譜分離得到的2個(gè)部分，甲醇-水系統(tǒng)洗脫，回收甲醇，水液冷凍干燥，得到4個(gè)單體。檢測條件:MPG-ODS型色譜柱(150 mm×4 mm)，流動相為甲醇∶水=80∶20(V/V)，于210 nm處檢測，柱溫為35℃。對以上4個(gè)單體分別進(jìn)行紅外光譜、核磁共振氫譜、核磁共振碳譜和快速原子碰撞質(zhì)譜，并與文獻(xiàn)[6]和[7]進(jìn)行了比對，分別鑒定為重樓皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ和Ⅶ。

1.4 重樓皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ和Ⅶ純度的測定

色 譜 柱 為 ChromsphereC18(4.6 mm ×150 mm，5 μm)不銹鋼柱，流動相為乙腈∶水=85∶15(V/V)，檢測波長為210 nm，柱溫為35℃，流速為 1 ml·min－1，進(jìn)樣量為 20 μl。精密稱取重樓皂苷Ⅰ對照品10.0 mg，置25 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。精密吸取對照品溶液 3，6，9，12，15 和 18 μl按上述色譜條件測定，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，重樓皂苷Ⅰ濃度為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程 Y=5×105X－765776，r=0.999。吸取濃度為 1 mg·L－1的重樓皂苷Ⅰ供試品溶液10 μl，注入高效液相色譜儀，分別測定其峰面積，重復(fù)3次得平均值，根據(jù)回歸方程計(jì)算樣品中重樓皂苷I的純度。重樓皂苷Ⅱ，Ⅵ和Ⅶ的純度測定方法與此相同。

1.5 MTT法[8]測定重樓皂苷和奧司他韋細(xì)胞毒性

將重樓皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ，Ⅶ和奧司他韋用細(xì)胞維持液稀釋成不同濃度待用。將MDCK細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋成細(xì)胞懸液(5×108L－1)，加入 96孔平底培養(yǎng)板內(nèi)，每孔0.1 ml(含5×104細(xì)胞)。再向各孔中分別加入不同濃度的重樓皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ，Ⅶ和奧司他韋0.1 ml，重樓皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ和Ⅶ終濃度為 6.25，12.5，25，50 和100 mg·L－1，奧司他韋的終濃度為 10，20，40，80 和160 mg·L－1，每濃度設(shè) 4 復(fù)孔，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對照組。每天觀察細(xì)胞生長和形態(tài)變化。高濃度藥物組細(xì)胞呈現(xiàn)破碎、收縮、死亡和細(xì)胞量減少等現(xiàn)象;低濃度藥物組細(xì)胞形態(tài)無明顯改變。培養(yǎng)至第5天，測定重樓皂苷和奧司他韋對MDCK細(xì)胞的毒性作用。不能產(chǎn)生細(xì)胞病變的最大藥物濃度視為最大無毒濃度。

1.6 重樓皂苷體外抗IAV活性的測定[9－10]

分別選取各自的最大無毒濃度為最高質(zhì)量濃度，再依次2倍倍比稀釋。重樓皂苷Ⅰ終濃度為50，25，12.5 和6.25 mg·L－1;重樓皂苷Ⅱ終濃度為12.5 和 6.25 mg·L－1;重樓皂苷Ⅵ終濃度為6.25和3.13 mg·L－1;重樓皂苷Ⅶ終濃度為12.5 和6.25 mg·L－1。每個(gè)濃度設(shè) 8 個(gè)復(fù)孔，每孔100 μl。同時(shí)設(shè)病毒對照組(只加病毒，不加藥物)、細(xì)胞對照組(不加病毒，不加藥物)和陽性藥物對照組(加病毒和奧司他韋40 mg·L－1)。每孔加入0.1 ml IAV，IAV量為100×TClD50。將MDCK細(xì)胞懸液2 ×108L－1接種于 96 孔板中，每孔 0.1 ml，培養(yǎng)2 d形成單層細(xì)胞后根據(jù)IAV病毒復(fù)制周期進(jìn)行以下體外抗病毒實(shí)驗(yàn)。

1.6.1 重樓皂苷對IAV的直接滅活作用

將0.1ml不同濃度的重樓皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ和Ⅶ以及奧司他韋分別和0.1ml IAV混合，37℃，5%CO2孵育培養(yǎng) 2 h。棄 0.1 ml混合液后加入0.1 ml上述細(xì)胞懸液，吸附2 h后，棄上清，換用維持液，每孔 0.2 ml，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.6.2 重樓皂苷對IAV吸附、侵入細(xì)胞的阻斷作用

加入上述MDCK細(xì)胞懸液，待長成單層后，分別加入0.1 ml不同濃度重樓皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ和Ⅶ以及奧司他韋，37℃，5%CO2孵育培養(yǎng)1 h后，棄含藥維持液，每孔加入流感病毒液，每孔0.1 ml，吸附2 h，棄病毒液換用維持液，每孔0.2 ml。繼續(xù)培養(yǎng)。

1.6.3 重樓皂苷對IAV增殖的抑制作用

加入上述MDCK細(xì)胞懸液，待長成單層后，先加入0.1 ml IAV，37℃，5%CO2孵育培養(yǎng)1 h后，棄上清液，分別加入0.1 ml不同濃度重樓皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ和Ⅶ以及奧司他韋，37℃，5%CO2孵育培養(yǎng)1 h，補(bǔ)充細(xì)胞維持液 0.1 ml，37℃，CO2恒溫箱繼續(xù)培養(yǎng)。以上各孔待病毒對照孔中細(xì)胞病變達(dá)+++(細(xì)胞病變占單層細(xì)胞的50%～75%)，再進(jìn)行MTT染色，在酶標(biāo)儀490 nm波長處測吸光度值(A)，并計(jì)算各供試品在不同加藥方式下對IAV的抑制率。按相同方法，重復(fù)做3次。抑制率(%)=(A加藥組－A病毒對照組)/A病毒對照組×100%

1.7 重樓皂苷Ⅰ對體內(nèi)感染IAV小鼠的保護(hù)作用

由于最終所制備的重樓皂苷Ⅱ，Ⅵ和Ⅶ樣品量不足以進(jìn)行體內(nèi)抗IAV實(shí)驗(yàn)，故本實(shí)驗(yàn)只觀察重樓皂苷Ⅰ對體內(nèi)感染IAV小鼠的保護(hù)作用[11－12]。根據(jù)對重樓皂苷Ⅰ所進(jìn)行的小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇重樓皂苷Ⅰ的劑量為5和10 mg·kg－1，分別為其 LD50的0.1 和0.2 倍。

將小鼠隨機(jī)分為模型對照、陽性藥物對照奧司他韋3 mg·kg－1及重樓皂苷Ⅰ 5 和10 mg·kg－1組，每組10只，各組在乙醚輕度麻醉下滴鼻法感染10×LD50IAV鼠肺適應(yīng)株50 μl，感染后4 h開始分別ig給予重樓皂苷Ⅰ和奧司他韋，每天分2次給藥，連續(xù)5 d，另設(shè)正常對照組給予等容積無菌蒸餾水。自給藥后每天觀察并記錄小鼠發(fā)病情況(行為、反應(yīng)、運(yùn)動、呼吸、心率、毛發(fā)和體質(zhì)量等指標(biāo))和死亡數(shù)，共觀察14 d。生命延長率(%)=〔(給藥組平均存活天數(shù)－模型對照組平均存活天數(shù))/模型對照組平均存活天數(shù)×100%〕。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 重樓皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ和Ⅶ的純度

采用HPLC法測定分離得到的重樓皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ和Ⅶ的純度分別為95.3%，90.2%，92.4%和86.8%。

2.2 重樓皂苷對MDCK細(xì)胞的毒性

重樓皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ和Ⅶ以及奧司他韋分別低于50，12.5，6.25，12.5 和 40 mg·L－1對靶細(xì)胞MDCK無細(xì)胞毒性，表明以上各化合物在上述濃度范圍內(nèi)對MDCK細(xì)胞無毒性作用(數(shù)據(jù)略)。

2.3 重樓皂苷對IAV的直接滅活作用

從表1可以看出，與正常細(xì)胞對照組相比，病毒對照組A490nm顯著下降(P＜0.01);與病毒對照組比較，重樓皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ和Ⅶ及奧司他韋各濃度組A490nm明顯升高(P＜0.01)，提示重樓皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ和Ⅶ具有良好的體外殺滅IAV的作用。

Tab.1 Direct inactivation of influenza A virus(IAV)by polyphylla saponin(PS)

2.4 重樓皂苷對IAV吸附和侵入細(xì)胞的阻斷作用

從表2可以看出，與正常細(xì)胞對照組相比，病毒對照組A490nm顯著降低(P＜0.01);與病毒對照組相比，重樓皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ和Ⅶ及奧司他韋各濃度組A490nm明顯升高(P＜0.01)，提示重樓皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ和Ⅶ在體外條件下具有阻斷IAV吸附和侵入靶細(xì)胞的作用。

Tab.2 Prevention effect of PS on IAV from adsorbing with MDCK cells

2.5 重樓皂苷對IAV增殖的抑制作用

由表3可見，與正常細(xì)胞對照組相比，病毒對照組A490nm顯著降低(P＜0.01);與病毒對照組相比，重樓皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ和Ⅶ及奧司他韋各濃度組A490nm明顯升高(P＜0.01)，提示重樓皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ和Ⅶ在體外條件下具有抑制IAV在靶細(xì)胞內(nèi)增殖的作用。

2.6 重樓皂苷Ⅰ對IAV感染小鼠的保護(hù)作用

由表4可見，模型對照組小鼠IAV感染6 d后，小鼠活動和采食明顯減少，呼吸和心率加快，平均存活時(shí)間僅為(8.5±0.3)d;重樓皂苷Ⅰ 5和10 mg·kg－1組IAV感染小鼠的死亡數(shù)量明顯減少，平均存活時(shí)間較模型對照組延長(P＜0.01)，生命延長率分別為 49.4%和 55.3%，與奧司他韋3 mg·kg－1組相近，提示重樓皂苷Ⅰ對IAV感染小鼠具有明顯的保護(hù)作用。

Tab.3 Inhibitory effect of PS on reproduction of IAV in MDCK cells

Tab.4 Protection of PSⅠ on mice infected with IAV

3 討論

在短短的幾年里，世界多個(gè)國家先后發(fā)生禽流感病毒跨越種屬屏障，使人們清楚地認(rèn)識到加強(qiáng)和完善對流感這類呼吸道傳染性疾病的預(yù)防、控制和治療具有重大科學(xué)意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值[13]。但由于流感病毒表面抗原的變異，迄今尚無理想的防治藥物。重樓作為一味珍貴的中藥材可用于治療咽喉腫痛、毒蛇咬傷和跌打傷痛等。現(xiàn)代藥理研究表明，該植物還具有止血、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等廣泛的藥理作用，極具潛在的開發(fā)價(jià)值。

本研究從云南重樓中提取、分離出重樓皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ和Ⅶ，經(jīng)HPLC測定其純度分別為95.3%，90.2%，92.4%和86.8%。MTT 法測定其體外抗IAV活性。結(jié)果表明，重樓皂苷Ⅰ 6.25，12.5，25和50 mg·L－1，重樓皂苷Ⅱ 6.25 和 12.5 mg·L－1，重樓皂苷Ⅵ 3.13 和 6.25 mg·L－1及重樓皂苷Ⅶ6.25和12.5 mg·L－1對 IAV 均有顯著的直接滅活作用，尤其重樓皂苷Ⅵ6.25 mg·L－1和重樓皂苷Ⅱ12.5 mg·L－1對 IAV 的抑制率可高達(dá) 97% 和96.3%。其次，重樓皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ和Ⅶ還可通過抑制IAV與MDCK細(xì)胞的吸附和融合，以及抑制靶細(xì)胞內(nèi)的IAV復(fù)制，從而發(fā)揮其抗IAV的作用。至于其作用機(jī)制，尚有待進(jìn)一步研究。

本研究還通過滴鼻感染IAV制備流感病毒小鼠模型，以進(jìn)一步從整體水平驗(yàn)證重樓皂苷抗IAV的作用。由于重樓皂苷Ⅰ提取率和純度相對較高，故只觀察了重樓皂苷Ⅰ對體內(nèi)感染IAV小鼠的保護(hù)作用。研究結(jié)果表明，感染模型對照組小鼠死亡率達(dá)8/10，正常對照組全部存活，表明該模型制備成功。給IAV感染小鼠每天ig給予重樓皂苷Ⅰ5和10 mg·kg－1連續(xù)5 d，從給藥第1天開始至第14天，小鼠死亡率均降至2/10，且存活時(shí)間由(8.5±0.3)d延長到(12.7±0.4)和(13.2±0.5)d，生命延長率分別為 49.4%和 55.3%，與奧司他韋3 mg·kg－1作用相近。上述結(jié)果提示，重樓皂苷Ⅰ體內(nèi)應(yīng)用也具有抗IAV的作用。該作用與奧司他韋3 mg·kg－1作用相近，可能還與其抗炎殺菌和免疫增強(qiáng)等作用有關(guān)。

綜上所述，重樓皂苷Ⅱ，Ⅵ和Ⅶ在體外具有明顯的抗IAV作用，重樓皂苷Ⅰ在體內(nèi)外均具有明顯的抗IAV作用。重樓皂苷Ⅱ，Ⅵ和Ⅶ在體內(nèi)是否同樣具有抗IAV作用尚待進(jìn)一步研究。

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