去甲斑蝥素誘導(dǎo)人卵巢癌SK-OV-3細(xì)胞發(fā)生有絲分裂期阻滯與凋亡

李瑞婧，洪興福，季媛媛，孫震曉

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院生物制藥系，北京 100102)

斑蝥素(cantharidin)是從中藥斑蝥(Mylabris)中提取的一種抗腫瘤活性成分，曾用于原發(fā)性肝癌等的治療，但由于對(duì)泌尿系統(tǒng)強(qiáng)烈的刺激作用，限制了其在臨床上的使用。去甲斑蝥素(norcantharidin，NCTD)系斑蝥素的結(jié)構(gòu)同類物，是在對(duì)斑蝥素構(gòu)效關(guān)系的研究基礎(chǔ)上，由呋喃及順丁烯二酸酐通過(guò)Diles-Alder反應(yīng)催化加氫合成制得，是我國(guó)自行研制生產(chǎn)的新型抗腫瘤藥物。NCTD與斑蝥素相比，缺少1，2位上的兩個(gè)甲基，其毒性作用較低，基本消除了對(duì)泌尿系統(tǒng)的刺激性，保留了抗癌和升高白細(xì)胞的作用[1]，現(xiàn)臨床上主要用于肝癌等惡性腫瘤的治療[1－3]。

前期體外細(xì)胞毒研究發(fā)現(xiàn)，NCTD能夠誘導(dǎo)肝癌等腫瘤細(xì)胞發(fā)生有絲分裂期阻滯和細(xì)胞凋亡[4－6]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)NCTD的抗癌機(jī)制研究主要集中在闡明其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡途徑上，如研究NCTD對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡信號(hào)通路中某些信號(hào)分子，如 Bcl-2、Bax、Bcl-xl、CD95、胱天蛋白酶 9、胱天蛋白酶3、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)、核孤兒受體，即睪丸受體3(testicular receptor 3，TR3)等的影響[7－12]，而對(duì)NCTD引起的細(xì)胞周期阻滯機(jī)制及其與細(xì)胞凋亡的關(guān)系研究較少[13－15]。卵巢癌發(fā)生率近年成上升趨勢(shì)，死亡率高，特效藥少。目前，臨床上尚未使用NCTD治療卵巢癌，有關(guān)NCTD對(duì)卵巢癌細(xì)胞作用的研究工作少見(jiàn)報(bào)道。前期研究工作表明，人卵巢癌SK-OV-3細(xì)胞株為NCTD敏感細(xì)胞株，以其為研究對(duì)象，既可以深入研究NCTD的抗癌作用，如引起細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯機(jī)制及其與細(xì)胞凋亡的關(guān)系，同時(shí)也為將來(lái)臨床上使用NCTD治療卵巢癌提供參考。

1 材料與方法

1.1 化合物、試劑及主要儀器

人卵巢癌SK-OV-3細(xì)胞株，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù);胎牛血清和RPMI 1640培養(yǎng)基、青霉素與鏈霉素，購(gòu)自美國(guó) Gibco公司，胰蛋白酶、NCTD、碘化丙啶(propidium iodide，PI)，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;山羊抗兔二抗Alexa Fluor 488、山羊血清購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;兔抗α微管蛋白，購(gòu)自美國(guó)Epitomics公司，RNaseA，購(gòu)自德國(guó)Merck公司，細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自中國(guó)北京寶賽生物技術(shù)有限公司，其他如甲醇、Triton X-100、姬姆薩染料、二甲亞砜(DMSO)、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)等為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

MCO-18AIC(UV)型飽和濕度培養(yǎng)箱為日本Sanyo公司產(chǎn)品;ECLIPSE TE2000-S型倒置顯微鏡為日本Nikon公司產(chǎn)品;Spectra Max190型酶標(biāo)儀為美國(guó)Molecular Devices公司產(chǎn)品;Epics XL型流式細(xì)胞儀為美國(guó)Beckman Coulter公司產(chǎn)品;ZEISS 510 META型共聚焦顯微鏡為日本Olympus公司產(chǎn)品;TDL-50B型離心機(jī)為中國(guó)Anke公司產(chǎn)品。

1.2 NCTD溶液配制

以雙蒸水溶解并稀釋，NCTD配成60 mol·L－1貯存液，過(guò)濾除菌，分裝后－20℃貯存。每次臨用前新鮮解凍，使用時(shí)用RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋母液至所需各濃度。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

SK-OV-3細(xì)胞采用常規(guī)培養(yǎng)，在含l0%(V/V)滅活胎牛血清(FBS)、青霉素100 kU·L－1和鏈霉素100 mg·L－1的 RPMI 1640 培養(yǎng)液中，37℃，5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d換液傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察[16－17]

取1.3培養(yǎng)的細(xì)胞，按照處理分為正常對(duì)照和NCTD 60 μmol·L－1處理SK-OV-3 細(xì)胞6，12 和24 h組;采用Giemsa染色觀察正常對(duì)照組和NCTD組細(xì)胞的細(xì)胞核及染色體等，隨機(jī)選取1000個(gè)細(xì)胞，計(jì)算單個(gè)核、多個(gè)核及核碎裂、有絲分裂相細(xì)胞所占比例。

1.5 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞存活率[18]

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以每孔1×103個(gè)細(xì)胞終密度接種于96孔培養(yǎng)板，分為空白對(duì)照組(1640培養(yǎng)基)和 NCTD 30，60，120 和 240 μmol·L－1組，分別培養(yǎng)24，48，72 h后，每孔加150 μl MTT工作液，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育6 h，每孔加入DMSO 150 μl，震搖 10 min，在 550 nm 波長(zhǎng)處讀取吸光度值(A)，計(jì)算抑制率，抑制率(%)=(1－NCTD處理組A值/空白對(duì)照組 A值)×100%。利用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)處理軟件回歸分析方法計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)。每個(gè)樣本至少重復(fù)3個(gè)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期阻滯

NCTD 60 μmol·L－1作用于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SK-OV-3細(xì)胞后，分別收集6，12，24 h加藥組和正常對(duì)照組的細(xì)胞，用PBS(pH 7.2)洗滌2次，70%冰乙醇固定，4℃保存過(guò)夜。800×g離心5 min棄去固定液，500 μl PBS重懸，加入 RNaseA至終濃度20 mg·L－1，37℃水浴，45 min。加入 PI染液至終濃度50 mg·L－1，4℃避光染60 min。流式細(xì)胞儀檢測(cè)1×104個(gè)細(xì)胞，ModFit LT軟件分析細(xì)胞周期，上機(jī)前常規(guī)進(jìn)行光路流路校準(zhǔn)。

1.7 間接免疫熒光顯微術(shù)結(jié)合共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)紡錘體形態(tài)的變化

[19]將干凈無(wú)熒光血蓋片置于無(wú)菌六孔板里，按每孔5×105個(gè)密度接種細(xì)胞，培養(yǎng)至細(xì)胞匯合到70%～80%時(shí)，取出血蓋片，清洗后于－20℃甲醇固定20 min，再用 pH 7.4的 0.1%Triton X-100-PBS孵育30 min，山羊血清工作液封閉30 min，加一抗37℃孵育2 h，再用二抗室溫孵育1 h，取出血蓋片，吸去水分，95%甘油封片，共聚焦顯微鏡下觀察。

1.8 流式細(xì)胞儀測(cè)定SK-OV-3細(xì)胞凋亡

分別收集 NCTD 60 μmol·L－1作用 12 和 36 h的SK-OV-3全細(xì)胞及機(jī)械振蕩分離的有絲分裂期細(xì)胞和間期細(xì)胞〔(5～10)×106個(gè)〕，4℃，800×g離心10 min后，棄上清。加入1 ml預(yù)冷的PBS，4℃，800×g離心10 min后，棄上清，重復(fù)洗2次。按照細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書操作[20]，將細(xì)胞重懸于200 μl結(jié)合緩沖液，加入10 μl AnnexinⅤ-FITC 輕輕混勻后，避光室溫反應(yīng)15 min或4℃反應(yīng)30 min，上機(jī)前 5 min 加入300 μl結(jié)合緩沖液以及 5 μl PI，校準(zhǔn)光路后，上機(jī)檢測(cè)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 NCTD對(duì)SK-OV-3存活的影響

如圖1所示，NCTD對(duì)細(xì)胞的抑制率隨濃度增加及作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，表明NCTD對(duì)SK-OV-3細(xì)胞的生長(zhǎng)有抑制作用，且在實(shí)驗(yàn)條件下NCTD對(duì)SK-OV-3細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用呈現(xiàn)時(shí)間(P＜0.05)和濃度依賴性(P＜0.05)。NCTD作用SK-OV-3細(xì)胞24，48 和72 h 的 IC50分別是(261.3±2.4)μmol·L－1，(48.3±1.7)μmol·L－1和(10.9±1.0)μmol·L－1。

Fig.1 Effect of norcantharidin(NCTD)on SK-OV-3 cell survival.±s，n=3.

2.2 NCTD對(duì)SK-OV-3細(xì)胞周期的影響

根據(jù)細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇 NCTD 60 μmol·L－1分別作用于SK-OV-3細(xì)胞0，6，12和24 h，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布，結(jié)果如圖2所示。NCTD作用于SK-OV-3細(xì)胞0，6，12和24 h，細(xì)胞逐漸表現(xiàn)G2/M期阻滯，隨作用時(shí)間延長(zhǎng)阻滯作用增強(qiáng)。

2.3 NCTD對(duì)SK-OV-3細(xì)胞形態(tài)的作用

倒置相差顯微鏡觀察結(jié)果顯示(圖3)，NCTD 60 μmol·L－1作用 6 h(圖 3C)后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯的變化，與正常對(duì)照組(圖 3A，3B)相比，NCTD處理組與部分細(xì)胞收縮、變圓，與周圍細(xì)胞脫離，細(xì)胞間隙增大;12 h后(圖3D)，部分細(xì)胞變圓、浮起，細(xì)胞變圓浮起的數(shù)量隨時(shí)間的延長(zhǎng)也相應(yīng)增加;24 h時(shí)(圖3E，3F)，部分細(xì)胞發(fā)生明顯變形。Giemsa染色(圖4)見(jiàn)與正常對(duì)照組(圖4A)相比，NCTD作用于 SK-OV-3細(xì)胞6 h(圖 4B)、12 h(圖4C)和24 h(圖4D)后，有絲分裂相細(xì)胞數(shù)量明顯增多，部分呈現(xiàn)前中期的形態(tài)特征，部分有絲分裂相阻滯的細(xì)胞中，異常凝集的染色質(zhì)散亂地分布于細(xì)胞質(zhì)中。并且隨著藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)，多個(gè)核細(xì)胞及核碎裂細(xì)胞數(shù)量更為增加。

Fig.2 Effect of NCTD on SK-OV-3 cell cycle by flow cytometry.A1－A3:SK-OV-3 cells at 6，12，and 24 h，respectively;B1 － B3:NCTD 60 μmol·L －1treated for 6，12，and 24 h，respectively.

Fig.3 Effect of NCTD on morphological changes of SK-OV-3 cells.A and B:normal control group，B is a partially enlarged detail of A;C:NCTD 60 μmol·L －1treated for 6 h;D:NCTD 60 μmol·L－1treated for 12 h;E and F:NCTD 60 μmol·L－1 treated for 24 h，F(xiàn) is a partially enlarged detail of E.Arrows stand for apoptosis cells.

2.4 NCTD對(duì)SK-OV-3細(xì)胞內(nèi)微管分布及紡錘體的影響

如圖5和圖6所示，細(xì)胞形態(tài)，正常對(duì)照組中細(xì)胞貼壁良好，鋪展成單層，細(xì)胞呈多角形，顯綠色熒光的微管沿細(xì)胞分布，構(gòu)成胞質(zhì)骨架，顯紅色的細(xì)胞核單一、完整(圖5A1～A3)。圖6A1～A3為對(duì)照組一個(gè)處于有絲分裂中期的細(xì)胞，紡錘體輪廓可見(jiàn)。NCTD組的細(xì)胞變圓，微管排列發(fā)生變化，沒(méi)有明顯極性(圖5B1～B3)，圖6B1～B3為NCTD組一個(gè)處于有絲分裂中期的細(xì)胞，可見(jiàn)細(xì)胞紡錘體出現(xiàn)坍塌，結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯紊亂，圖6C1～C3顯示NCTD組一個(gè)有絲分裂期細(xì)胞出現(xiàn)染色體多極分離的現(xiàn)象。

2.5 NCTD對(duì)SK-OV-3細(xì)胞凋亡的影響

如圖7流式結(jié)果所示，NCTD作用12 h，細(xì)胞凋亡率為20.4%，作用36 h，細(xì)胞凋亡率為62.3%?？梢?jiàn)隨著藥物作用時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞的凋亡率增加。

利用溫和的機(jī)械震蕩法分離NCTD處理12 h的NCTD細(xì)胞，把細(xì)胞分成懸浮和貼壁兩類，分別測(cè)定兩類細(xì)胞中凋亡細(xì)胞的比率，然后分別繼續(xù)作用24 h，即NCTD作用36 h，測(cè)定兩類細(xì)胞中凋亡細(xì)胞的比率(圖8)，同時(shí)通過(guò)Giemsa染色觀察細(xì)胞核的變化，統(tǒng)計(jì)懸浮和貼壁細(xì)胞中單核、多個(gè)核及核碎裂、有絲分裂期細(xì)胞所占比例。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NCTD作用SK-OV-312 h，懸浮細(xì)胞多個(gè)核或核碎裂細(xì)胞所占比例相對(duì)較大，為7.6%，且凋亡細(xì)胞比例達(dá)69.1%，而貼壁細(xì)胞以單個(gè)核細(xì)胞為主，所占比例高達(dá)89.3%，凋亡細(xì)胞占15.3%;Giemsa染色發(fā)現(xiàn)，懸浮細(xì)胞處于分裂期的細(xì)胞占到56.2%，貼壁細(xì)胞中沒(méi)有找到處于分裂期的細(xì)胞。NCTD繼續(xù)作用24 h后，懸浮細(xì)胞組凋亡細(xì)胞比例減少，占47.4%，而貼壁細(xì)胞組凋亡細(xì)胞比例增加，占53.6%。說(shuō)明NCTD誘導(dǎo)SK-OV-3細(xì)胞凋亡可不依賴G2/M期阻滯。

Fig.5 Effect of NCTD onabnormalmicrotubule arrangement of SK-OV-3 cells.A1－A3:SK-OV-3 cells at 8 h group;B1－B3:NCTD 60 μmol·L－1treated for 8 h group.The green fluorescence in A1 and B1 shows the intracellular localization of microtubule.The red fluorescence in A2 and B2 shows the intracellular localization of nuclei.

Fig.6 Effect of NCTD on aberrant mitotic spindles of SK-OV-3 cells.A1－A3:SK-OV-3 cells at 8 h group;B1－B3 and C1 － C3:NCTD 60 μmol·L －1treated for 8 h group，respectively.The green fluorescence in A1，B1 and C1 shows the intracellular localization of microtubules.The red fluorescence in A2，B2 and C2 shows the intracellular localization of nuclei.

Fig.7 Effect of NCTD on SK-OV-3 apoptosis.A:NCTD 60 μmol·L －1treated for 12 h group;B:NCTD 60 μmol·L －1treated for 36 h group.

Fig.8 Effect of NCTD on apoptosis of adherent cells and non-adherent SK-OV-3 cells.A:NCTD 60 μmol·L －1 treated for 12 h-non-adherent group;B:NCTD 60 μmol·L －1treated for 12 h-adherent group;C:NCTD 60 μmol·L －1treated for 36 h-non-adherent group;D:NCTD 60 μmol·L－1treated for 36 hadherent group.

3 討論

研究表明，NCTD低劑量對(duì)SK-OV-3細(xì)胞的生長(zhǎng)就有顯著的抑制作用，且存在著明顯的時(shí)間和劑量依賴性。NCTD可以引起細(xì)胞發(fā)生明顯的G2/M期阻滯，同時(shí)，NCTD影響SK-OV-3細(xì)胞內(nèi)微管的分布，引起紡錘體形成失敗，推測(cè) NCTD引起的SK-OV-3細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯與其干擾細(xì)胞內(nèi)微管及紡錘體組裝有關(guān)。NCTD可以誘導(dǎo)SK-OV-3細(xì)胞凋亡，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NCTD引起的SK-OV-3細(xì)胞凋亡可以不依賴細(xì)胞G2/M期阻滯。

眾多研究發(fā)現(xiàn)，引起細(xì)胞周期阻滯和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是一些抗腫瘤藥物的重要機(jī)制。正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的增殖都依賴于細(xì)胞周期的運(yùn)行，腫瘤治療的中心環(huán)節(jié)就是干擾腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期，從而使腫瘤細(xì)胞增殖速率減慢或誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞走向死亡。流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定結(jié)合細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞在NCTD作用下發(fā)生明顯的G2/M期阻滯，為進(jìn)一步探討細(xì)胞G2/M期阻滯機(jī)制，我們利用間接免疫熒光術(shù)在共聚焦顯微鏡下觀察NCTD對(duì)人卵巢癌SK-OV-3細(xì)胞內(nèi)微管分布和紡錘體形態(tài)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NCTD破壞了SK-OV-3細(xì)胞的正常形態(tài)，細(xì)胞微管排列紊亂，有的細(xì)胞的紡錘體結(jié)構(gòu)出現(xiàn)坍塌，有的細(xì)胞出現(xiàn)染色體多極分離的現(xiàn)象。微管是細(xì)胞的重要組成部分，參與細(xì)胞紡錘體的形成，細(xì)胞由分裂間期進(jìn)入有絲分裂期時(shí)，細(xì)胞質(zhì)中的微管解聚成微管蛋白，微管蛋白在中心體周圍重新裝配為紡錘體，介導(dǎo)染色體的運(yùn)動(dòng);分裂進(jìn)入末期后，紡錘體解聚形成游離的微管蛋白，重新參與微管的組裝[21]。由此可見(jiàn)，微管處于一種動(dòng)態(tài)的聚合-解聚狀態(tài)是非常重要的，任何干擾微管這種動(dòng)態(tài)平衡的行為，均會(huì)引起有絲分裂阻滯，并可能通過(guò)一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[22]。我們體外研究已發(fā)現(xiàn)，NCTD在一定濃度范圍內(nèi)可以抑制微管蛋白聚合，并在 SK-OV-3細(xì)胞中得到驗(yàn)證[23]，由此推測(cè)NCTD引起紡錘體結(jié)構(gòu)的紊亂可能與抑制微管蛋白的聚合有關(guān)。

本研究利用對(duì)凋亡細(xì)胞敏感的AnnexinⅤ和細(xì)胞核特異性染色劑PI雙染試劑盒，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NCTD誘導(dǎo)SK-OV-3細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡率明顯呈時(shí)間依賴性增加。用溫和震蕩的方法把NCTD作用12 h后的SK-OV-3細(xì)胞分成懸浮和貼壁兩組細(xì)胞，分別測(cè)定分離當(dāng)時(shí)和NCTD繼續(xù)作用24 h后兩組細(xì)胞中凋亡細(xì)胞所占比率，發(fā)現(xiàn)沒(méi)有有絲分裂相細(xì)胞的貼壁細(xì)胞組在NCTD作用24 h后凋亡細(xì)胞比例大增，而懸浮組細(xì)胞則有所下降，說(shuō)明NCTD誘導(dǎo)SK-OV-3細(xì)胞凋亡可不依賴細(xì)胞G2/M期阻滯。

有絲分裂災(zāi)變死亡是由于細(xì)胞有絲分裂異?；蚣?xì)胞長(zhǎng)時(shí)間阻滯在有絲分裂期而誘發(fā)的一種細(xì)胞死亡方式，可以在電離輻射、化療藥物或高溫作用下發(fā)生[24]。隨著對(duì)其機(jī)制研究的日漸深入，近年來(lái)提出與細(xì)胞凋亡、壞死、自噬并列為4種主要的細(xì)胞死亡形式，其主要細(xì)胞學(xué)特點(diǎn)為有絲分裂異常致有絲分裂阻滯、中心體異常復(fù)制致形成多極紡錘體、染色體異常凝集等。有絲分裂災(zāi)變死亡的發(fā)生是受到多種信號(hào)通路調(diào)節(jié)的精密過(guò)程，與細(xì)胞周期檢查點(diǎn)異常、中心體或紡錘體結(jié)構(gòu)異常以及DNA損傷存在密切的聯(lián)系[25－26]。本實(shí)驗(yàn)中NCTD通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞有絲分裂期阻滯和細(xì)胞凋亡抑制人卵巢癌SK-OV-3細(xì)胞生長(zhǎng)，而細(xì)胞有絲分裂期阻滯最終可能導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生有絲分裂災(zāi)變死亡。有關(guān)NCTD誘導(dǎo)的SK-OV-3細(xì)胞有絲分裂期阻滯與有絲分裂災(zāi)變死亡及凋亡間的相關(guān)性尚需進(jìn)一步研究闡明。

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