抗抑郁新化合物SIPI-C和SIPI-F對PC12細胞內(nèi)游離鈣離子濃度的影響

周 慧，汪溪潔，翁志潔，李建其，馬 璟

(1.上海醫(yī)藥工業(yè)研究院國家上海新藥安全評價研究中心，上海 201203;2.上海醫(yī)藥工業(yè)研究院化學制藥新技術(shù)中心，上海 200040)

SIPI-A～SIPI-F是根據(jù)藥物作用靶點，定向設(shè)計和合成的系列新型抗抑郁化合物，屬于芳烷醇哌嗪衍生物[1]，6個化合物分別為同一化學結(jié)構(gòu)的不同光學異構(gòu)體，其結(jié)構(gòu)式見圖1。體外研究表明，6個化合物對去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)、5-羥色胺(serotonin，5-HT)和多巴胺(dopamine，DA)均有較強的再攝取抑制作用，在小鼠體內(nèi)表現(xiàn)出顯著的抗抑郁作用[2]。在進行6個化合物的成藥性比較研究時發(fā)現(xiàn)，SIPI-C和SIPI-F組有小鼠出現(xiàn)四肢抽搐等毒性反應(未發(fā)表的數(shù)據(jù))，推測它們可能具有神經(jīng)系統(tǒng)的副作用，其他4個化合物未出現(xiàn)該毒性反應。因此，對化合物SIPI-C和SIPI-F產(chǎn)生神經(jīng)毒性反應的機制進行研究。

Fig.1 Core structure of SIPI-A －SIPI-F.SIPI-A is erythro form racemic;SIPI-B is(1R，2S)-optical isomer;SIPI-C is(1R，2R)-optical isomer;SIPI-D is(1S，2R)-optical isomer;SIPI-E is(1S，2S)-optical isomer;and SIPI-F is threo form racemic.

細胞內(nèi)鈣離子濃度的增高是許多生理病理性過程的一個關(guān)鍵信號，神經(jīng)細胞內(nèi)的鈣離子超載是造成神經(jīng)元損傷的主要原因之一[3]。Shimizu 等[4]發(fā)現(xiàn)，米帕明(imipramine)和米安色林(mianserin)等通過促進細胞內(nèi)鈣離子釋放，濃度依賴性地增加大鼠額皮質(zhì)原代培養(yǎng)神經(jīng)元內(nèi)鈣離子濃度;Joshi等[5]發(fā)現(xiàn)，高濃度的阿米替林(amitriptyline)和地昔帕明(desipramine)可以增加神經(jīng)內(nèi)分泌細胞PC12細胞和人腦星形成膠質(zhì)細胞瘤U-87 MG細胞內(nèi)的鈣離子濃度。在這兩個實驗中，藥物引起細胞內(nèi)鈣離子濃度升高的劑量遠高于其治療劑量，對其藥效學作用的產(chǎn)生意義不大。因此，米帕明、米安色林、阿米替林和地昔帕明對細胞內(nèi)鈣離子的作用可能與其神經(jīng)系統(tǒng)不良反應相關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)，SIPI-C和SIPI-F抑制未分化PC12細胞中的延遲整流鉀電流的 IC50分別為0.6和1.2 μmo·lL－1，在該濃度條件下，SIPI-C和SIPI-F可以使神經(jīng)細胞持續(xù)去極化，從而增加神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和神經(jīng)細胞的興奮性[6]。抑制延遲整流鉀通道可以延緩動作電位的復極化過程，從而使進入細胞的游離鈣離子增多。本研究應用激光共聚焦顯微鏡觀察PC12細胞給予SIPI-C和SIPI-F后，細胞內(nèi)游離鈣離子濃度([Ca2+]i)的動態(tài)變化，研究這兩種化合物對細胞內(nèi)([Ca2+]i)的影響，以探討其可能的神經(jīng)毒性作用及機制。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑及主要儀器

抗抑郁化合物SIPI-A，B，C和F由上海醫(yī)藥工業(yè)研究院提供，純度分別為98.53%，98.36%，99.65%和99.25%。將SIPI-A，B，C和F用二甲亞砜(DMSO)溶解，配制成終濃度為10 mmol·L－1的母液，于－20℃保存，實驗時超純水稀釋到所需濃度。青霉素/鏈霉素，硝苯地平和膠原Ⅰ型均購自Sigma公司;Hank液，D-Hank液，胰蛋白酶，DMEM/F12培養(yǎng)基，胎牛血清和馬血清均購自Gibco公司;DMSO為國產(chǎn)分析純;鈣離子熒光探針(Fluo-3/AM)購自Molecular Probe公司。激光掃描共聚焦顯微鏡LSM-510德國Zeiss產(chǎn)品。

1.2 細胞培養(yǎng)

PC12細胞(購自中科院上海生命科學研究院細胞庫)，置于含有10%馬血清、5%胎牛血清、青霉素100 kU·L－1和鏈霉素 100 mg·L－1的 DMEM/F12培養(yǎng)基中，接種于經(jīng)膠原Ⅰ型包被的培養(yǎng)皿，置CO2培養(yǎng)箱(37℃，5%CO2)中培養(yǎng)過夜。

1.3 實驗分組

將Hank液和D-Hank液分別作為有鈣組和無鈣組的細胞外液，根據(jù)細胞外液有鈣或無鈣以及加入藥物的不同，將實驗分為以下幾部分:①有鈣外液中，SIPI-A，B，C 和 F 10 μmol·L－1對 PC12 細胞[Ca2+]i的影響;② 有鈣外液中，SIPI-C和SIPI-F 1，10 和 100 μmol·L－1對 PC12 細 胞[Ca2+]i的影響;③ 有鈣外液中，同時加入硝苯地平和 SIPI-C 或SIPI-F，觀察硝苯地平 10 μmol·L－1對SIPI-C和SIPI-F 10 μmo·lL－1作用的影響;④ 無鈣外液中SIPI-C和 SIPI-F 10 μmol·L－1對 PC12 細胞[Ca2+]i的影響。

1.4 激光共聚焦顯微鏡檢測[Ca2+]i的動態(tài)變化

待PC12細胞貼壁后，加入熒光離子探針Fluo-3/AM，終濃度為 10 μmol·L－1，在 37℃避光孵育40～50 min。將細胞用 Hank液(有鈣組)或D-Hank液(無鈣組)輕輕沖洗3次，然后加入1 ml相應細胞外液。激光掃描共聚焦顯微鏡采用激發(fā)光488 nm，發(fā)射光505～550 nm，連續(xù)掃描600次，掃描速率為2 s/次。各組開始連續(xù)掃描約50次后加入相應藥物，繼續(xù)掃描，掃描速率為2 s/次，觀察熒光強度的動態(tài)變化，并用ZEISS-SP2工作軟件計算出每次鈣離子的熒光強度。以各時間點的熒光強度與初始熒光強度的比值作為[Ca2+]i的相對值。

2 結(jié)果

2.1 有鈣細胞外液條件下SIPI-A，B，C和F對PC12細胞內(nèi)游離鈣離子濃度的影響

圖2結(jié)果顯示，給予DMSO前后的熒光強度相對值分別為0.96±0.01 和0.92±0.13，提示實驗濃度的DMSO對[Ca2+]i無明顯影響。給予SIPI-A 10 μmo·lL－1后的相對熒光強度降低(14±7)%(n=5，P＜0.01)，提示 SIPI-A 使[Ca2+]i減少。給予 SIPI-B，SIPI-C 和 SIPI-F 10 μmol·L－1后的相對熒光強度升高(27±14)%(n=5，P＜0.05)，(84±9)%(n=5，P＜0.05)和(87±17)%(n=6，P＜0.01)，給藥后熒光強度增加，提示 SIPI-B，SIPI-C和 SIPI-F使[Ca2+]i增加。

Fig.2 Effect of SIPI-A，B，C and F on[Ca2+]iof PC12 cells in Hank's solution.SIPI-A，B，C and F 10 μmol·L －1 were added after successive scanning for 50 times，respectively.The fluorescence intensity at each time point was compared with the basal level before SIPI-A，B，C or F stimulation.The ratio was considered the relative value of [Ca2+]i.±s，n=5 － 6.*P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with the corresponding before dosing group.

2.2 SIPI-C和SIPI-F對PC12細胞[Ca2+]i的影響

2.2.1 有鈣細胞外液

圖3結(jié)果顯示，與給藥前相比，SIPI-C 1，10和100 μmol·L－1作用 100 s 后的相對熒光強度分別升高(10±9)%(n=8，P＜0.05)，(74±39)%(n=5，P＜0.05)和(91±39)%(n=7，P＜0.01)，說明[Ca2+]i顯著增加，并且隨著藥物濃度的增加，SIPI-C對[Ca2+]i的影響逐漸增加。與給藥前相比，SIPI-F 1 μmol·L－1作用 100 s 對[Ca2+]i無顯著影響，SIPI-F 10 和100 μmol·L－1作用100 s 后，相對熒光強度分別升高(55±14)%(n=6，P＜0.01)和(173±10)%(n=16，P＜0.01)，說明[Ca2+]i顯著增加，并且隨著藥物濃度的增加，SIPI-F對[Ca2+]i的影響逐漸增加。圖4結(jié)果顯示，硝苯地平10 μmol·L－1使PC12細胞熒光強度下降，給藥后相對熒光強度降低(20±11)%(n=5，P＜0.05)，提示[Ca2+]i減少。同時給予SIPI-C和硝苯地平或SIPI-F和硝苯地平，PC12細胞熒光強度立即上升達到峰值，隨后下降。給予SIPI-C和硝苯地平后的相對熒光強度升高(24±6)%(n=6，P＜0.05);給予SIPI-F和硝苯地平后的相對熒光強度升高(15±14)%(n=6，P＜0.05)。

Fig.3 Effect of SIPI-C(A1，A2)and SIPI-F(B1，B2)on [Ca2+]iof PC12 cells.±s，n=5 －8.＊＊P＜0.01，compared with the corresponding before dosing group;##P＜0.01，compared with 1 μmol·L－1group;△△P＜0.01，compared with 10 μmo·lL－1group.

Fig.4 Effects of combination of SIPI-C(A)or SIPI-F(B)10 μ mol·L －1with nifedipine 10 μ mol·L －1on [Ca2+]iof PC12 cells.

2.2.2 無鈣細胞外液

給予 SIPI-C 或 SIPI-F 10 μmol·L－1后，熒光強度立即升高達到峰值，幅度較在Hank液中明顯減小(圖5)，給藥后相對熒光強度升高(16±33)%和(18±9)%(n=5，P＜0.01)，隨后熒光強度回到靜息水平。提示在D-Hank液中，SIPI-C或SIPI-F對[Ca2+]i的影響較小。

Fig.5 Effect of SIPI-C(A)and SIPI-F(B)10 μ mol·L －1 on[Ca2+]iof PC12 cells in D-Hank's solution.

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，在Hank液中，SIPI-C和 SIPI-F均可使[Ca2+]i增加，SIPI-A 使[Ca2+]i下降，SIPI-B使[Ca2+]i增加。因此，推測 SIPI-C和SIPI-F引起的[Ca2+]i升高可能與其神經(jīng)毒性反應密切相關(guān)。因長時間的胞內(nèi)鈣離子急劇增多最終導致神經(jīng)細胞膜的通透性增高，細胞腫脹損傷[7]，神經(jīng)細胞內(nèi)的鈣離子超載是造成神經(jīng)元損傷的主要原因。

未分化PC12細胞的鈣通道主要由L型鈣通道組成，只表達小部分的N型鈣通道[8]。有文獻報道，L型鈣通道參與抗抑郁藥舍曲林和馬普替林等引起的[Ca2+]i升高[9－10]。研究發(fā)現(xiàn)，硝苯地平10 μmol·L－1可以完全抑制 PC12 細胞 L 型鈣離子通道[11－12]。本研究結(jié)果顯示，硝苯地平 10 μmol·L－1明顯抑制SIPI-C和SIPI-F引起的細胞外鈣離子內(nèi)流，說明L型鈣離子通道在SIPI-C和SIPI-F引起的反應中發(fā)揮重要作用。同時硝苯地平未完全阻斷PC12細胞[Ca2+]i增加，表明細胞膜上其他類型鈣離子通道或細胞內(nèi)鈣庫釋放可能參與SIPI-C和SIPI-F引起[Ca2+]i升高。本研究發(fā)現(xiàn)，在D-Hank液中，給予 SIPI-C或 SIPI-F后，[Ca2+]i略有增加。與在Hank液中相比，藥物作用后[Ca2+]i增加的幅度明顯下降，提示細胞外鈣離子內(nèi)流和細胞內(nèi)鈣庫釋放可能同時作用引起[Ca2+]i升高。

小鼠急性毒性實驗中(未發(fā)表的數(shù)據(jù))，SIPI-C和SIPI-F產(chǎn)生抽搐毒性反應的劑量分別為1600和800 mg·kg－1，根據(jù)體表面積折算相當于大鼠800和400 mg·kg－1。動物體內(nèi)藥代動力學研究結(jié)果顯示，大鼠灌胃給予SIPI-C和SIPI-F 25 mg·kg－1后，最大血藥濃度分別為 0.59 和 0.70 μmol·L－1。采用腦突觸體對單胺類神經(jīng)遞質(zhì)再攝取的方法研究發(fā)現(xiàn)，SIPI-C和SIPI-F抑制5-HT，NE和DA再攝取的 IC50平均值分別為 1.67 和 0.76 μmol·L－1。在本研究中，1 μmo·lL－1的SIPI-C或SIPI-F對[Ca2+]i影響較小或無影響，10 μmol·L－1的 SIPIC或SIPI-F對[Ca2+]i有明顯影響，此濃度高于SIPI-C或SIPI-F的藥效學劑量。因此，給予SIPI-C或SIPI-F后，[Ca2+]i的變化可能并不參與其抗抑郁作用的發(fā)揮，而與其神經(jīng)系統(tǒng)不良反應密切相關(guān)。

前期研究發(fā)現(xiàn)，SIPI-C和SIPI-F抑制未分化PC12細胞中的延遲整流鉀電流(半數(shù)有效抑制濃度分別為0.64 和 12.05 μmol·L－1)，使神經(jīng)細胞持續(xù)去極化[6]。當細胞去極化達到一定的水平時，就會激活細胞膜電壓依賴性鈣離子通道，從而使細胞外的鈣離子向細胞內(nèi)流動。細胞外鈣離子進入細胞內(nèi)可以引起細胞內(nèi)的鈣庫釋放，細胞內(nèi)鈣庫主要有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、肌漿網(wǎng)以及線粒體等，分別受1，4，5-三磷酸肌醇受體系統(tǒng)[14]和 RyR 系統(tǒng)調(diào)控[15]。SIPI-C 和SIPI-F引起的細胞內(nèi)鈣庫釋放的機制尚有待于進一步研究。

綜上所述，抗抑郁化合物SIPI-C和SIPI-F可以引起[Ca2+]i顯著增加，最終造成神經(jīng)元損傷，推測SIPI-C和SIPI-F對神經(jīng)細胞內(nèi)[Ca2+]i的影響可能是引起神經(jīng)系統(tǒng)的不良反應的機制之一。

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