赫賽汀聯(lián)合順鉑對(duì)人卵巢癌SKOV3裸小鼠移植瘤的抑制作用研究

劉靜芳，湯在祥，胡建銘 (.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇 蘇州 5000;.蘇州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院遺傳流行病與基因組學(xué)研究中心，江蘇 蘇州 5000)

卵巢癌(Ovarian Cancer)是發(fā)生于女性生殖器官的三大惡性腫瘤之一，其死亡率居?jì)D科惡性腫瘤之首。傳統(tǒng)的卵巢癌治療由于腫瘤細(xì)胞基因的不穩(wěn)定性導(dǎo)致對(duì)各種化療藥物的耐藥性逐漸增強(qiáng)，因此晚期卵巢癌的5年生存率一直徘徊在20%～30%。因此尋找新型治療方法具有非常重要的臨床意義。

赫賽汀是針對(duì)HER－2/neu蛋白設(shè)計(jì)的人源化鼠嵌合型抗體，是一種新型、高效、低毒、選擇性強(qiáng)的靶向治療藥物，1998年被美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市，已通過Ⅲ期臨床試驗(yàn)，取得了令人鼓舞的療效［1］。在細(xì)胞水平上，王家菁等人的研究顯示［2］，赫賽汀能有效抑制腎癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，對(duì)瘤細(xì)胞的耐藥性也有一定的抑制作用。胡志全等人將赫賽汀與干擾能聯(lián)合應(yīng)用［3］，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥能有效抑制腎癌細(xì)胞生長(zhǎng)，對(duì)瘤細(xì)胞的耐藥性具有一定逆轉(zhuǎn)作用。司馬玲等人的研究表明［4］，赫賽汀聯(lián)合姜黃素能夠抑制卵巢癌細(xì)胞系SKOV3的增殖，這種抑制作用通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡而實(shí)現(xiàn)。在動(dòng)物模型上，張宇等人發(fā)現(xiàn)赫賽汀對(duì)HER2基因高表達(dá)胃癌細(xì)胞裸鼠移植瘤具有顯著的抑制作用［5］。而柳建軍等人在小鼠上的研究表明，赫賽汀對(duì)HER2陽性的實(shí)驗(yàn)性膀胱腫瘤具有抑制生長(zhǎng)促進(jìn)凋亡的作用［6］。在臨床研究上，杜珂等人的研究表明［7］，赫賽汀聯(lián)合長(zhǎng)春瑞濱治療晚期乳腺癌是有效且安全的治療方案，不良反應(yīng)可耐受，可作為晚期乳腺癌一線方案應(yīng)用。王永鳳等人的臨床研究顯示［8］，與赫賽汀單獨(dú)應(yīng)用和常規(guī)化療相比，赫賽汀聯(lián)合紫杉醇能顯著提高HER22過表達(dá)的轉(zhuǎn)移性乳腺癌的療效，且不增加不良反應(yīng)。也有研究發(fā)現(xiàn)該藥對(duì)過表達(dá)HER－2/neu蛋白的晚期乳腺癌患者有較好的療效，可明顯延長(zhǎng)生存期，與多種化療藥物有良好的協(xié)同效應(yīng)。卵巢癌與乳腺癌相似，HER－2/neu蛋白的過度表達(dá)率為10% ～30%［9］。本研究擬將赫賽汀和順鉑聯(lián)合應(yīng)用，以探討聯(lián)合用藥對(duì)高表達(dá)HER－2的人卵巢癌SKOV3裸鼠移植瘤的腫瘤抑制作用效果。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和試劑:人卵巢癌SKOV3細(xì)胞株(蘇州大學(xué)免疫實(shí)驗(yàn)室提供);BALB/cA裸小鼠，雌性，5～6周齡，體重(18±2.0)g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司所提供，合格證編號(hào):SCXK(滬)2007－0005;赫賽汀(Roche，USA);順鉑:山東齊魯制藥廠;RPMI 1640培養(yǎng)基:美國(guó)Gibco公司;小牛血清:杭州四季青公司;鼠抗人Ki－67單克隆抗體:美國(guó)Santa Cruz公司;鼠抗人NF－kB p65單克隆抗體:美國(guó)Santa Cruz公司;細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)(TUNEL)試劑盒:德國(guó)Roche公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng):細(xì)胞用RPMI 1640培養(yǎng)液加10%優(yōu)質(zhì)胎牛血清，于37℃、5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24～48 h換液1次，當(dāng)細(xì)胞的覆蓋率達(dá)到70% ～80%時(shí)傳代。每天在高倍顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，最后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于細(xì)胞接種。

1.3 動(dòng)物接種:將傳代培養(yǎng)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人卵巢癌SKOV3細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液后在細(xì)胞記數(shù)板上作細(xì)胞記數(shù)，調(diào)整形成活細(xì)胞濃度為4×107/ml的細(xì)胞懸液;在無菌條件下，將該細(xì)胞懸液接種于裸小鼠右側(cè)背部皮下。于接種14天左右，小鼠右側(cè)背部可見長(zhǎng)出大小較為一致的瘤體，即為動(dòng)物腫瘤模型建造成功。

1.4 動(dòng)物分組及給藥方案:將成瘤裸鼠隨機(jī)分成五組:①生理鹽水組(陰性對(duì)照組);②赫賽汀低劑量組;③赫賽汀高劑量組;④順鉑組;⑤赫賽汀高劑量與順鉑聯(lián)合組。每組為15只裸鼠，在普通無菌室的超凈生物層流架中分籠飼養(yǎng)。給藥劑量參考前人和本課題組前期的研究，分別確定為:赫賽汀低劑量組20 mg/kg，赫賽汀高劑量組40 mg/kg，順鉑劑量5 mg/kg，陰性對(duì)照組給予等體積量生理鹽水。各組均為尾靜脈注射給藥，每周1次，連續(xù)給藥6周。其后觀察各組的抑瘤率、生存期。抑瘤率(%)=(對(duì)照組瘤體積―實(shí)驗(yàn)組瘤體積)/對(duì)照組瘤體積×100%。

1.5 免疫組化實(shí)驗(yàn):取各組腫瘤組織給予病理學(xué)檢查及免疫組化染色。Envision二步法:60℃烤片30分鐘后二甲苯脫蠟10 min，2次，梯度濃度乙醇(100%，95%，80%，70%)各5 min，蒸餾水洗5 min，2次，放入抗原修復(fù)液內(nèi)微波修復(fù)10 min，PBS液洗3次，將切片在0.3%過氧化氫－甲醇溶液中室溫下孵育30 min，再用PBS液洗3次，將切片置于濕盒中，滴入一抗，置于37℃孵育箱孵育30 min，PBS液洗3次，滴入Envision溶液，置于37℃孵育箱孵育30 min，PBS液洗3次;DAB顯色15 min;水洗，蘇木精淡染，藍(lán)化，脫水，透明，封固。

1.6 結(jié)果判斷:Ki－67以細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽性細(xì)胞;NF－kB p65以胞核和(或)胞質(zhì)出現(xiàn)黃色、棕黃色或棕褐色顆粒為陽性細(xì)胞。Ki－67、NF－kBp65的染色結(jié)果均以標(biāo)記指數(shù)(labeling index，LI)記錄，方法是任意選取10個(gè)400倍視野，計(jì)數(shù)1000個(gè)腫瘤細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算LI=(陽性細(xì)胞數(shù)/1000)×100。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，組間差異采用方差分析方法進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

在開始用藥當(dāng)天，各組裸鼠移植瘤的體積無差異(P＞0.05)。由表1內(nèi)數(shù)據(jù)可見，陰性對(duì)照組裸鼠瘤體體積增大較快，在14 d后陰性對(duì)照組瘤體體積顯著大于四個(gè)實(shí)驗(yàn)組瘤體體積(P＜0.01);其次是赫賽汀低劑量組，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的增長(zhǎng)速度也較快。然而，赫賽汀高劑量組和順鉑組在后期均有不同程度的降低，赫賽汀高劑量聯(lián)合順鉑組腫瘤體積降低最快，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)與其他組具有顯著差異，表明赫賽汀高劑量聯(lián)合順鉑可有效降低腫瘤體積。在抑瘤率方面，表2結(jié)果顯示:各組的抑瘤率均有不同程度上升，但在28 d后，赫賽汀高劑量聯(lián)合順鉑組抑瘤率顯著高于其他各組。值得一提的是，28 d后，赫賽汀高劑量組和順鉑組的抑瘤率差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。赫賽汀低劑量組的抑瘤率在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均最低，表明赫賽汀高劑量聯(lián)合順鉑能有效抑制腫瘤發(fā)展。

表1 各組用藥后不同時(shí)間腫瘤體積變化(，mm3)

表1 各組用藥后不同時(shí)間腫瘤體積變化(，mm3)

組別 當(dāng)天7 d 14 d 21 28 d 35 d 42 d陰性對(duì)照組 66.7±7.2 187.8±14.2c 608.7±113.3d1363.2±230.6e2850.5±365.7d3402.0±428.6e4040.8±452.6e順鉑 70.8±7.2 129.3±25.4a 383.2±54.0e 608.8±71.3c 500.7±92.9b 399.0±182.1b 388.3±187.1b赫賽汀低劑量組 71.9±7.4 196.0±16.0c 566.7±28.9d 960.0±41.6d 1597.5±478.8c1597.5±478.9d1597.5±478.9d赫賽汀高劑量組 61.8±13.5 149.0±18.0b 313.5±10.4b 320.7±36.2b 444.8±143.0b 437.2±188.0c 420.5±159.7c赫賽汀高劑量加順鉑組 63.7±8.4 138.0±10.4ab 261.3±14.2a 262.0±55.4a 247.8±60.0a 189.7±51.2a 189.7±51.2a

表2 各治療組腫瘤抑制率的比較(，%)

表2 各治療組腫瘤抑制率的比較(，%)

組別7 d 14 d 21 d 28 d 35 d 42 d順鉑 30.5±16.8a 52.6±3.9a 54.1±12.1b 82.5±1.2b 88.5±3.9b 90.57±3.6b赫賽汀低劑量組 4.7±8.1c 5.3±13.2b 27.7±16.9c 47.5±11.6c 52.5±16.6c 59.8±14.7c赫賽汀高劑量組 32.2±14.8a 54.8±5.4a 78.4±16.9a 85.4±4.4b 87.4±3.9b 89.7±3.0b赫賽汀高劑量加順鉑組 26.1±9.8b 56.1±8.8a 80.2±6.7a 91.1±2.9a 94.5±1.0a 95.3±1.0a

3 討論

原癌基因HER－2/neu又稱c－erbB－2癌基因，最先是由Shih等在鼠的神經(jīng)母細(xì)胞瘤中發(fā)現(xiàn)。人類的HER－2/neu癌基因定位于第17號(hào)染色體長(zhǎng)臂q11～q22，編碼分子量為185KD的跨膜糖蛋白，即HER－2/neu受體或稱P185，包括一個(gè)富含半胱氨酸的細(xì)胞外區(qū)，一個(gè)疏水的跨膜區(qū)和一個(gè)細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶區(qū)［10］。目前，通過限制過度表達(dá)的HER－2的異常功能來改善HER－2陽性乳腺癌患者的病程成為一種新的治療策略，人源化抗HER－2單抗赫賽汀是第一個(gè)針對(duì)HER－2陽性轉(zhuǎn)移性乳腺癌的以癌基因?yàn)榘械闹委熓侄?。目前三期臨床結(jié)果證實(shí)，赫賽汀對(duì)HER－2/neu過表達(dá)的腫瘤具有良好療效［11－12］。有文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)過表達(dá)HER－2/neu的轉(zhuǎn)移性乳腺癌，赫賽汀單藥治療的有效率達(dá)15% ～20%，與化療藥物(阿霉素、泰素、環(huán)磷酰胺等)聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，可以明顯提高療效［13］。由于赫賽汀在乳腺癌治療中取得的成功，因此在卵巢癌中針對(duì)HER－2的抗體靶向治療也已經(jīng)逐漸引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的重視。關(guān)于赫賽汀體外抗增殖活性的研究發(fā)現(xiàn)［14－15］，赫賽汀可使HER－2過度表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞系SK－SB3Q生長(zhǎng)受到有效抑制，對(duì)過度表達(dá)HER－2的卵巢癌和乳腺癌細(xì)胞系以及轉(zhuǎn)染HER－2癌基因小鼠細(xì)胞也有生長(zhǎng)抑制作用。

腫瘤細(xì)胞的最基本特征之一是細(xì)胞的失控性生長(zhǎng)。而失控性增生的重要原因之一就是細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制的破壞［16］。細(xì)胞增殖過程由細(xì)胞周期來完成，受細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制嚴(yán)格控制，并決定細(xì)胞的分裂、分化和凋亡等過程。故而，抑制或降低腫瘤細(xì)胞的增殖活性，是腫瘤治療的基本策略之一。Ki－67是反映細(xì)胞增殖的核抗原，在細(xì)胞周期的G1后期和M期細(xì)胞核表達(dá)，其免疫組化染色能檢測(cè)腫瘤的增殖特征，與腫瘤惡性程度、浸潤(rùn)性、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)密切相關(guān)，能準(zhǔn)確反映出腫瘤的性質(zhì)，其表達(dá)水平反映細(xì)胞的實(shí)際增殖程度［17］。細(xì)胞核因子 －kB(nuc1ear factor of kappa B，NF－KB)是癌基因 Rel家族中2個(gè)亞基形成的二聚體，最常見的形式有p65和p50形成的二聚體。它是一種重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，參與多種細(xì)胞增殖、凋亡，具有抗凋亡的作用［18］。近年有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞耐藥現(xiàn)象的產(chǎn)生也與NF－kB的活化有關(guān)［19］。

在本實(shí)驗(yàn)中，對(duì)瘤體組織的Ki－67和NF－kB表達(dá)檢測(cè)結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組中，除赫賽汀低劑量組外，其余各組腫瘤組織Ki－67和NF－kB的LI均低于陰性對(duì)照組組LI，兩兩比較發(fā)現(xiàn):赫賽汀高劑量組腫瘤組織Ki－67和NF－kB的LI與順鉑組腫瘤組織的LI無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;而兩者聯(lián)合組的腫瘤組織Ki－67和NF－kB的LI則明顯低于前兩者單藥組的LI。由此提示，赫賽汀能夠明顯抑制腫瘤的增殖活性，其機(jī)制可能是通過下調(diào)Ki－67、NF－kB的表達(dá)水平，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖;且其與順鉑聯(lián)合使用時(shí)可進(jìn)一步抑制腫瘤的增殖活性，兩者之間具有協(xié)同作用。

綜上所述，抗HER－2人源化單克隆抗體赫賽汀能夠抑制人卵巢癌SKOV3裸小鼠移植瘤的生長(zhǎng)，明顯延長(zhǎng)荷瘤鼠生存時(shí)間，同時(shí)其與常規(guī)化療藥順鉑具有協(xié)同作用。赫賽汀是有望成為高表達(dá)HER－2卵巢癌的靶向性治療藥物;且在臨床作為手術(shù)、化療和放療的輔佐治療上有著廣闊的應(yīng)用前景。

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