十二烷基硫酸鈉誘導(dǎo)銀屑病動(dòng)物模型的建立

張海婧，周琬琪，張 翼，金 晶，陳曉光

銀屑病是一種易復(fù)發(fā)的慢性皮膚病，其發(fā)病與遺傳因素、內(nèi)分泌障礙及免疫功能異常等有關(guān)，但至今尚無(wú)明確定論［1，2］，根治性治療仍是一個(gè)難題。這除了與其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜有關(guān)外，缺乏系統(tǒng)的、快速的篩選和評(píng)價(jià)治療藥物的動(dòng)物模型也是制約對(duì)該病深入研究的一個(gè)重要原因。目前已有一些動(dòng)物模型被用于銀屑病的機(jī)制研究和藥物篩選，如鼠尾模型、誘發(fā)性動(dòng)物模型、皮損移植模型、自發(fā)性或基因突變鼠動(dòng)物模型、轉(zhuǎn)基因鼠動(dòng)物模型和免疫模型等，但均有一定缺陷。例如，只模擬銀屑病的部分病理特征，造模周期長(zhǎng)，費(fèi)用昂貴，不適合大量、快速篩選藥物等［3-6］。十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)是一種實(shí)驗(yàn)常用的試劑，常被用來(lái)作為一種普通的皮膚刺激劑［7，8］。本研究擬利用SDS 建立一種簡(jiǎn)單、快速的銀屑病動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)昆明小鼠，體重30～35 g，雌雄各半。來(lái)源:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所動(dòng)物繁育中心［合格證號(hào):SCXK(京)2009-0007］。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 SDS 購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。蛋白激酶C β(PKCβ)、白介素1β(IL-1 β)、白介素17(IL-17)、白介素23(IL-23)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)抗體購(gòu)自Santa Cruz 公司。ECL發(fā)光液購(gòu)自北京普利萊公司。

1.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法 取昆明小鼠16 只，隨機(jī)分為2組，8 只為模型組，8 只為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)前1 d 全部小鼠背部皮膚去毛。處理方法:10% SDS 2 ml 均勻涂抹模型組小鼠背部皮膚3 cm2，1次/d，共7 d。對(duì)照組小鼠給予蒸餾水同樣涂抹7 d。第8 天眼眶取血后脫頸處死全部小鼠。檢測(cè)指標(biāo)包括游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠涂抹區(qū)皮膚厚度，同時(shí)觀察皮膚性狀［9］;取小鼠涂抹區(qū)皮膚，用甲醛溶液固定后做病理檢查;Western-blot 法測(cè)血清中相關(guān)免疫因子的變化情況。

1.4 Western-blot 檢測(cè) 采用Brandford 法測(cè)定血清蛋白濃度。配制5%的濃縮膠及10%的分離膠。各取含相同蛋白濃度的血清與5 ×SDS 上樣緩沖液混合后，煮沸5 min，冷卻后上樣。電泳結(jié)束后濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。用TBST(0.1% Tween-20;10 mmol/L Tris-Cl，pH7.5;3% BSA ;150 mmol/L NaCl)4℃封閉非特異結(jié)合位點(diǎn)過(guò)夜。用TBST 液洗膜，10 min/次×3次。將膜與稀釋的一抗(1∶500)室溫孵育3 h，TBST 液洗膜，10 min/次×3次。將膜移入二抗(1∶1000 稀釋)，室溫反應(yīng)2 h。TBST 液洗膜，10 min/次，×3次。將膜平放，滴加發(fā)光液，F(xiàn)uJifilm 化學(xué)發(fā)光儀呈像PKCβ、IL-1 β、IL-17、IL-23和TNF-α 等蛋白的表達(dá)情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 10.0 軟件，計(jì)量資料以表示，進(jìn)行t 檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 SDS 誘發(fā)對(duì)小鼠皮膚的影響 對(duì)照組小鼠皮膚厚度為(0.60 ±0.02)mm，模型組小鼠皮膚厚度為(0.87 ±0.33)mm。與對(duì)照組小鼠相比，模型組小鼠涂抹區(qū)的皮膚厚度顯著增厚(P＜0.05)。模型組可見(jiàn)明顯銀屑病病變體征，如皮膚增厚、紅腫和皮下血管增生。

2.2 病理結(jié)果 對(duì)照組小鼠表皮層次較薄，包括基底細(xì)胞層、棘細(xì)胞層和顆粒細(xì)胞層。毛囊自表皮層深入真皮層。真皮層由致密較厚的纖維組織構(gòu)成，散布淋巴管、血管。模型組小鼠表皮層次增多，出現(xiàn)角化過(guò)度和角質(zhì)層增厚，真皮層和皮下層可見(jiàn)毛細(xì)血管擴(kuò)張和充血(圖1)。

圖1 病理檢測(cè)小鼠皮膚變化情況(HE，×50)

2.3 血清學(xué)檢測(cè) 模型組小鼠PKCβ、IL-1 β、TNF-α、IL-23 上調(diào);IL-17 無(wú)明顯變化(圖2)。

圖2 Western-blot 檢測(cè)小鼠血清中免疫因子的變化

3 討 論

銀屑病發(fā)生時(shí)，主要表現(xiàn)為表皮增生的異常和免疫系統(tǒng)的激活［10，11］。在本模型小鼠病變皮膚中可以看到角質(zhì)層明顯增厚、血管增生等銀屑病的典型特征。此外，目前研究認(rèn)為，銀屑病發(fā)生與眾多細(xì)胞因子相關(guān)。一些免疫細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞因子如TNF α、IL-1β、IL-6、IL-17、IL-23 等亦能促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖［12，13］。PKC 能促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞合成轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、IL-I、IL-8、TNFα 等。已有研究證明，PKC 的抑制藥能抑制TPA 所誘導(dǎo)的角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和炎性反應(yīng)［14，15］。本研究中模型組小鼠血清PKCβ、IL-1 β、TNF-α、IL-23 等因子均出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)，這與銀屑病發(fā)生時(shí)的血清學(xué)變化相符。以上結(jié)果表明，SDS 誘發(fā)的小鼠模型可在一定程度上模擬銀屑病發(fā)病時(shí)的特征。

目前較為常用的幾種銀屑病動(dòng)物模型均有一定缺陷，如生物醫(yī)學(xué)的鼠尾模型只能用來(lái)局部測(cè)定藥物對(duì)小鼠角質(zhì)層的影響情況;普萘洛爾誘發(fā)的動(dòng)物模型周期較長(zhǎng)，造模需要3周;皮損移植模型需要臨床皮膚樣品;而自發(fā)性或基因突變鼠動(dòng)物模型、轉(zhuǎn)基因鼠動(dòng)物模型和免疫模型等造價(jià)昂貴。SDS 作為一種較弱的皮膚刺激劑，在體內(nèi)可以引起DC 細(xì)胞活化。因而可產(chǎn)生大量炎性反應(yīng)因子，這些炎性反應(yīng)因子與銀屑病的發(fā)生密切相關(guān)［16-18］。本研究SDS誘發(fā)動(dòng)物模型中，SDS 是一種實(shí)驗(yàn)室常用試劑，昆明小鼠也是一種最常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，兩者均易獲得。此外，本實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)單、造模周期短，在局部皮膚形狀、病理和血清學(xué)等方面也模擬了銀屑病的病變特征，故可以作為一種簡(jiǎn)便、快速的銀屑病模型。

值得一提的是，本造模小鼠的銀屑病體征是可逆的，在造模21 d 后小鼠的皮膚基本恢復(fù)正常，小鼠血清中表達(dá)升高的蛋白也基本恢復(fù)至正常水平(數(shù)據(jù)未列出，待另文詳述)。

綜上所述，10% SDS 誘發(fā)的小鼠銀屑病模型在皮膚外觀、病理學(xué)和血清學(xué)等方面模擬了銀屑病的特征。該模型可以作為一種簡(jiǎn)單、快速的銀屑病藥物篩選模型。

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