臍帶間充質(zhì)干細胞移植治療糖尿病周圍神經(jīng)病變的療效觀察

鄭 培，安沂華，王曉東，滑蓉蓉，朱 巖，母義明

糖尿病周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuropathy，DPN)是糖尿病最常見的慢性并發(fā)癥之一，是導(dǎo)致糖尿病足和其他危重病變的重要危險因素［1］。其發(fā)病機制尚未完全清楚，尚無確切、有效的治療手段。筆者旨在通過臍帶間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUC-MSCs)移植治療，觀察其在移植后1、3、6個月時血糖控制情況、臨床癥狀改善程度及神經(jīng)電生理各指標的變化，并探討HUC-MSCs 移植治療DPN 的可能機制。

1 對象與方法

1.1 對象 選擇2010-11至2011-07 在武警總醫(yī)院細胞移植科住院的DPN 患者32例，其中男22例，女10例;年齡36～66歲，平均(51.13 ±10.37)歲;糖尿病病程2～22年，平均(8.75 ±6.45)年?；颊呔橥獠⒑炇鹬橥鈺PN 診斷標準:(1)有明確的糖尿病史;(2)有四肢末端感覺異常和(或)感覺障礙，膝、跟腱反射減弱或消失;(3)神經(jīng)電生理檢查異常。排除標準:(1)血糖控制差;(2)目前使用其他藥物治療周圍神經(jīng)病變且所使用的藥物有可能影響干細胞療效者;(3)有嚴重下肢潰瘍或壞疽，不適合行下肢介入手術(shù)者;(4)惡性腫瘤;(5)嚴重的心肝腎疾病;(6)患有可導(dǎo)致周圍神經(jīng)病變的其他疾病;(7)同時患血液病、感染未完全控制者。

1.2 治療方法

1.2.1 HUC-MSCs 制備及檢測 采自健康正常孕周的剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦的臍帶約10 cm，無菌條件下分離、培養(yǎng)、傳代。收集第6～8 代的細胞，利用倒置相差顯微鏡和流式細胞儀進行鑒定再用于移植。檢測項目包括:(1)細胞形態(tài)學(xué);(2)細胞表面標記;(3)無菌;(4)支原體;(5)內(nèi)毒素。

1.2.2 干細胞移植方法 完善術(shù)前檢查后，分別行1次靜脈輸注干細胞移植和1次右側(cè)股動脈穿刺胰腺血管插管輸注干細胞移植，兩次間隔3～5 d。

1.2.3 觀察指標 分別于移植前，移植后1、3、6個月時測定并比較患者的用藥情況，空腹血糖、餐后2 h 血糖、糖化血紅蛋白水平，多倫多臨床評分系統(tǒng)(TCSS 評分)［2］、神經(jīng)電生理指標，同時觀察治療過程中的不良反應(yīng)。神經(jīng)電生理檢查設(shè)備選擇俄羅斯生產(chǎn)的Neurosoft Neuron-Spectrum-5(序列號150032)。神經(jīng)傳導(dǎo)測定神經(jīng)包括正中神經(jīng)、尺神經(jīng)、脛后神經(jīng)和腓總神經(jīng)，測定電生理參數(shù)包括感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速度、感覺神經(jīng)動作電位的波幅、運動末梢潛伏期、復(fù)合肌肉動作電位波幅，檢測方法見表1。

表1 電生理指標檢測信息

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0 進行數(shù)據(jù)處理，計量資料采用±s 表示，術(shù)前、術(shù)后1、3、6個月各重復(fù)測量數(shù)據(jù)比較采用重復(fù)測量資料的方差分析;計數(shù)資料使用百分率表示，各時間點百分率的比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

入組32例均順利完成隨訪。

2.1 血糖控制情況 移植后，有6例(18.75%)完全停用降糖藥物，僅通過注意飲食和運動來調(diào)整血糖;有24例(75.00%)胰島素或口服降糖藥物劑量較移植前下降;有2例(6.25%)胰島素或口服降糖藥物劑量與移植前比較無變化。移植后1、3、6個月時患者的空腹血糖、餐后2 h 血糖、糖化血紅蛋白水平均較移植前下降(P 均＜0.05，表2)，其共同的變化趨勢為術(shù)后第1個月下降最明顯，術(shù)后3個月時繼續(xù)下降，但幅度較第1個月時平坦，第6個月時較第1、第3個月時略升高，但仍低于術(shù)前值。

表2 糖尿病周圍神經(jīng)病變患者移植前后空腹血糖、餐后2 h 血糖和糖化血紅蛋白水平比較(n=32;)

表2 糖尿病周圍神經(jīng)病變患者移植前后空腹血糖、餐后2 h 血糖和糖化血紅蛋白水平比較(n=32;)

注:與移植前比較，①P＜0.05

2.2 TCSS 評分 移植前TCSS 評分為(6.81 ±4.37)分，移植后1、3、6個月時分別是(4.25 ±3.22)分、(3.50 ±2.54)分和(3.50 ±2.91)分，移植后各時間點較移植前TCSS 評分均降低(P＜0.01)，說明移植后患者臨床癥狀得到顯著改善。

2.3 神經(jīng)電生理變化 患者術(shù)前正中神經(jīng)、尺神經(jīng)、脛后神經(jīng)和腓總神經(jīng)感覺神經(jīng)傳導(dǎo)引出率分別為100%、100%、18.75%(6/32)和0%(0/32);治療后，脛后神經(jīng)和腓總神經(jīng)感覺傳導(dǎo)引出率分別升至37.50%(12/32)和25.00%(8/32)，與治療前比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。不同時間點正中神經(jīng)的運動末梢潛伏期、尺神經(jīng)的感覺傳導(dǎo)速度和運動末梢潛伏期改善均具有統(tǒng)計學(xué)差異(P 均＜0.05，表3)，變化趨勢為術(shù)后第1個月改善最明顯，6個月內(nèi)均有持續(xù)療效。

2.4 不良反應(yīng) 有4例(12.8%)于介入術(shù)后第2天發(fā)現(xiàn)術(shù)區(qū)有皮下滲血，直徑6～10 cm，囑患者適當減少下肢運動，5～7 d 自行消退，考慮與介入術(shù)后過早活動有關(guān);有2例(6.25%)于臍帶干細胞移植術(shù)后24 h 內(nèi)有一過性中、低熱(＜38.0℃)，給予物理降溫后可降至正常?；颊咦≡浩陂g及隨訪過程中均進行體溫、心率、呼吸、血壓等一般狀況檢查及血生化檢查，均未見異常。

表3 糖尿病周圍神經(jīng)病變患者移植前后神經(jīng)電生理指標變化情況 (n=32;)

表3 糖尿病周圍神經(jīng)病變患者移植前后神經(jīng)電生理指標變化情況 (n=32;)

注:與移植前比較，①P＜0.05

3 討 論

DPN 是糖尿病最常見的慢性并發(fā)癥之一，其發(fā)病率高，危害性大，是導(dǎo)致糖尿病患者喪失勞動能力的主要原因之一。DPN 發(fā)病機制還不完全清楚，目前普遍認為DPN 發(fā)生與以下因素共同作用有關(guān):(1)代謝紊亂，高血糖環(huán)境下線粒體內(nèi)電子傳遞鏈過氧化物產(chǎn)生過量，從而導(dǎo)致多元醇通路的激活、糖基化終末產(chǎn)物的形成、蛋白激酶C 通路和氨基己糖通路的激活［3，4］;(2)微血管病變，糖尿病影響小血管內(nèi)皮細胞，使基底膜變性與玻璃樣變，血流減慢，導(dǎo)致小血管閉塞、神經(jīng)缺血、缺氧;(3)神經(jīng)生長因子(NGF)減少;(4)過氧化物和自由基損傷以及必需脂肪酸代謝異常等其他因素［5］。臨床上對DPN 尚無特異性治療方法，本研究旨在應(yīng)用HUC-MSCs 移植，觀察能否改善周圍神經(jīng)病變的癥狀和神經(jīng)傳導(dǎo)速度，探索治療DPN 的新方法。

本研究結(jié)果顯示，治療后患者正中神經(jīng)的運動末梢潛伏期、尺神經(jīng)的感覺傳導(dǎo)速度和運動末梢潛伏期，脛后神經(jīng)感覺傳導(dǎo)引出率、腓總神經(jīng)的感覺傳導(dǎo)引出率和運動末梢潛伏期較治療前均有所改善，證明HUC-MSCs 移植可以改善DPN 各周圍神經(jīng)的神經(jīng)傳導(dǎo)。在神經(jīng)電生理中，神經(jīng)傳導(dǎo)速度降低主要由神經(jīng)節(jié)段脫髓鞘引起，而動作電位波幅下降主要由神經(jīng)節(jié)段軸索變性引起，兩者可相互獨立［6］。在本研究中，所測各神經(jīng)的波幅變化均無統(tǒng)計學(xué)意義，可能因HUC-MSCs 主要通過改善周圍神經(jīng)的髓鞘脫失發(fā)揮作用，對軸索變性的影響不大，從而造成波幅變化無統(tǒng)計學(xué)差異，但這仍需要進一步研究證實。

本研究還顯示，治療后空腹血糖、餐后2 h 血糖、糖化血紅蛋白、TCSS 評分均較治療前好轉(zhuǎn)，說明患者臨床癥狀及血糖情況同樣得到明顯改善。通過對移植后1、3、6個月進行隨訪，各觀察指標的總體變化趨勢為術(shù)后第1個月改善最明顯，術(shù)后6個月內(nèi)均有持續(xù)療效。本研究中，所采用的移植方式不同于以往報道的按固定間距下肢肌肉注射的干細胞移植方法［7］，主要考慮到多點肌肉注射痛苦大，感染概率高，且術(shù)后造成患肢脹痛、水腫加重的可能性大。采用靜脈輸注干細胞創(chuàng)傷小、不良反應(yīng)小，干細胞可以到達四肢最遠端，而右側(cè)股動脈穿刺胰腺血管插管干細胞移植則是通過臨床上已經(jīng)相當成熟的介入技術(shù)，直接將干細胞輸送到胰腺血管，修復(fù)胰島功能。

近年來，大量臨床與動物實驗均證實將自體骨髓或外周血干細胞移植入缺血肢體后，在缺血、缺氧環(huán)境下可誘導(dǎo)生成血管內(nèi)皮細胞、表皮細胞等，形成新生毛細血管、再生表皮，并逐漸分化并形成新的毛細血管，促進血管再生［8］;同時干細胞可反應(yīng)性分泌多種生長因子［9，10］，如血管內(nèi)皮生長因子、胰島素樣生長因子、堿性成纖維細胞生長因子和神經(jīng)生長因子等，這些因子能產(chǎn)生神經(jīng)保護作用和促進局部微血管再生，支持新生血管形成、神經(jīng)再生和重構(gòu)，從而起到治療神經(jīng)損傷的作用，最終可改善和恢復(fù)患肢血流，提高患肢皮膚溫度，緩解下肢疼痛及冷、涼感覺，使?jié)兠婵s小或愈合［11，12］，提示干細胞移植可能從整合再生、神經(jīng)營養(yǎng)、改善神經(jīng)微循環(huán)等途徑治療DPN。但骨髓動員和采集為有創(chuàng)操作，對采集環(huán)境、身體條件、心理接受程度要求較高，且糖尿病下肢缺血患者多為年齡偏大的老年患者，不論是其自體骨髓還是外周血來源的干細胞，其數(shù)量、增殖、分化、黏附和成血管能力均降低［13］，可能會影響治療效果。與骨髓和自體外周血干細胞相比，臍帶中含有豐富的間充質(zhì)干細胞及造血干細胞，間充質(zhì)干細胞更原始，分化擴增能力更強，誘導(dǎo)分化后獲得足量干細胞且向血管、骨、肌肉、神經(jīng)分化能力更強大，具有更加有效的干細胞潛能，且HUC-MSCs 采集簡單、資源豐富，不存在倫理爭議，故HUC-MSCs無論是從來源上還是從生物學(xué)特性及臨床效果上均優(yōu)于骨髓及外周血干細胞［14］。

本研究尚有以下局限性:樣本量小，未設(shè)對照組進行比較，沒能從組織學(xué)方面進一步研究，長期療效仍需進一步隨訪、觀察?？傊狙芯拷Y(jié)果表明，應(yīng)用HUC-MSCs 移植治療糖尿病周圍神經(jīng)病變安全、有效、可行，是臨床治療糖尿病周圍神經(jīng)病變的一條新思路。

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