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    血清MicroRNA-122 作為膿毒癥診斷特異性標(biāo)志物的研究

    2013-11-08 03:34:16王慧娟蘇龍翔賈艷紅解立新
    武警醫(yī)學(xué) 2013年5期
    關(guān)鍵詞:血清研究

    鄧 婕 ,王慧娟,蘇龍翔,張 鑫,肖 坤,賈艷紅,解立新

    膿毒癥是一種由各種病原微生物感染和全身炎性反應(yīng)綜合征所致的臨床綜合征,可進(jìn)一步發(fā)展為膿毒癥休克和多器官功能障礙(MODS)[1]。早期診斷膿毒癥,盡早準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)膿毒癥的病情嚴(yán)重度和判斷預(yù)后,及時(shí)干預(yù)治療,可減少早期膿毒癥向嚴(yán)重膿毒癥發(fā)展的概率,亦是進(jìn)一步降低膿毒癥患者病死率的關(guān)鍵。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)微小RNA(miRNA)可以作為診斷膿毒癥的一個(gè)新的生物標(biāo)記物[2],并且miRNA-122 可從基因轉(zhuǎn)錄水平判斷膿毒癥病情的預(yù)后情況[3]。但是,對(duì)于miRNA-122在膿毒癥中的動(dòng)態(tài)表達(dá)國(guó)內(nèi)外并未有報(bào)道。因此,筆者選擇觀察膿毒癥患者血清中的miRNA-122 表達(dá)量的動(dòng)態(tài)變化情況,探討它與膿毒癥嚴(yán)重程度的關(guān)系,分析血清miRNA-122 是否可以作為一種新的血清學(xué)標(biāo)志物,用于膿毒癥早期診斷。

    1 對(duì)象與方法

    1.1 對(duì)象 選擇2011-10至2012-05 本院急診重癥監(jiān)護(hù)病房(EICU)、呼吸重癥監(jiān)護(hù)病房(RICU)及外科重癥監(jiān)護(hù)病房(SICU)滿足膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)的住院患者52例,其中一般膿毒癥23例,重癥膿毒癥29例。診斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)1991年ACCP/SCCM 聯(lián)席會(huì)議對(duì)SIRS、膿毒癥(sepsis)、嚴(yán)重膿毒癥(severe sepsis)、膿毒性休克(septic shock)的定義[4],并參照2002年“國(guó)際膿毒癥定義會(huì)議”的定義和診斷標(biāo)準(zhǔn)[1];排除標(biāo)準(zhǔn)如下:年齡<18歲;入組24 h 內(nèi)死亡者;粒細(xì)胞缺乏(<0.5 ×109/L);合并HIV 感染。另外,選擇健康人23名作為健康對(duì)照組。本研究納入的52例膿毒癥患者年齡(56.2 ±19.3)歲,范圍19~87歲,健康對(duì)照組年齡(59.2 ±18.3)歲,范圍26~82歲,兩組年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.52 4)。該研究已經(jīng)通過(guò)本院倫理委員會(huì)審批,批號(hào)20110824-005;Clinical Trial 注冊(cè)號(hào)NCT01459822。所有納入研究的對(duì)象均獲得充分告知并簽署知情同意書(shū)。

    1.2 數(shù)據(jù)采集 記錄患者的基本臨床信息,包括姓名、性別、年齡、原有慢性疾病史、入院主因、轉(zhuǎn)歸(28 d 生存或死亡)。記錄患者入組第1 天的白細(xì)胞計(jì)數(shù)、C 反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)、急性生理與慢性健康評(píng)分(acute physiology and chronic health evaluationⅡ,APACHEⅡ)及序貫器官衰竭估計(jì)(sequential organ failure assessment,SOFA)評(píng)分。記錄健康對(duì)照組的性別、年齡。

    1.3 實(shí)驗(yàn)主要試劑與儀器 mirVana miRNA 提取試劑盒(美國(guó)Ambio 公司),miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒(中國(guó)天根生化公司),miRcute miRNA 熒光定量檢測(cè)試劑盒(中國(guó)天根生化公司),MJ Mini 梯度PCR 儀(美國(guó)Biorad 公司),IQ5 PCR實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)系統(tǒng)(美國(guó)Biorad 公司)。

    1.4 RNA 提取及RT-PCR 患者及健康對(duì)照組采集靜脈外周血,外周血經(jīng)3000 r/min 離心分離出血清置-80℃冰箱保存待測(cè)。按照mirVana PARIS 試劑盒的使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行血清總RNA 的提取。提取的總RNA 進(jìn)行下一步的反轉(zhuǎn)錄,配制RT 反應(yīng)體系,充分混勻后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(參考反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū))。參考天根生化PCR 試劑盒說(shuō)明書(shū),確定PCR 的反應(yīng)體系。反應(yīng)總體積為20 μl。反應(yīng)體系為:2 ×miRcute miRNA 預(yù)混料:10.00 μl;RT 反應(yīng)產(chǎn)物:2.00 μl(2.00 μg);自備引物:0.40 μl;反向引物:0.40 μl;DEPC 水:7.20 μl。利用IQ5 PCR 實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)儀上進(jìn)行miRNA 定量檢測(cè)。循環(huán)參數(shù)設(shè)定為:95℃,10 min 活化Taq 酶,95℃,15 s,60℃,1 min,進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。以5S rRNA為內(nèi)參,miRNA 的表達(dá)量表示為(2-△Ct),計(jì)算公式如下:-△Ct=CtmiRNA-Ct5S。

    1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件,所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn),正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示,多組間均數(shù)比較采用方差分析,兩組間比較采用成組t 檢驗(yàn)。非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)及四分位數(shù)表示,兩組間均數(shù)比較采用Mann-Whitney U 檢驗(yàn)。為檢測(cè)指標(biāo)的診斷價(jià)值繪制了ROC 曲線,并計(jì)算了曲線下面積。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 一般資料 52例膿毒癥患者SOFA 評(píng)分為4~19 分,平均為(8.4 ±3.2)分,APACHE Ⅱ評(píng)分范圍6~32 分,平均為(16.3 ±6.3)分,28 d 病死率為55.8%(29/52)。一般膿毒癥組與重癥膿毒癥組之間年齡(P=0.450)、性別(P=0.086)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而SOFA 評(píng)分(P=0.001)、APECHE Ⅱ評(píng)分(P=0.010)及慢性腎臟疾病(P=0.008),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

    表1 52例膿毒癥患者入組時(shí)的一般資料 ()

    表1 52例膿毒癥患者入組時(shí)的一般資料 ()

    2.2 膿毒癥患者血清中miRNA-122 的診斷價(jià)值在14 d 病程中,膿毒癥組在每一時(shí)間點(diǎn)的miRNA-122 表達(dá)量(以2-ΔCt表示)與健康對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。健康組的血清miRNA-122 的表達(dá)量范圍是3.450 (1.374,11.146),膿毒癥組的血清miRNA-122 的表達(dá)量范圍見(jiàn)表2。

    表2 膿毒癥組血清miRNA-122 表達(dá)量在不同時(shí)間點(diǎn)與健康對(duì)照組的比較(中位數(shù);第25 百分位數(shù),第75 百分位數(shù))

    為了檢測(cè)miRNA-122 早期診斷膿毒癥的價(jià)值,筆者繪制了ROC 曲線(圖1),入組第1 天的miRNA-122 診斷膿毒癥的曲線下面積是0.774(95%CI,0.670-0.879)。當(dāng)miRNA-122 的相對(duì)表達(dá)量是0.710 時(shí),miRNA-122 診斷膿毒癥的特異性是95.7%,敏感性是53.8%。

    圖1 MiRNA-122 早期診斷膿毒癥ROC 曲線

    2.3 不同病情嚴(yán)重程度的膿毒癥患者血清中miRNA-122 水平的變化 一般膿毒癥組23例和重癥膿毒癥組29例(包括嚴(yán)重膿毒癥患者21例與膿毒癥休克患者8例)比較,兩組間miRNA-122 的表達(dá)水平在各時(shí)間點(diǎn)上存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01),且重癥膿毒癥組的表達(dá)量在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均高于一般膿毒癥組,而各組在組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。

    表3 一般膿毒癥組與重癥膿毒癥組的血清miRNA-122 的表達(dá)量范圍(中位數(shù);第25 百分位數(shù),第75 百分位數(shù))

    3 討 論

    膿毒癥是感染引起的十分復(fù)雜的炎性反應(yīng),是多種炎性因子共同作用的結(jié)果,也是重癥監(jiān)護(hù)病房患者死亡的主要原因。所以膿毒癥的早期診斷和治療對(duì)患者的預(yù)后至關(guān)重要。近年來(lái),對(duì)發(fā)現(xiàn)及確診膿毒癥的新型生物標(biāo)志物及其相關(guān)功能的研究一直是各國(guó)學(xué)者們研究的熱點(diǎn)。

    MiRNA 是一種長(zhǎng)約22nt 的微小分子RNA,通過(guò)直接作用于信使RNA(mRNA)或者通過(guò)抑制蛋白質(zhì)的翻譯來(lái)調(diào)節(jié)蛋白編碼基因的表達(dá)[5]。第1 篇報(bào)道的關(guān)于miRNA 可作為診斷膿毒癥的新的生物標(biāo)志物的文獻(xiàn),是Vasilescu 等[6]發(fā)現(xiàn)和證實(shí)了白細(xì)胞和血漿中miRNA-150 水平同膿毒癥的預(yù)后情況相關(guān),而且它可以作為早期診斷膿毒癥的一項(xiàng)指標(biāo)。而Wang Jiafeng 等[7]的研究則證實(shí)了miRNA-146a和miRNA-223 可以區(qū)分非感染SIRS 患者同膿毒癥患者,也說(shuō)明這兩種miRNAs 可以作為膿毒癥患者的血清標(biāo)志物。

    本研究中,通過(guò)比較膿毒癥患者入組后不同時(shí)間點(diǎn)與健康人群血清中miRNA-122 表達(dá)量,說(shuō)明膿毒癥患者的血清miRNA-122 表達(dá)量相對(duì)健康人群是下降的。用入組第1 天的miRNA 表達(dá)量做ROC 診斷分析得出其診斷的特異性是95.7%,敏感性是53.8%,這些數(shù)據(jù)都說(shuō)明血清miRNA-122 可以作為早期膿毒癥的特異性診斷標(biāo)志物。本研究中,嚴(yán)重膿毒癥組的miRNA-122 表達(dá)量在各個(gè)觀測(cè)時(shí)間點(diǎn)都高于一般膿毒癥組,間接說(shuō)明miRNA-122 表達(dá)量預(yù)警膿毒癥患者疾病嚴(yán)重程度方面具有積極的臨床意義。

    在筆者前期的研究中,雖然證實(shí)了血清miRNA-122 表達(dá)量在膿毒癥生存組和膿毒癥死亡組中存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,并且在死亡組中相對(duì)高表達(dá),但是并未驗(yàn)證其與膿毒癥嚴(yán)重程度的相關(guān)性,也未對(duì)miRMA-122 能否診斷膿毒癥做出研究[8]。本實(shí)驗(yàn)則發(fā)現(xiàn)了血清miRNA-122 的表達(dá)量在膿毒癥患者入組后的14 d 病程中各時(shí)間點(diǎn)與健康對(duì)照組均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,ROC 診斷試驗(yàn)結(jié)果也說(shuō)明血清miRNA-122 可作為膿毒癥的新型生物學(xué)診斷指標(biāo)。MiRNA-122 的表達(dá)量在重癥膿毒癥組表達(dá)高于一般膿毒癥組。

    膿毒癥可導(dǎo)致強(qiáng)烈的免疫抑制和機(jī)體損壞[9-11]。有研究顯示,在膿毒癥中陽(yáng)離子氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(cationic amino acid transporter,CAT-1)的mRNA 表達(dá)水平升高了86%[12]。而Chang 等[13]研究發(fā)現(xiàn)CAT-1 是miR-122 最重要的作用靶點(diǎn)之一。MiRNA-122 中有8個(gè)CAT-l 的mRNA 潛在作用位點(diǎn),2個(gè)位于5'非編碼區(qū);6個(gè)位于γ 端非翻譯區(qū),其中3個(gè)能與CAT-1 的核苷酸序列結(jié)合,來(lái)抑制蛋白質(zhì)的合成,從而影響肝功能,具體作用機(jī)制并不清楚。在膿毒癥中,免疫抑制及機(jī)體損壞等一系列復(fù)雜的炎性反應(yīng)可能阻斷了miRNA-122 和靶基因mRNA 結(jié)合通路,導(dǎo)致CAT-1 表達(dá)增加。本研究雖然證實(shí)血清miRNA-122 的表達(dá)量在重癥膿毒癥組較一般膿毒癥組高,但未對(duì)其在膿毒癥中的功能及機(jī)制做進(jìn)一步研究,若后期能對(duì)其相關(guān)蛋白表達(dá)及靶基因深入研究,將為膿毒癥治療開(kāi)啟新天地。

    本研究的不足之處:(1)樣本量小。受膿毒癥患者樣本量及死亡病例限制,并沒(méi)有分析出這幾種miRNA 同臨床常用指標(biāo)APACHEⅡ評(píng)分,SOFA 評(píng)分,CRP 和PCT 之間的關(guān)系;(2)臨床上絕大多數(shù)的膿毒癥患者在入ICU 之前已經(jīng)過(guò)大量的藥物治療,因此這幾種miRNA 與膿毒癥嚴(yán)重程度的相關(guān)性尚需要嚴(yán)格控制患者入選條件并大量的樣本證實(shí)。

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