血清MicroRNA-122 作為膿毒癥診斷特異性標志物的研究

鄧 婕 ，王慧娟，蘇龍翔，張 鑫，肖 坤，賈艷紅，解立新

膿毒癥是一種由各種病原微生物感染和全身炎性反應綜合征所致的臨床綜合征，可進一步發(fā)展為膿毒癥休克和多器官功能障礙(MODS)［1］。早期診斷膿毒癥，盡早準確地評價膿毒癥的病情嚴重度和判斷預后，及時干預治療，可減少早期膿毒癥向嚴重膿毒癥發(fā)展的概率，亦是進一步降低膿毒癥患者病死率的關鍵。近年來有研究發(fā)現微小RNA(miRNA)可以作為診斷膿毒癥的一個新的生物標記物［2］，并且miRNA-122 可從基因轉錄水平判斷膿毒癥病情的預后情況［3］。但是，對于miRNA-122在膿毒癥中的動態(tài)表達國內外并未有報道。因此，筆者選擇觀察膿毒癥患者血清中的miRNA-122 表達量的動態(tài)變化情況，探討它與膿毒癥嚴重程度的關系，分析血清miRNA-122 是否可以作為一種新的血清學標志物，用于膿毒癥早期診斷。

1 對象與方法

1.1 對象 選擇2011-10至2012-05 本院急診重癥監(jiān)護病房(EICU)、呼吸重癥監(jiān)護病房(RICU)及外科重癥監(jiān)護病房(SICU)滿足膿毒癥診斷標準的住院患者52例，其中一般膿毒癥23例，重癥膿毒癥29例。診斷標準根據1991年ACCP/SCCM 聯席會議對SIRS、膿毒癥(sepsis)、嚴重膿毒癥(severe sepsis)、膿毒性休克(septic shock)的定義［4］，并參照2002年“國際膿毒癥定義會議”的定義和診斷標準［1］;排除標準如下:年齡＜18歲;入組24 h 內死亡者;粒細胞缺乏(＜0.5 ×109/L);合并HIV 感染。另外，選擇健康人23名作為健康對照組。本研究納入的52例膿毒癥患者年齡(56.2 ±19.3)歲，范圍19～87歲，健康對照組年齡(59.2 ±18.3)歲，范圍26～82歲，兩組年齡差異無統(tǒng)計學意義(P=0.52 4)。該研究已經通過本院倫理委員會審批，批號20110824-005;Clinical Trial 注冊號NCT01459822。所有納入研究的對象均獲得充分告知并簽署知情同意書。

1.2 數據采集 記錄患者的基本臨床信息，包括姓名、性別、年齡、原有慢性疾病史、入院主因、轉歸(28 d 生存或死亡)。記錄患者入組第1 天的白細胞計數、C 反應蛋白(C-reactive protein，CRP)、急性生理與慢性健康評分(acute physiology and chronic health evaluationⅡ，APACHEⅡ)及序貫器官衰竭估計(sequential organ failure assessment，SOFA)評分。記錄健康對照組的性別、年齡。

1.3 實驗主要試劑與儀器 mirVana miRNA 提取試劑盒(美國Ambio 公司)，miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒(中國天根生化公司)，miRcute miRNA 熒光定量檢測試劑盒(中國天根生化公司)，MJ Mini 梯度PCR 儀(美國Biorad 公司)，IQ5 PCR實時熒光定量檢測系統(tǒng)(美國Biorad 公司)。

1.4 RNA 提取及RT-PCR 患者及健康對照組采集靜脈外周血，外周血經3000 r/min 離心分離出血清置-80℃冰箱保存待測。按照mirVana PARIS 試劑盒的使用說明書進行血清總RNA 的提取。提取的總RNA 進行下一步的反轉錄，配制RT 反應體系，充分混勻后進行反轉錄(參考反轉錄試劑盒說明書)。參考天根生化PCR 試劑盒說明書，確定PCR 的反應體系。反應總體積為20 μl。反應體系為:2 ×miRcute miRNA 預混料:10.00 μl;RT 反應產物:2.00 μl(2.00 μg);自備引物:0.40 μl;反向引物:0.40 μl;DEPC 水:7.20 μl。利用IQ5 PCR 實時熒光定量檢測儀上進行miRNA 定量檢測。循環(huán)參數設定為:95℃，10 min 活化Taq 酶，95℃，15 s，60℃，1 min，進行40個循環(huán)。以5S rRNA為內參，miRNA 的表達量表示為(2-△Ct)，計算公式如下:-△Ct=CtmiRNA-Ct5S。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件，所有數據均進行正態(tài)性檢驗，正態(tài)分布的計量資料以表示，多組間均數比較采用方差分析，兩組間比較采用成組t 檢驗。非正態(tài)分布的計量資料以中位數及四分位數表示，兩組間均數比較采用Mann-Whitney U 檢驗。為檢測指標的診斷價值繪制了ROC 曲線，并計算了曲線下面積。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 一般資料 52例膿毒癥患者SOFA 評分為4～19 分，平均為(8.4 ±3.2)分，APACHE Ⅱ評分范圍6～32 分，平均為(16.3 ±6.3)分，28 d 病死率為55.8%(29/52)。一般膿毒癥組與重癥膿毒癥組之間年齡(P=0.450)、性別(P=0.086)差異無統(tǒng)計學意義，而SOFA 評分(P=0.001)、APECHE Ⅱ評分(P=0.010)及慢性腎臟疾病(P=0.008)，差異有統(tǒng)計學意義(表1)。

表1 52例膿毒癥患者入組時的一般資料 ()

表1 52例膿毒癥患者入組時的一般資料 ()

2.2 膿毒癥患者血清中miRNA-122 的診斷價值在14 d 病程中，膿毒癥組在每一時間點的miRNA-122 表達量(以2-ΔCt表示)與健康對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(均P＜0.01)。健康組的血清miRNA-122 的表達量范圍是3.450 (1.374，11.146)，膿毒癥組的血清miRNA-122 的表達量范圍見表2。

表2 膿毒癥組血清miRNA-122 表達量在不同時間點與健康對照組的比較(中位數;第25 百分位數，第75 百分位數)

為了檢測miRNA-122 早期診斷膿毒癥的價值，筆者繪制了ROC 曲線(圖1)，入組第1 天的miRNA-122 診斷膿毒癥的曲線下面積是0.774(95%CI，0.670-0.879)。當miRNA-122 的相對表達量是0.710 時，miRNA-122 診斷膿毒癥的特異性是95.7%，敏感性是53.8%。

圖1 MiRNA-122 早期診斷膿毒癥ROC 曲線

2.3 不同病情嚴重程度的膿毒癥患者血清中miRNA-122 水平的變化 一般膿毒癥組23例和重癥膿毒癥組29例(包括嚴重膿毒癥患者21例與膿毒癥休克患者8例)比較，兩組間miRNA-122 的表達水平在各時間點上存在統(tǒng)計學差異(P＜0.01)，且重癥膿毒癥組的表達量在各個時間點均高于一般膿毒癥組，而各組在組內各時間點比較，差異無統(tǒng)計學意義(表3)。

表3 一般膿毒癥組與重癥膿毒癥組的血清miRNA-122 的表達量范圍(中位數;第25 百分位數，第75 百分位數)

3 討 論

膿毒癥是感染引起的十分復雜的炎性反應，是多種炎性因子共同作用的結果，也是重癥監(jiān)護病房患者死亡的主要原因。所以膿毒癥的早期診斷和治療對患者的預后至關重要。近年來，對發(fā)現及確診膿毒癥的新型生物標志物及其相關功能的研究一直是各國學者們研究的熱點。

MiRNA 是一種長約22nt 的微小分子RNA，通過直接作用于信使RNA(mRNA)或者通過抑制蛋白質的翻譯來調節(jié)蛋白編碼基因的表達［5］。第1 篇報道的關于miRNA 可作為診斷膿毒癥的新的生物標志物的文獻，是Vasilescu 等［6］發(fā)現和證實了白細胞和血漿中miRNA-150 水平同膿毒癥的預后情況相關，而且它可以作為早期診斷膿毒癥的一項指標。而Wang Jiafeng 等［7］的研究則證實了miRNA-146a和miRNA-223 可以區(qū)分非感染SIRS 患者同膿毒癥患者，也說明這兩種miRNAs 可以作為膿毒癥患者的血清標志物。

本研究中，通過比較膿毒癥患者入組后不同時間點與健康人群血清中miRNA-122 表達量，說明膿毒癥患者的血清miRNA-122 表達量相對健康人群是下降的。用入組第1 天的miRNA 表達量做ROC 診斷分析得出其診斷的特異性是95.7%，敏感性是53.8%，這些數據都說明血清miRNA-122 可以作為早期膿毒癥的特異性診斷標志物。本研究中，嚴重膿毒癥組的miRNA-122 表達量在各個觀測時間點都高于一般膿毒癥組，間接說明miRNA-122 表達量預警膿毒癥患者疾病嚴重程度方面具有積極的臨床意義。

在筆者前期的研究中，雖然證實了血清miRNA-122 表達量在膿毒癥生存組和膿毒癥死亡組中存在統(tǒng)計學差異，并且在死亡組中相對高表達，但是并未驗證其與膿毒癥嚴重程度的相關性，也未對miRMA-122 能否診斷膿毒癥做出研究［8］。本實驗則發(fā)現了血清miRNA-122 的表達量在膿毒癥患者入組后的14 d 病程中各時間點與健康對照組均存在統(tǒng)計學差異，ROC 診斷試驗結果也說明血清miRNA-122 可作為膿毒癥的新型生物學診斷指標。MiRNA-122 的表達量在重癥膿毒癥組表達高于一般膿毒癥組。

膿毒癥可導致強烈的免疫抑制和機體損壞［9-11］。有研究顯示，在膿毒癥中陽離子氨基酸轉運蛋白(cationic amino acid transporter，CAT-1)的mRNA 表達水平升高了86%［12］。而Chang 等［13］研究發(fā)現CAT-1 是miR-122 最重要的作用靶點之一。MiRNA-122 中有8個CAT-l 的mRNA 潛在作用位點，2個位于5＇非編碼區(qū);6個位于γ 端非翻譯區(qū)，其中3個能與CAT-1 的核苷酸序列結合，來抑制蛋白質的合成，從而影響肝功能，具體作用機制并不清楚。在膿毒癥中，免疫抑制及機體損壞等一系列復雜的炎性反應可能阻斷了miRNA-122 和靶基因mRNA 結合通路，導致CAT-1 表達增加。本研究雖然證實血清miRNA-122 的表達量在重癥膿毒癥組較一般膿毒癥組高，但未對其在膿毒癥中的功能及機制做進一步研究，若后期能對其相關蛋白表達及靶基因深入研究，將為膿毒癥治療開啟新天地。

本研究的不足之處:(1)樣本量小。受膿毒癥患者樣本量及死亡病例限制，并沒有分析出這幾種miRNA 同臨床常用指標APACHEⅡ評分，SOFA 評分，CRP 和PCT 之間的關系;(2)臨床上絕大多數的膿毒癥患者在入ICU 之前已經過大量的藥物治療，因此這幾種miRNA 與膿毒癥嚴重程度的相關性尚需要嚴格控制患者入選條件并大量的樣本證實。

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