黨參多糖對(duì)鉛中毒小鼠記憶障礙的影響及其作用機(jī)制

張 立，李 丹，劉積平，陳亞丹，馬海明

黨參具有多種藥理活性［1］，黨參多糖是從黨參中提取的具有廣泛生物活性的生物大分子多聚糖，是由單糖之間脫水形成的鏈狀聚合物［2］。近期研究表明，多糖具有改善阿爾茨海默病(alzheimer's disease，AD)小鼠認(rèn)知功能，提高抗缺氧能力和耐力等作用［3，4］。

鉛是威脅人類健康的常見毒物之一，鉛暴露導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷［5］，鉛中毒與AD 具有相同的作用部位［6，7］。黨參多糖是否具有改善鉛中毒所造成的傷害目前尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以小鼠為研究對(duì)象，通過采用Morris 水迷宮及跳臺(tái)方法，觀察黨參多糖對(duì)鉛中毒小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響，并通過測(cè)定生化指標(biāo)，探討其在預(yù)防鉛中毒方面的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑 昆明種小鼠50 只，雌性，18～22 g，由吉林大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證編號(hào):20080003。黨參多糖，吉林大學(xué)天然藥物教研室提供;SOD 試劑盒，南京建成生物工程研究所(批號(hào):070801);MDA 試劑盒，南京建成生物工程研究所(批號(hào):070801);AchE 試劑盒，南京建成生物工程研究所(批號(hào):070601)。

1.2 模型制備及分組 用每升含12.5 μl 醋酸的三蒸水溶液配制0.2%醋酸鉛水溶液，高壓滅菌。將小鼠隨機(jī)分為5組，分別為正常組、模型組及黨參多糖低、中、高劑量組，正常組腹腔注射醋酸三蒸水溶液，模型組及黨參多糖低、中、高劑量組注射0.2%的醋酸鉛水溶液。注射劑量均為每10 g 體重0.1 ml，隔日注射1次，共染鉛14次。模型制備成功后，每組灌胃給藥42 d，正常組及模型組給藥10 ml/kg蒸餾水，黨參多糖低、中、高劑量組灌胃給藥濃度為100、200、300 mg/kg 的黨參多糖水溶液，1次/d。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 學(xué)習(xí)記憶能力檢測(cè) Morris 水迷宮檢測(cè)和跳臺(tái)學(xué)檢測(cè)方法參照文獻(xiàn)［3］進(jìn)行。

1.3.2 血鉛、腦鉛含量測(cè)定 給藥42 d 行為學(xué)檢測(cè)結(jié)束后，取小鼠眼球內(nèi)眥靜脈血20 μl，放入1%硝酸的帶蓋塑料離心管搖勻，用原子吸收法測(cè)定血鉛濃度。斷頭處死小鼠，于冰臺(tái)上迅速剝離大腦稱重，采用石墨爐原子吸收法測(cè)定腦鉛含量。

1.3.3 腦組織SOD 測(cè)定 根據(jù)南京建成生物工程研究所提供的SOD 測(cè)試試劑盒說明書進(jìn)行腦勻漿SOD 活性測(cè)定。腦勻漿 SOD 的含量=

1.3.4 腦組織MDA 測(cè)定法 根據(jù)南京建成生物工程研究所提供的測(cè)定試劑盒測(cè)定血清中MDA 含量，腦組織勻漿MDA 含量=(測(cè)定管吸光度-測(cè)定空白管吸光度)/(標(biāo)準(zhǔn)管吸光度-標(biāo)準(zhǔn)空白管吸光度)×標(biāo)準(zhǔn)管濃度÷蛋白質(zhì)含量。

1.3.5 AchE 測(cè)定法 將小鼠腦組織離心，取上清液依法處理，依據(jù)考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定法測(cè)定腦組織中的蛋白含量，AchE活力=

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.0 軟件，計(jì)量資料以表示，采用t 檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 血鉛、腦鉛含量測(cè)定結(jié)果 行為學(xué)末次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，小鼠血清及腦組織勻漿中鉛含量詳見表1。模型組與正常組相比血鉛、腦鉛含量明顯升高(P＜0.01)，黨參多糖低、中、高劑量組與模型組相比血鉛、腦鉛含量明顯降低(P＜0.05)。

表1 給藥6周后小鼠血鉛、腦鉛含量 ()

表1 給藥6周后小鼠血鉛、腦鉛含量 ()

注:與模型組比較，①P＜0.05;與正常組比較，②P＜0.01

2.2 水迷宮行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果 小鼠給黨參多糖第21 天，第42 天起，分別進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，連續(xù)3 d。到達(dá)平臺(tái)時(shí)間黨參多糖中、高劑量組較模型組顯著縮短(P＜0.05)，穿越平臺(tái)次數(shù)較模型組顯著增加(P＜0.05，表2，3)。

表2 小鼠給藥21 d 水迷宮行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 ()

表2 小鼠給藥21 d 水迷宮行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 ()

注:與模型組比較，①P＜0.05

表3 小鼠給藥42 d 水迷宮行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 ()

表3 小鼠給藥42 d 水迷宮行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 ()

注:與模型組比較，①P＜0.01，②P＜0.05;與正常組比較，③P＜0.01

2.3 跳臺(tái)學(xué)檢測(cè)結(jié)果 小鼠給黨參多糖第21 天，42 天進(jìn)行跳臺(tái)學(xué)實(shí)驗(yàn)。與模型組比較，黨參多糖中、高劑量組在學(xué)習(xí)訓(xùn)練及記憶測(cè)試中跳下平臺(tái)的觸電潛伏期顯著延長(P＜0.05)，錯(cuò)誤次數(shù)顯著降低(P＜0.05)，觸電時(shí)間明顯下降(P＜0.01，表4)。

表4 給藥21 d、42 d 小鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 ()

表4 給藥21 d、42 d 小鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 ()

注:與模型組給藥42 d 比較，①P＜0.01，②P＜0.05;與正常組給藥42 d 比較，③P＜0.01 ④P＜0.05

2.4 腦組織AchE、SOD 和MDA 測(cè)定結(jié)果 黨參多糖中、高劑量組與模型組比較，腦組織SOD 活性升高，MDA 含量降低，AchE 含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表5)。

表5 黨參多糖對(duì)染鉛小鼠腦組織AchE、SOD 和MDA 的影響 (;U/mgprot)

表5 黨參多糖對(duì)染鉛小鼠腦組織AchE、SOD 和MDA 的影響 (;U/mgprot)

注:與模型組比較，①P＜0.05;與正常組比較，②P＜0.01

3 討 論

鉛作為一種神經(jīng)毒素，可破壞血腦屏障并改變腦細(xì)胞內(nèi)溶酶體活性，引起學(xué)習(xí)記憶障礙。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，鉛中毒小鼠記憶力明顯降低，表現(xiàn)為Morris 水迷宮空間分辨性、學(xué)習(xí)記憶能力降低，跳臺(tái)記憶保持試驗(yàn)錯(cuò)誤次數(shù)增加，較好地模擬了鉛中毒小鼠記憶障礙模型。

正常腦組織受到毒物刺激后，內(nèi)源性自由基大量產(chǎn)生以及清除自由基能力的減弱，可造成神經(jīng)系統(tǒng)損害。氧自由基的變化與記憶障礙程度密切相關(guān)，體內(nèi)過多的自由基可與細(xì)胞膜中游離或結(jié)合狀態(tài)的不飽和脂肪酸發(fā)生有害的過氧化反應(yīng)，其主要產(chǎn)物MDA 可破壞細(xì)胞膜，使細(xì)胞死亡［8］。黨參多糖作為一種植物多糖，能通過血-腦脊液屏障保護(hù)神經(jīng)元。應(yīng)用黨參多糖后，模型組SOD 含量升高，MDA 濃度降低，表明可能通過減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)達(dá)到抗氧化作用，直接或間接清除鉛引起的自由基造成的損害、避免抗氧化性物質(zhì)消耗導(dǎo)致的腦組織損傷，這可能是黨參多糖作用的途徑。本研究通過水迷宮及跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)表明，黨參多糖中、高劑量組對(duì)模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能有顯著改善，能增強(qiáng)鉛中毒小鼠的空間分辨性、學(xué)習(xí)記憶能力及降低跳下平臺(tái)的錯(cuò)誤次數(shù)，其機(jī)制可能與改善腦內(nèi)脂質(zhì)過氧化，清除自由基有關(guān)。

乙酰膽堿是進(jìn)行及維持高級(jí)神經(jīng)系統(tǒng)功能的一種重要介質(zhì)，為促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶的遞質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，鉛中毒小鼠腦內(nèi)AchE 的活性降低，表明記憶障礙與膽堿能系統(tǒng)功能紊亂密切相關(guān)。黨參多糖組與模型組AchE 活性比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示黨參多糖改善鉛中毒小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，是否與膽堿能系統(tǒng)有關(guān)尚待進(jìn)一步研究。

［1］柏長青，宋穎芳，王德堂，等.黃芪、黨參提取物移植肺癌細(xì)胞誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的實(shí)驗(yàn)研究［J］.武警醫(yī)學(xué)，2008，19(6):505.

［2］陳亞丹.黨參多糖對(duì)鉛中毒小鼠記憶障礙及免疫功能低下的影響［D］.長春:吉林大學(xué)，2009.

［3］趙婷婷，張全斌，張忠山，等.褐藻多糖硫酸酯對(duì)阿爾茨海默病模型小鼠認(rèn)知功能及腦內(nèi)膽堿能系統(tǒng)的影響［J］.中藥新藥與臨床藥理，2010，21(2):160-163.

［4］李 瀟，孫永福，王鳳山.低分子多糖在阿爾茨海默病防治中的研究進(jìn)展［J］.中國生化藥物研究雜志，2009，30(5):344-347.

［5］梁友信.勞動(dòng)衛(wèi)生與職業(yè)病學(xué)［M］.4 版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2000:62-64.

［6］Liang B，Li X B，Zhang W，et al.Harm of lead poisoning and use of natural materials to prevent and treat lead poisoning［J］.Si chuan Environment，2000，9(2):17-19.

［7］Shen L X，Li S J，Zhang D S，et al.Effects of chrysophanol on memory impairment mice and its mechanism analysis［J］.Chin Pharmacol Bull，2003，19(8):906-908.

［8］Cornard J P，Dangleterre L，Lapouge C.Computational and spectroscopic characterization of the molecular and electronic struture of the Pb(Ⅱ)-quercetin complex［J］.Phys Chem A，2011，109:1004.