apoE-/-小鼠頸總動(dòng)脈斑塊不規(guī)則趨化因子和分子標(biāo)志物CD11c的表達(dá)

許增祥，盧林明，張?jiān)寿F，張根葆

皖南醫(yī)學(xué)院 1病理學(xué)教研室 2病理生理學(xué)教研室，安徽蕪湖241002

動(dòng)脈粥樣硬化 (atherosclerosis，AS)是一種與脂質(zhì)代謝紊亂相關(guān)的免疫炎癥性疾病。在粥樣斑塊中巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞是主要成分。有研究顯示樹(shù)突狀細(xì)胞 (dendritic cells，DCs)也存在于AS斑塊內(nèi)，在AS發(fā)病過(guò)程中由不成熟狀態(tài)逐步發(fā)生成熟，影響AS的起始和進(jìn)展［1］。未成熟DCs不表達(dá)CD11c，但可低水平表達(dá)一些黏附分子，成熟后可表達(dá)CD11c和一些協(xié)同刺激信號(hào)，如MHCⅡ、CD83、CD86等。DCs作為免疫反應(yīng)的樞紐，是體內(nèi)激活初始T細(xì)胞的主要抗原提呈細(xì)胞。它主要來(lái)源于血液中的單核細(xì)胞。單核細(xì)胞是AS斑塊中泡沫細(xì)胞的前體細(xì)胞，在向炎癥部位遷移的過(guò)程中需要趨化因子和黏附分子的參與。趨化因子Fractalkine(FKN)是目前發(fā)現(xiàn)的CX3C家族中的唯一成員，研究提示FKN在AS的炎癥機(jī)制中可能發(fā)揮作用。本研究以高脂飼養(yǎng)的apoE-/-小鼠為動(dòng)物模型，觀察在AS斑塊中FKN表達(dá)和DCs侵潤(rùn)的情況，并探討FKN在趨化DCs進(jìn)入血管內(nèi)膜參與AS的可能機(jī)制。

材料和方法

材料 6～8周齡雄性apoE-/-小鼠24只，購(gòu)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部 (許可證號(hào):SCXK京2002-0001);按照完全隨機(jī)法平均分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組飼以高脂飼料 (含5%的豬油、1%膽固醇);對(duì)照組飼以普通飼料。每只小鼠每天給予5 g飼料，自由飲水，水為pH值2.8～3.0消毒水。即用型免疫組織化學(xué)試劑盒 (SP法)、多克隆兔抗小鼠FKN抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司;多克隆兔抗小鼠CD11c抗體購(gòu)自深圳達(dá)科為生物技術(shù)有限公司。

血清脂質(zhì)測(cè)定 飼養(yǎng)12周后，麻醉后摘眼球取血，離心，收集血清，采用酶法并用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清中三酰甘油、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇的濃度。

蘇丹Ⅳ大體染色 每組各取3只小鼠，選取左側(cè)頸總動(dòng)脈開(kāi)始段約1cm;磷酸鹽緩沖液中仔細(xì)分離血管周?chē)慕Y(jié)締組織，用細(xì)鐵絲穿過(guò)血管段，小心剪開(kāi)血管。蘇丹Ⅳ染色步驟:70%酒精2 min，蘇丹Ⅳ染液40 min，80%酒精20 min，自來(lái)水沖洗1 h。將血管內(nèi)皮向上平鋪在載波片上，拍照。

HE染色 選取apoE-/-小鼠左側(cè)相同部位頸總動(dòng)脈約1 cm長(zhǎng)血管條，石蠟包埋后，連續(xù)切片，蠟片厚度為5 μm，待有斑塊后連續(xù)切片約100張，每隔10張選取1張，行HE染色。在高倍鏡圖像下，應(yīng)用Image J軟件測(cè)量血管原管腔面積和現(xiàn)管腔面積，血管狹窄率評(píng)價(jià):血管狹窄率=(原管腔面積-現(xiàn)管腔面積)/原管腔面積，每條血管觀察10個(gè)動(dòng)脈斷面，取其平均值。

免疫組織化學(xué)染色 SP法檢測(cè)斑塊處FKN及CD11c(DCs標(biāo)記物)陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)，F(xiàn)KN抗體濃度1∶150，CD11c抗體濃度1∶100，按免疫組織化學(xué)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，最后用二氨基聯(lián)苯胺在顯微鏡下控制著色，蘇木素襯染。陽(yáng)性結(jié)果判定:細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜出現(xiàn)清晰淡黃色至棕褐色顆粒著色為陽(yáng)性信號(hào)。結(jié)合染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行分級(jí)。2人雙盲法觀察切片，低倍鏡下選取染色最強(qiáng)的部位，高倍鏡下觀察，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)高倍鏡視野。按著色程度計(jì)分:細(xì)胞著色與背景相似者計(jì)為0分;著色淺、略高于背景者計(jì)為1分;中度色、明顯高于背景者計(jì)為2分;強(qiáng)染、著色很深者計(jì)為3分。按陽(yáng)性細(xì)胞比例計(jì)分:視野中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜5%計(jì)0分，5% ～＜25%計(jì)1分，25% ～＜50%計(jì)2分，50% ～＜75%計(jì)3分，≥75%計(jì)4分。兩項(xiàng)計(jì)分相乘后分為4級(jí):0分為陰性(-)，1～4分為弱陽(yáng)性 (+)，5～8分為陽(yáng)性 (++)，9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性 (+++)。若兩個(gè)人觀察結(jié)果相差3分則重新評(píng)定。計(jì)數(shù)CD11c+細(xì)胞數(shù)量時(shí)，以著色至少略高于背景者為準(zhǔn)，隨機(jī)數(shù)10個(gè)高倍鏡視野，不足10個(gè)高倍鏡視野的數(shù)整張切片;所得數(shù)據(jù)取平均值。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 12.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)均用±s表示。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

血脂測(cè)定結(jié)果 高脂飼養(yǎng)apoE-/-小鼠12周后，摘眼球取血，采用酶法并用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)得血清中三酰甘油、總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇的濃度均高于普食組 (P＜0.05)(表1)。

AS病變程度分析結(jié)果

蘇丹Ⅳ染色結(jié)果:apoE-/-小鼠頸總動(dòng)脈經(jīng)蘇丹Ⅳ染色后顯示為紅色，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物斑塊面積百分?jǐn)?shù) (12.42±1.25)%是對(duì)照組 (3.74±1.02)%的近4倍。實(shí)驗(yàn)組頸總動(dòng)脈斑塊面積明顯增大 (圖1A、1B)。

HE染色結(jié)果:每條血管觀察10個(gè)動(dòng)脈橫斷面，計(jì)算其血管狹窄率，并取平均值。實(shí)驗(yàn)組血管狹窄率為(38.58±3.82)%(n=8)，是對(duì)照組 (13.39±2.74)%(n=9)的近3倍。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組血管狹窄程度更加嚴(yán)重 (P＜0.05)(圖1C/1D)。

表1 apoE-/-小鼠血脂測(cè)定結(jié)果 (n=12，±s，mmol/L)Table 1 The blood lipids of apoE-/-mice(n=12，±s，mmol/L)

表1 apoE-/-小鼠血脂測(cè)定結(jié)果 (n=12，±s，mmol/L)Table 1 The blood lipids of apoE-/-mice(n=12，±s，mmol/L)

與普食組比較，aP＜0.05aP＜0.05 compared with normal diet group

低密度脂蛋白膽固醇Low-density lipoprotein cholesterol普食組Normal diet group 0.48±0.24 10.14±0.74 0.47±組別Group三酰甘油Triglyceride總膽固醇Total cholesterol高密度脂蛋白膽固醇High-density lipoprotein cholesterol 0.07 7.08±0.76高脂飲食組High-fat diet group 0.86±0.17a 18.36±3.12a 0.56±0.17 17.41±3.17a

CD11c+細(xì)胞的分布 實(shí)驗(yàn)組CD11c+細(xì)胞數(shù)目18.46±5.17較對(duì)照組4.62±1.91明顯升高 (P＜0.05)(圖2A、2B)。CD11c+細(xì)胞在斑塊肩部和內(nèi)皮下有聚集傾向，而對(duì)照組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)少，且散在分布。

FKN的表達(dá) 隨機(jī)選取10個(gè)不同高倍鏡視野，對(duì)細(xì)胞染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行打分，對(duì)二者的乘積進(jìn)行比較，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組不規(guī)則趨化因子的表達(dá)明顯升高 (5.31±1.58比2.27±0.79)(P＜0.05)(圖2C、2D)。

討 論

DCs是體內(nèi)最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞之一，是免疫反應(yīng)的樞紐。研究顯示AS斑塊內(nèi)的DCs多聚集在受紊亂血流影響、易于發(fā)生AS病變的部位［2］;并且90%以上是與T細(xì)胞并存于有炎癥浸潤(rùn)新生內(nèi)膜處［3］。另有研究顯示，DCs不僅參與AS的形成和發(fā)展，而且還可能與斑塊的穩(wěn)定性有關(guān)［4］。因此，有學(xué)者認(rèn)為DCs可能成為未來(lái)AS防治的一個(gè)新靶點(diǎn)。但迄今為止，DCs在AS斑塊形成、發(fā)展過(guò)程中的作用仍未明確。大部分DCs來(lái)自于血液中的單核細(xì)胞，單核細(xì)胞在血管內(nèi)皮細(xì)胞 (endothelial cells，ECs)表面發(fā)生滾動(dòng)、黏附、遷移，是由于激活的ECs表達(dá)的一系列選擇素、黏附分子和內(nèi)皮下產(chǎn)生的趨化物的作用。有研究表明斑塊處存在的氧化性脂蛋白就是對(duì)DCs有較強(qiáng)趨化作用的物質(zhì)［5-6］。

圖1 apoE-/-小鼠頸總動(dòng)脈斑塊分布Fig 1 Atherosclerotic lesions in the common carotid artery of apoE-/-mice

圖2 apoE-/-小鼠頸總動(dòng)脈斑塊CD11c+細(xì)胞分布和不規(guī)則趨化因子的表達(dá) (免疫組織化學(xué)染色，×400)Fig 2 Expressions of CD11c+and fractalkine on atherosclerotic lesions of the common carotid artery from apoE-/-mice(Immunohistochemical staining， ×400)

不規(guī)則趨化因子FKN或CX3CL1是1997年新發(fā)現(xiàn)的一種化學(xué)趨化因子，它有兩種存在形式，即膜型和可溶型。在人類(lèi)功能紊亂的ECs上已發(fā)現(xiàn)有FKN的強(qiáng)表達(dá)［7-8］，此外，F(xiàn)KN還表達(dá)在平滑肌細(xì)胞 (smooth muscle cells，SMCs)［9］、DCs［10］和巨噬細(xì)胞［11］等。本研究在高脂飼養(yǎng)的apoE-/-小鼠頸總動(dòng)脈AS斑塊內(nèi)可發(fā)現(xiàn)有FKN的高表達(dá)，可能是以上這些細(xì)胞表達(dá)的結(jié)果。FKN的唯一受體CX3CR1則可表達(dá)于T細(xì)胞和NK細(xì)胞［12-13］、血液中的單核細(xì)胞［14］。在冠心病患者與健康人的比較中，發(fā)現(xiàn)CX3CR1+細(xì)胞出現(xiàn)率更高［15］。FKN/CX3CR1的作用可能在AS發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。首先，ECs表達(dá)的FKN能誘導(dǎo)白細(xì)胞與之發(fā)生黏附，同時(shí)，病灶處的SMCs表達(dá)的可溶性FKN通過(guò)微循環(huán)環(huán)境促進(jìn)T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞遷移進(jìn)入病灶處［16-17］。其次，細(xì)胞學(xué)研究顯示內(nèi)皮細(xì)胞 FKN的表達(dá)可促進(jìn)DCs的成熟和CX3CR1的表達(dá);利用RNA干擾技術(shù)抑制DCs CX3CR1表達(dá)后，進(jìn)而可抑制DCs和ECs的相互作用，故 FKN/CX3CR1在 DCs和ECs相互作用中發(fā)揮一定作用［18］。另外，單核細(xì)胞和SMCs相互作用可以上調(diào)一些炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，如腫瘤壞死因子α、白介素1β、白介素6、CX3CR1和基質(zhì)金屬蛋白酶，并且依賴(lài)于FKN/CX3CR1間的相互作用［19］。再者，F(xiàn)KN還具有延長(zhǎng)AS病變部位單核巨噬細(xì)胞和SMCs生存周期的作用［20］。本研究顯示，在apoE-/-小鼠頸總動(dòng)脈AS斑塊內(nèi)CD11c和FKN表達(dá)均升高，而CD11c是DCs的分子標(biāo)志，這可能為FKN參與趨化DCs進(jìn)入斑塊處發(fā)揮作用提供了體外研究證據(jù)。

研究FKN/CX3CR1相互作用的目的在于探討DCs進(jìn)入內(nèi)膜參與AS的可能機(jī)制，以便能更好地借助DCs的某些特性干預(yù)AS的發(fā)病過(guò)程，例如制作疫苗;或者從控制DCs進(jìn)入病變部位的角度，應(yīng)用CX3CR1的拮抗劑 (如藥物AZ12201182)可抑制FKN的某些作用，如延長(zhǎng)病變部位一些細(xì)胞的壽命和加速細(xì)胞有絲分裂;或阻斷FKN引起的表皮調(diào)節(jié)素mRNA的表達(dá)［21］。所有這些可更好地研究FKN/CX3CR1這對(duì)趨化因子/受體的作用，或許可為AS的防治提供了一個(gè)較好的靶點(diǎn)。

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