植物血凝素-ECM830細胞融合法融合黑色素瘤細胞

米蕊芳，劉福生，金貴善

1首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院北京市神經外科研究所腦腫瘤研究中心，北京100050

2中國醫(yī)學科學院 北京協和醫(yī)學院 基礎醫(yī)學研究所病理學系，北京100005

瘤細胞中常見多倍體及瘤巨細胞的現象，并且與疾病的預后呈負相關，如乳腺癌［1］和黑色素瘤［2］等，其中的原因之一是細胞融合所引起的［3］。細胞融合也是細胞學及腫瘤領域的重要研究手段。在腫瘤惡性度研究方面，多種腫瘤細胞包括黑色素瘤細胞與正常的成纖維細胞融合后會出現瘤細胞惡性度降低的現象［4］;在腫瘤器官特異性轉移研究方面，特異性轉移到肺臟的瘤細胞以及特異性轉移到骨組織的瘤細胞融合后會特異轉移到肺組織和骨組織等［5］。聚乙二醇化學融合方法是傳統(tǒng)的細胞融合方法，但對于腫瘤細胞融合，其融合效率低，且并不適用于所有的腫瘤細胞融合。細胞電融合技術是近年發(fā)展的細胞融合技術，BTX ECM830電融合/電轉儀是實驗室常見儀器，多用于細胞轉化，也可用于細胞融合，但融合效率較差。細胞融合的前提是兩細胞膜的緊密接觸。植物血凝素 (phytohemagglutinin，PHA)是一種有絲分裂原，可以起到細胞凝聚的作用，使得兩細胞膜緊密接觸。本研究以黑色素瘤細胞為模型，結合PHA的細胞凝聚作用以及ECM830電融合作用，提高細胞融合效率，得到黑色素瘤溶瘤細胞，并進一步探討融合細胞相應特征。

材料和方法

細胞培養(yǎng) 小鼠黑色素瘤細胞B16-F10、黑色素融合細胞B16/B16均培養(yǎng)于含5%胎牛血清并加青鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)液中。培養(yǎng)溫箱環(huán)境為5%CO2、37℃。

細胞標記 分別用綠色熒光病毒pLL3.7和紅色熒光病毒pLL3.7-dsRED感染標記B10-F10細胞 (感染過程中病毒數與細胞數之比，即感染復數=1)。pLL3.7質粒以及相應的包裝質粒 pMDL，pREV和pVSVG購買于Addgene公司。pLL3.7-dsRED載體的構建是將PCR所得的dsRED片段取代pLL3.7中的GFP片段而完成的。慢病毒用239T細胞包裝產生，其包裝和感染過程嚴格按參考文獻 ［6］方法進行。

ECM830化學細胞融合法 B16-F10-GFP(1×107)和B16-F10-RFP(1×107)混合離心后，用200 μl電擊液重懸，加入到電擊杯中，ECM830電融合儀 (美國BTX公司)250V，30 μs電擊3次，靜置5 min后將細胞植入到培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。

PHA-ECM830細胞融合法 混合B16-F10-GFP(1×107)細胞和B16-F10-RFP(1×107)細胞，DMEM液洗兩次，加入500 μl 50 mg/L的PHA(Sigma-Aldrich公司)液，37℃孵育30 min。孵育后的混合細胞900 r/min離心5 min。將離心后的上清液完全棄去，加入200 μl電擊液，用手頓挫振蕩開細胞，并移入到電擊杯中。ECM830電融合儀250V、30 μs電擊3次。靜置5 min后將細胞植入到培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。

熒光激活細胞分選 單色和雙色熒光標記的細胞通過BDFACSAria流式分選儀 (BD公司)分選。分選后的細胞用含20% 胎牛血清和含兩倍雙抗的DMEM液收集。收集后立即培養(yǎng)于正常培養(yǎng)液中。

DNA含量測定 應用碘化亞啶染色法測定DNA含量。將細胞按約80%的密度接種于60 mm培養(yǎng)皿中，次日收集細胞，PBS洗2次，75%乙醇固定過夜。將固定后的細胞PBS洗兩次，1 g/L核糖核酸酶 (Sigma-Aldrich公司)37℃消化30 min，0.5 g/L碘化亞啶 (Sigma-Aldrich公司)避光染色40 min，流式檢測DNA含量。

體外細胞增殖實驗 3×105細胞接種于60 mm培養(yǎng)皿中，每2天更換培養(yǎng)液，每天計數細胞數。

皮下成瘤實驗 胰酶消化細胞，PBS洗兩次，用PBS液將細胞懸起 (5×105/ml)，5×104個細胞皮下注射到C57BL/6小鼠 (北京維通利華實驗動物有限公司)腋下，用游標卡尺每5天測量1次腫瘤體積。

統(tǒng)計學處理 所有數據均用均數±標準差表示，P值用Excel軟件中的T檢驗計算。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

熒光標記黑色素瘤融合細胞 B16-F10黑色素瘤細胞增殖速度快，惡性度高。將黑色素瘤細胞進行熒光標記，并通過流式分選，得到了分別帶有綠色 (圖1A)和紅色熒光 (圖1B)標記的黑色素瘤細胞亞克隆。

PHA-ECM830細胞融合法融合黑色素瘤細胞 首先用ECM830直接進行黑色素瘤細胞融合，融合后的細胞種植于平皿中24 h后觀察可見:1個視野下很難見到黑色素瘤融合細胞，1個平皿中只有幾個黑色素瘤融合細胞，細胞融合效率低 (不到0.50%)。在此基礎上，在進行ECM830電融合前加入PHA，使得兩細胞膜緊密接觸，熒光顯微鏡下可見到綠色熒光和紅色熒光黑色素瘤細胞的細胞膜緊密接觸 (圖2A)。融合后取少許細胞展片，可見到帶有雙色熒光標記的黑色素瘤融合細胞 (既帶有綠色熒光又帶有紅色熒光，疊加后呈現黃色)(圖2B)。

流式分選黑色素瘤融合細胞 融合細胞48 h后流式分析顯示帶有雙色熒光標記的融合細胞所占的比例為7.18%，細胞融合效率較ECM830電融合法 (融合效率小于0.50%)提高約15倍。流式分選出帶有雙色熒光標記的融合細胞，經細胞培養(yǎng)后得到黑色素瘤融合細胞 (圖3)。

圖1 綠色 (A)及紅色 (B)熒光蛋白標記黑色素瘤細胞 (×200)Fig 1 Labeled melanoma cells with GFP(A)and RFP(B)(×200)

圖2 黑色素瘤細胞經PHA作用后電融合生成黑色素瘤融合細胞Fig 2 Melanoma fusion cells were obtained through the electrofusion method after treated with PHA

黑色素瘤融合細胞DNA含量的變化 DNA含量分析顯示，流式分選后的黑色素瘤融合細胞其DNA含量發(fā)生了翻倍的變化，由多二倍體轉化為多四倍體(圖4)。

黑色素瘤融合細胞增殖速度的變化 在細胞培養(yǎng)中，發(fā)現黑色素瘤融合細胞的傳代間隔時間明顯延長。進一步體外增殖實驗表明融合細胞的增殖速度較融合前的黑色素瘤細胞明顯減慢 (圖5A)。皮下成瘤實驗表明黑色素瘤融合細胞的皮下腫瘤生長速度減慢(圖5B)。

圖3 流式分析及分選黑色素瘤融合細胞Fig 3 Melanoma fusion cells were analyzed and selected through fluorescence activated cell sorting

圖4 黑色素瘤融合細胞及黑色素瘤細胞的DNA含量Fig 4 DNA content of the melanoma fusion cells and melanoma cells

圖5 黑色素瘤融合細胞的體外增殖曲線及體內生長曲線Fig 5 The melanoma fusion cells’proliferation curve in vitro and their growth curve in vivo

討 論

細胞融合在生物發(fā)育、組織修復和更新生成中均發(fā)揮重要作用，如精子細胞與卵子細胞融合形成受精卵、破骨細胞融合形成巨細胞、滋養(yǎng)細胞融合形成胎盤等［7］。細胞融合的異常和失調會導致疾病的發(fā)生，最常見的就是腫瘤。另一方面，細胞融合作為全基因組的有效研究手段在近年被廣泛應用，特別是在腫瘤研究中針對腫瘤細胞的轉移機制，就有巨噬細胞-腫瘤細胞融合理論等［8］。細胞融合及細胞融合技術是腫瘤的重要特征及研究方式。

細胞融合方法包括聚乙二醇化學融合法、ECM830電融合及ECM2001電融合技術。聚乙二醇化學融合法及ECM830電融合法均存在融合效率低的問題;而ECM2001電融合儀，雖然融合效率高，但對實驗室儀器以及實驗室平臺均有較高要求，限制了它的廣泛應用。本研究結合PHA可使兩個腫瘤細胞緊密接觸的特征，在PHA作用的基礎上進行電擊融合，從而大大提高細胞融合效率。ECM830是BTX公司較早推出的產品，在實驗室廣泛存在;PHA具有凝集各種細胞的作用，作用范圍廣，因而PHA-ECM830細胞融合方法是一種應用廣泛且高效率的細胞融合方法。

本研究顯示黑色素瘤融合細胞的增殖速度減慢。增殖速度是腫瘤細胞惡性度的重要特征。有報道表明，腫瘤細胞尤其是黑色素瘤細胞與正常細胞如成纖維細胞融合后會出現增殖速度降低的現象［9］，其可能的原因是正常細胞中的抑癌基因，如p53等發(fā)揮的作用。黑色素瘤融合細胞增殖速度減慢的具體機制尚待進一步研究。

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［2］Mossbacher U，Knollmayer S，Binder M，et al.Increased nuclear volume inmetastasizing‘thick’melanomas［J］.J Invest Dermatol，1996，106(3):437-440.

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［4］Harris H.The anslysis of malignancy by cell fusion:the position in 1988 ［J］.Cancer Res，1988，48(12):3302-3306.

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［6］Tiscornia G，Singer O，Verma IM.Production and purification of lentiviral vectors ［J］.Nat Protoc，2006，1(1):241-245.

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［8］Pawelek JM，Chakraborty AK.Fusion of tumour cells with bone marrow-derived cells:aunifying explanation for metastasis［J］.Nat Rev Cancer，2008，8(5):377-386.

［9］Harris H.The analysis of malignancy by cell fusion:theposition in 1988 ［J］.Cancer Res，1988，48:3302-3306.