穩(wěn)定表達(dá)小鼠甘丙肽的N-2a細(xì)胞株的建立及內(nèi)源性過表達(dá)甘丙肽對N-2a細(xì)胞增殖和凋亡的影響

榮 曼，張銳虎，劉田福

山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，太原030001

甘丙肽 (galanin，GAL)是由29～30個(gè)氨基酸構(gòu)成的神經(jīng)肽，廣泛分布于中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)，它參加攝食、學(xué)習(xí)記憶、痛覺和神經(jīng)性損傷、修復(fù)與退行性變等一系列生物活動，研究顯示甘丙肽通過3種與G蛋白相偶聯(lián)的受體 (GalR1、GalR2、GalR3)調(diào)節(jié)一系列生物和行為學(xué)效應(yīng)，在神經(jīng)元發(fā)生、發(fā)育、生長和衰老過程中甘丙肽的作用更是引起了廣泛的關(guān)注［1］。小鼠神經(jīng)母瘤細(xì)胞 Neuro-2a(N-2a)來源于Albino A系小鼠的自發(fā)神經(jīng)母細(xì)胞瘤，形態(tài)似神經(jīng)樣干細(xì)胞，在一定的環(huán)境下具有短時(shí)間內(nèi)分化為神經(jīng)元的潛能［2］。小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤株N-2a因其形態(tài)變化迅速常用作研究神經(jīng)分化、損傷和藥物作用的體外模型，也是常用于研究神經(jīng)毒性的細(xì)胞株［3］。本研究選用N-2a細(xì)胞作為神經(jīng)細(xì)胞研究模型，通過脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染細(xì)胞實(shí)現(xiàn)由血小板源性的生長因子B啟動子(platelet derived growth factor-B，PDGF-B)驅(qū)動目的基因GAL在N-2a細(xì)胞的過表達(dá)，并探討其對細(xì)胞增殖及凋亡的影響。

材料和方法

材料 細(xì)胞:N-2a購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院;菌株和質(zhì)粒:pcDNA 3.1由本實(shí)驗(yàn)室保存，大腸桿菌DH5a、pMD-19T載體均購自寶生物工程(大連)有限公司。試劑和培養(yǎng)基:DNA平末端加A試劑盒，反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒，RNA提取試劑盒均購自寶生物工程 (大連)有限公司;澳洲血源特級胎牛血清購自北京元亨金馬生物技術(shù)開發(fā)有限公司;LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司。主要引物:RTPCR、常規(guī)PCR引物均參照GenBank中GAL基因和cDNA的標(biāo)準(zhǔn)序列，使用Primer Premier 5.0、Oligo 6.0軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)分析。PCR正向引物F:5’-GAAGATCTGGATCCACAGTCTCCTGAGTA-3’，反向引物 R:5’-CCGCTCGAGCAGTCCCAGATACTTGCTAG-3’;RT-PCR 正 向引物 F:5’-GCAGTAAGCGACCATCCAGC-3’，反向引物 R:5’-AGGACACACGTGCACAGTGG-3’;內(nèi)參正向引物 F:5’-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3’，反向引物 R:5’-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3’，由Invitrogen公司合成。

細(xì)胞培養(yǎng) 從液氮中取出凍存細(xì)胞立即放入40℃水浴，震蕩使其快速溶解1 min，然后移入含有9 ml完全培養(yǎng)基的離心管中，室溫下1200 r/min離心收集沉淀，吹吸混勻后移入培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。N-2a細(xì)胞用全血清DMEM培養(yǎng)液 (10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素)在75 cm2培養(yǎng)瓶中附壁生長培養(yǎng)，細(xì)胞達(dá)到80%匯合時(shí)以1∶3進(jìn)行傳代。選第3～6代細(xì)胞以2×107/ml進(jìn)行凍存，凍存前1天更換新鮮培養(yǎng)基，凍存液含20%胎牛血清、5%DMSO，凍存過程:4℃ 20 min，－20℃ 30 min，－80℃過夜后投入液氮長期保存。

Acta Acad Med Sin，2013，35(5):524 －529

建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染小鼠PDGF-GAL的N-2a細(xì)胞株細(xì)胞瘤細(xì)胞生長匯合率為70%時(shí)收獲細(xì)胞，轉(zhuǎn)入兩個(gè)6孔板，培養(yǎng)至80%以上匯合時(shí)分成兩組，陽性轉(zhuǎn)染組 (脂轉(zhuǎn)PcDNA 3.1-GAL質(zhì)粒轉(zhuǎn)入N-2a細(xì)胞):6孔板中隨機(jī)抽取4孔，每孔加完全培養(yǎng)基2 ml、含脂質(zhì)體2000 10 μl的DMEM 培養(yǎng)基250 μl、含GAL重組質(zhì)粒4.0 μg的DMEM培養(yǎng)基250 μl;陰性對照組 (脂轉(zhuǎn)PcDNA 3.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)入N-2a細(xì)胞):6孔板中任選4孔，每孔加完全培養(yǎng)基 2 ml、含脂質(zhì)體 2000 10 μl的DMEM 培養(yǎng)基 250 μl、含 PcDNA 3.1 質(zhì)粒 4.0 μg的DMEM培養(yǎng)基250 μl;空白對照組:6孔板中其余孔分別標(biāo)記為*，每孔加DMEM培養(yǎng)基2.25 ml、含lipofectamine 2000 脂質(zhì)體10 μl的 DMEM 培養(yǎng)基 250 μl。6孔板置于37℃、5%CO2、90%濕度條件下脂轉(zhuǎn)4 h后更換為完全培養(yǎng)基。

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后48 h分別于上述各組中每孔細(xì)胞加入500 ng/μl G418進(jìn)行篩選，當(dāng)顯微鏡下空白對照組細(xì)胞全部死亡，而轉(zhuǎn)染組細(xì)胞持續(xù)加壓至細(xì)胞不再死亡，且以團(tuán)簇的形式生長時(shí)即可認(rèn)為是陽性細(xì)胞，單細(xì)胞顯微操作法獲得轉(zhuǎn)染后抗G418陽性細(xì)胞于96孔培養(yǎng)板進(jìn)行培養(yǎng)，具體操作方法:用胰蛋白酶消化欲分離的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×103/ml，取2 ml細(xì)胞懸液加入無菌培養(yǎng)皿，然后用自制的毛細(xì)吸管在倒置顯微鏡下吸出單個(gè)細(xì)胞加入含適量新鮮完全培養(yǎng)基的96孔培養(yǎng)板中，每孔只加1個(gè)細(xì)胞，最后放入37℃含5%CO2的孵箱培養(yǎng)。96孔培養(yǎng)板中細(xì)胞長至孔底1/3～1/2面積時(shí)，再次加入200 ng/μl G418進(jìn)行加壓篩選5～7 d，挑選生長良好的孔板內(nèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)種于24孔板擴(kuò)大培養(yǎng)。

陽性細(xì)胞克隆中外源基因的PCR法檢測 為確認(rèn)所選細(xì)胞克隆中是否有轉(zhuǎn)入的基因，采用PCR擴(kuò)增技術(shù)，由于所用引物依照擴(kuò)增外源基因片段PDGFGAL全長時(shí)設(shè)計(jì)，經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)證明只有轉(zhuǎn)入的外源PDGF-GAL才能擴(kuò)出片斷。以細(xì)胞克隆基因組DNA為模板，擴(kuò)增轉(zhuǎn)入N-2a細(xì)胞內(nèi)的外源cDNA基因片段，經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，為使PCR檢測特異，同時(shí)設(shè)立陰性對照和陽性對照組。

細(xì)胞克隆中GAL轉(zhuǎn)錄水平的檢測 選取PCR鑒定陽性的細(xì)胞克隆采用Trizon法提取不同組細(xì)胞克隆總RNA，用紫外可見分光光度計(jì)測定RNA的濃度為0.52 g/L，純度為2.0，然后以內(nèi)參GAPDH為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行 RT-PCR，25 μl的 PCR 反應(yīng)體系包括 cDNA 2 μl，10 × PCR 緩沖液 5 μl，10 mmol/L 各類 dNTP 3 μl，2.5 U Taq DNA合成酶，GAL及GAPDH正、反向引物各2 μl，無RNA酶的去離子水加至反應(yīng)物總量50 μl。輕柔吹吸混勻并短暫離心收集附壁液體后，將樣本置入PCR熱循環(huán)儀，開始PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為:預(yù)變性:94℃，5 min;變性:94℃，30 s;退火:64℃，1 min;延伸:72℃，30 s，共循環(huán)35次。最后于72℃延伸10 min。所有標(biāo)本重復(fù)測定3次。在擴(kuò)增終點(diǎn)取5 μl的產(chǎn)物，進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳并拍照。凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行條帶光密度掃描，以GAPDH校正做GAL相對表達(dá)量分析，數(shù)值以GAL/GAPDH表示。

Western blot法檢測細(xì)胞克隆中GAL表達(dá)水平收集2×106個(gè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，按細(xì)胞總蛋白提取試劑盒說明書提取蛋白，取30 μg處理后的蛋白樣品進(jìn)行SDSPAGE電泳并電轉(zhuǎn)移至NC膜上，5%脫脂奶粉室溫振蕩封閉1 h，GAL抗體 (1∶200稀釋)4℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗 (1∶10 000稀釋)室溫孵育1 h，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法檢測目的蛋白。選用GAPDH為內(nèi)參(一抗以1∶2000稀釋，二抗以1∶10 000稀釋)，蛋白含量用目的條帶光密度/β-actin校正光密度表示，比較轉(zhuǎn)染后N-2a細(xì)胞與對照小鼠細(xì)胞GAL蛋白表達(dá)差異。

N-2a和GAL-N-2a細(xì)胞組的增殖分析 細(xì)胞經(jīng)EDTA-胰蛋白酶消化分離、離心、計(jì)數(shù)，以每孔150 μl完全培養(yǎng)基含1×103/孔的細(xì)胞密度接種于96孔板，37℃，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，使細(xì)胞貼壁和細(xì)胞突起充分伸展。然后分別在細(xì)胞貼壁后0、24、48、72、96、120 h定時(shí)每孔加入20 μl MTT溶液 (5 mg/m1)，在培養(yǎng)箱中孵育4 h，棄培養(yǎng)上清，每孔加入150 μl DMS0，振蕩混勻后培養(yǎng)箱內(nèi)孵育10 min，用酶聯(lián)檢測儀測定波長490 nm下不同時(shí)間的吸光度值。實(shí)驗(yàn)共兩組，分別為空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染N-2a細(xì)胞組、GAL-N-2a穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞克隆組。

N-2a和GAL-N-2a細(xì)胞組的周期分析 不同單克隆細(xì)胞復(fù)蘇后達(dá)80%以上匯合后以2×103/孔的密度接種于12孔板，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72 h，使細(xì)胞貼壁并達(dá)到對數(shù)生長期時(shí)，消化、離心收集細(xì)胞，以1 ml的PBS洗細(xì)胞兩次，加入5 ml 70%預(yù)冷乙醇重懸，于4℃固定過夜，同期收獲對照組。第2天離心收集細(xì)胞，以1 ml的PBS洗細(xì)胞1次，每管加入0.5 ml含有碘化丙啶染料200 μl與打孔劑200 μl的染色液，在室溫下避光孵育30 min，最后1 h內(nèi)上機(jī)以標(biāo)準(zhǔn)程序用流式細(xì)胞儀檢測，一般計(jì)數(shù)2～3萬個(gè)細(xì)胞，結(jié)果用細(xì)胞周期擬和軟件ModFit分析。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以ˉ±s表示，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

陽性細(xì)胞克隆的PCR法鑒定 以G418篩選后所得單克隆細(xì)胞 (不同單克隆細(xì)胞組分別命名為a、b、c、d)基因組DNA為模板進(jìn)行PCR，結(jié)果顯示在近3000 bp(理論值為2896 bp)處有一條明亮的帶，與目的基因片段的預(yù)期位置相符，在非經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞基因中未擴(kuò)增出條帶 (圖1)。

圖1 PCR法檢測PcDNA 3.1-PDGF-GAL在N-2a細(xì)胞的轉(zhuǎn)染結(jié)果Fig 1 Identification of products of PcDNA 3.1-PDGF-GAL transfected into N-2a cells cloned by PCR

細(xì)胞克隆中轉(zhuǎn)錄水平的鑒定 提取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PcDNA 3.1-PDGF-GAL的GAL-N-2a細(xì)胞總RNA，經(jīng)RT-PCR，N-2a組和GAL-N-2a組均有GAL(500 bp)和內(nèi)參(250 bp)的表達(dá) (圖2)，通過凝膠圖像分析軟件對電泳條帶進(jìn)行灰度分析，比較目的片段和內(nèi)參照灰度比值，GAL-N-2a單克隆細(xì)胞組分別為1.68±0.12、0.52±0.04和4.14±0.22，N-2a組為0.63±0.13，實(shí)驗(yàn)組中有兩個(gè)單克隆細(xì)胞組的甘丙肽表達(dá)量明顯高于N-2a組 (P＜0.05)。

細(xì)胞克隆中GAL表達(dá)水平的鑒定 Western blot檢測結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染的N-2a細(xì)胞中表達(dá)的甘丙肽蛋白可以被甘丙肽單抗特異性識別，大小與預(yù)期相同，相對分子質(zhì)量約為3200(圖3)，通過凝膠圖像分析軟件對蛋白條帶進(jìn)行灰度分析，比較目的片段和內(nèi)參照灰度比值，GAL-N-2a單克隆細(xì)胞組分別為4.22±0.26、5.36±0.31和5.43±0.34，N-2a組為0.78±0.15，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組GAL表達(dá)量明顯高于對照組 (P＜0.05)。

圖2 RT-PCR檢測GAL和GAPDH mRNA在細(xì)胞株中的表達(dá)Fig 2 Cellular GAL and GAPDH mRNA expressions were detected by RT-PCR

圖3 Western blot檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PcDNA 3.1-PDGF-GAL細(xì)胞內(nèi)GAL蛋白的表達(dá)Fig 3 Expression of GAL protein in N-2a cells stably transfected with PcDNA 3.1-PDGF-GAL plasmids as analyzed by Western blot

內(nèi)源性過表達(dá)的甘丙肽蛋白對N-2a細(xì)胞增殖的影響 隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，相對于對照正常細(xì)胞組，實(shí)驗(yàn)細(xì)胞組中過表達(dá)的甘丙肽對N-2a細(xì)胞增殖有明顯抑制作用，組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)(表1)。

內(nèi)源性過表達(dá)甘丙肽蛋白對N-2a細(xì)胞周期的影響 單克隆細(xì)胞a、c和d組GO/Gl期的細(xì)胞明顯高于空白對照組 (P＜0.01)，其中以單克隆細(xì)胞d組最高，達(dá)86.75±0.84，同時(shí)S和G2/M期的細(xì)胞減少(P＜0.01)(表2)。

內(nèi)源性過表達(dá)GAL對N-2a細(xì)胞凋亡的影響 應(yīng)用細(xì)胞周期分析方法分析細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示其中1個(gè)單克隆細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)了凋亡峰 (圖4)，凋亡率達(dá)(16.01±1.25)%，而對照組無凋亡峰出現(xiàn)。

討 論

小鼠丙肽由29個(gè)氨基酸組成，是羧基末端酰胺化的肽類物質(zhì)。早期研究表明甘丙肽參與促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng) (元)的生長、發(fā)育和再生，如在外周痛覺神經(jīng)損傷后背根神經(jīng)節(jié)甘丙肽表達(dá)有較強(qiáng)的上調(diào)等，甘丙肽作為腦內(nèi)重要的神經(jīng)肽之一，已被證明不但參與許多神經(jīng)系統(tǒng)的重要功能活動，還具有抗腫瘤作用［4-5］，但在不同組織甘丙肽的作用主要取決于與GALR1-3中不同受體的作用，如在人垂體腺瘤中可同時(shí)檢測到甘丙肽及其受體GALR1和GALR2基因的mRNA，但是GALR3 mRNA僅出現(xiàn)在手術(shù)治療后又復(fù)發(fā)患者的垂體腺瘤組織中，這項(xiàng)成果為垂體腺瘤患者的預(yù)后提供了重要依據(jù)［6］。

表1 兩組不同時(shí)間點(diǎn)的吸光度值 (n=6，±s)Table 1 Absorbance values in two groups at different time points(n=6，±s)

表1 兩組不同時(shí)間點(diǎn)的吸光度值 (n=6，±s)Table 1 Absorbance values in two groups at different time points(n=6，±s)

與正常細(xì)胞組比較，aP＜0.01aP＜0.01 compared with normal cell group

Group 0 h 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h正常細(xì)胞組Normal cell group 1.02±0.06 1.12±0.06 2.33±0組別.07 3.08±0.10 2.80±0.08 2.41±0.12單克隆細(xì)胞組Monoclonal cell group 1.03±0.06 0.89±0.07a 2.09±0.85a 2.47±0.08a 2.21±0.11a 2.08+0.11a

表2 各組G1、G2和S期細(xì)胞所占比例 (n=4，±s)Table 2 G1，G2，and S phases of N-2a cells in different groups(n=4，±s)

表2 各組G1、G2和S期細(xì)胞所占比例 (n=4，±s)Table 2 G1，G2，and S phases of N-2a cells in different groups(n=4，±s)

與正常細(xì)胞組比較，aP＜0.01aP＜0.01 compared with normal cell group

S phase正常細(xì)胞組 Normal cell group 52.37±1.06 15.50±0.21 32.1組別Group G1期G1 phase G2期G2 phase S期4±1.27單克隆細(xì)胞a組Monoclonal cell group a 64.01±2.01a 11.09±0.60a 24.90±2.60a單克隆細(xì)胞c組Monoclonal cell group c 57.05±1.01a 17.97±0.99a 24.97±0.02a單克隆細(xì)胞d組Monoclonal cell group d 86.75±0.84a 10.30±1.43a 2.95±2.26a

圖4 各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的凋亡率Fig 4 N-2a cell apoptosis rate in different groups

本研究通過繪制細(xì)胞生長曲線了解細(xì)胞生長規(guī)律以保證轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞活力處于最佳狀態(tài)，轉(zhuǎn)染過程嚴(yán)格按照轉(zhuǎn)染試劑說明書步驟操作及參考相關(guān)文獻(xiàn)［7］通過調(diào)節(jié)配制核酸脂質(zhì)體復(fù)合物所用的培養(yǎng)基pH等措施，以攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的真核表達(dá)載體pEGFPN1進(jìn)行轉(zhuǎn)染預(yù)實(shí)驗(yàn)從而獲得轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)最優(yōu)化參數(shù)，如轉(zhuǎn)染時(shí)間、細(xì)胞匯合度、DNA與脂質(zhì)體的比例和轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基的pH等，為實(shí)現(xiàn)GAL在N-2a的相對高效表達(dá)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。研究證實(shí)轉(zhuǎn)染前細(xì)胞匯合度達(dá)80%～90%，當(dāng)DNA與脂質(zhì)體的比例為1∶3，可適當(dāng)提高DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物的利用率，在轉(zhuǎn)染48 h達(dá)最佳轉(zhuǎn)染效率，通過對轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基pH的調(diào)節(jié)，當(dāng)pH分別為7.8時(shí)，細(xì)胞綠色熒光蛋白陽性率較高，并且對細(xì)胞生長情況無明顯影響［8］。

本研究先采用LipofectamineTM2000將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至N-2a細(xì)胞，然后通過G418篩選成功建立了一個(gè)在基因組DNA中穩(wěn)定整合有PcDNA 3.1-PDGFGAL的PDGF-GAL-N-2a細(xì)胞克隆。將不同細(xì)胞克隆擴(kuò)增后提取總RNA和蛋白，利用RT-PCR、Western blot檢測到N-2a細(xì)胞中GAL基因相對于對照組細(xì)胞在mRNA和蛋白水平均實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定高表達(dá)，該細(xì)胞株可穩(wěn)定傳代達(dá)10次以上。

有研究表明GAL作為一種重要的神經(jīng)內(nèi)分泌物質(zhì)存在于多種神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤組織和非神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤組織中并參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展［9］，例如嗜鉻細(xì)胞瘤、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞瘤、垂體腺瘤、膠質(zhì)瘤等多種人類腫瘤中均檢測到上調(diào)的甘丙肽樣免疫反應(yīng) (Gal-LI)的細(xì)胞［10］，提示GAL與腫瘤密切相關(guān)。本研究無論是轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒后的實(shí)驗(yàn)對照組細(xì)胞，還是轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后獲得的單克隆細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組，經(jīng)RT-PCR和Western blot法均能檢測到GAL mRNA和GAL蛋白的表達(dá)，其中實(shí)驗(yàn)組明顯高于對照組。經(jīng)MTT法測定顯示甘丙肽對N-2a細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用。

本研究顯示細(xì)胞周期異常重啟可能是甘丙肽蛋白誘導(dǎo)N-2a凋亡的重要機(jī)制。細(xì)胞周期是可分裂細(xì)胞通過一系列細(xì)胞事件實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分化或增殖的過程。真核生物的細(xì)胞周期包括Gl期 (DNA合成前期)、S期(DNA合成期)、G2期 (DNA合成后期)和 M期(分裂期)4個(gè)時(shí)相。要啟動并完成細(xì)胞周期，必須有持續(xù)的刺激使細(xì)胞周期越過檢測點(diǎn)，其中最關(guān)鍵的是Gl/S和G2/M兩個(gè)檢測點(diǎn)。本研究用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞DNA含量，顯示內(nèi)源性過表達(dá)GAL的N-2a細(xì)胞單克隆大部分處于GO/G1期，相比對照組細(xì)胞，單克隆細(xì)胞有明顯的凋亡趨勢，這對于甘丙肽在癌癥及神經(jīng)系統(tǒng)類疾病發(fā)生發(fā)展中的角色和作用有了更進(jìn)一步的認(rèn)識。

鑒于可比性考慮，本研究測定內(nèi)源性過表達(dá)甘丙肽對N-2a細(xì)胞增殖和凋亡的影響中實(shí)驗(yàn)組均系同一單克隆細(xì)胞株，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄和Western blot表明該單克隆細(xì)胞株甘丙肽表達(dá)量相對最高。

綜上，本研究建立穩(wěn)定表達(dá)甘丙肽的細(xì)胞株，實(shí)現(xiàn)了外源甘丙肽基因在N-2a細(xì)胞的表達(dá)，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中甘丙肽轉(zhuǎn)基因小鼠的制備提供了理論依據(jù);有關(guān)內(nèi)源性過表達(dá)甘丙肽蛋白對N-2a細(xì)胞增殖、周期和凋亡的初步研究為臨床腫瘤治療提供了理論基礎(chǔ)，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。然而內(nèi)源性甘丙肽對N-2a細(xì)胞增殖和凋亡的作用具體是通過哪個(gè)受體及作用機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究。

(志謝:感謝實(shí)驗(yàn)動物中心張引紅老師、郭永昌老師、衛(wèi)兵艷師姐等在學(xué)習(xí)和科研工作方面給予的指導(dǎo)和幫助。)

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