以DA-64 為顯色劑吡喃糖氧化酶法測(cè)定血清1,5-脫水葡糖醇

潘利琴 張德亭 夏淑琦 連國(guó)軍 趙長(zhǎng)容

(1.溫州市人民醫(yī)院,浙江 溫州 325000;2.溫州醫(yī)學(xué)院,浙江 溫州 325000)

血清1,5-脫水葡萄糖醇(1,5-AG)的監(jiān)測(cè)可確切地反映較短期內(nèi)糖尿病的控制程度,其診斷糖尿病的價(jià)值已被臨床充分重視[1]。測(cè)定1,5-AG的方法包括目前主要的測(cè)定方法GK-PROD 酶偶聯(lián)兩點(diǎn)法,均不能有效去除高濃度的葡萄糖干擾,易使1,5-AG 的測(cè)定結(jié)果偏高。因此,如何有效提高抗葡萄糖干擾能力是建立新的1,5-AG 測(cè)定方法的關(guān)鍵技術(shù)。根據(jù)參考文獻(xiàn),通過(guò)酶法途徑將葡萄糖分解為磷酸二羥丙酮和3-磷酸甘油醛,并使用一種新型的水溶性顯色劑N-(羧甲基氨基羰基)-4,4-二(甲基氨基)-聯(lián)苯胺(DA-64)對(duì)反應(yīng)過(guò)程中生成的過(guò)氧化氫(H2O2)進(jìn)行定量,在此基礎(chǔ)上建立了新的吡喃糖氧化酶法用于測(cè)定血清1,5-AG,現(xiàn)將此方法的應(yīng)用及評(píng)價(jià)情況報(bào)道如下。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 (1)UV -2201 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津);(2)奧林巴斯5400 全自動(dòng)生化分析儀;(3)CB171(A)半自動(dòng)生化分析儀(上海合意檢驗(yàn)設(shè)備有限公司);(4)pH-3C 酸度計(jì)(上海雷磁分析儀器廠)。

1.2 試劑 (1)1,5-AG 校準(zhǔn)品：凍干品,臨用前用1mL 去離子水復(fù)溶,2～8℃保存穩(wěn)定15 天,由浙江夸克生物科技有限公司提供。(2)試劑I(R1)：含50mmol/L pH8.0 Tris-HCl 緩沖液、30 KU/L ATP 依賴性葡萄糖激酶(ATP-GK)、50 KU/L 磷酸葡萄糖異構(gòu)酶(PGI)、20KU/L 6-磷酸果糖激酶(PFK)、20KU/L 果糖-1,6-二磷酸醛縮酶(FDA)、10KU/L抗壞血酸氧化酶(ASO)、10KU/L 膽紅素氧化酶、2.0 mmol/L ATP;(3)試劑II(R2)：含50 mmol/L pH8.0 Tris-HCl 緩沖液、200 KU/L 吡喃糖氧化酶(PROD)、30KU/L 過(guò)氧化物酶(POD)、3.2mmol/L DA-64。所用酶購(gòu)自日本旭化成公司,DA-64 購(gòu)自日本Dojindo 公司,其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純,水為去離子水。

2 方法與結(jié)果

2.1 原理 (1)用ATP 依賴性葡萄糖激酶(ATPGK)、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶(PGI)、6-磷酸果糖激酶(PFK)、果糖-1,6-二磷酸醛縮酶(FDA)將主要干擾物葡萄糖分解為磷酸二羥丙酮和3-磷酸甘油醛;其他干擾物抗壞血酸、黃疸分別在抗壞血酸氧化酶、膽紅素氧化酶作用下得以清除;(2)血清中1,5-脫水葡糖醇被吡喃糖氧化酶氧化產(chǎn)生H2O2并使DA-64 氧化顯色,用全自動(dòng)生化分析儀比色定量;(3)計(jì)算血清1,5-AG 濃度(C),C=(A2-A1)血清/(A2-A1)標(biāo)準(zhǔn)×C標(biāo)計(jì)算,其中C 為血清1,5-AG 濃度(μmol/L),C標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(μmol/L)。

2.2 參數(shù)設(shè)定 反應(yīng)類型為兩點(diǎn)終點(diǎn)法;反應(yīng)溫度：37℃;主/副波長(zhǎng)：700/800nm;樣 品5μL,加試劑R1240 μL 反應(yīng)3.5分鐘后讀取第1 點(diǎn)吸光度A1,加入試劑R280 μL 繼續(xù)反應(yīng)5分鐘后讀取第2 點(diǎn)吸光度A2。

2.3 結(jié)果

2.3.1 吸收光譜 以試劑空白為參比,測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)管、測(cè)定管兩者絡(luò)合物最大吸收波長(zhǎng)均在725nm處,由于日本Olympus AU5400 全自動(dòng)生化儀無(wú)此波長(zhǎng),故選用靠近725nm 的700 nm 為自動(dòng)分析法的測(cè)定主波長(zhǎng),并且選用800nm 為測(cè)定副波長(zhǎng),以減少脂濁、黃疸、溶血、血清本身顏色等對(duì)吸光度的影響。

2.3.2 抗干擾能力 在一份1,5-AG 濃度為375 μmol/L 的血清標(biāo)本中,加入不同濃度的葡萄糖、抗壞血酸、膽紅素、三酰甘油、血紅蛋白等干擾物,以測(cè)定的相對(duì)誤差在±5%內(nèi)為不干擾。結(jié)果表明,在本法測(cè)定條件下,樣品中各干擾物質(zhì)的最大允許濃度為：葡萄糖85 mmol/L、血清膽紅素350 μmol/L、三酰甘油(TG)8.0 mmol/L、血紅蛋白5.0 g/L、抗壞血酸320 mmol/L,說(shuō)明本法具有良好的選擇性。

2.3.3 反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線及讀數(shù)點(diǎn)選擇 取濃度分別為56、287、505 μmol/L 三份血清樣本,在37℃條件下,將樣本與R1 混合后觀察反應(yīng)曲線,結(jié)果表明從反應(yīng)開(kāi)始到5分鐘所測(cè)得的吸光度沒(méi)有明顯變化;加入R2 后觀察5分鐘之內(nèi)的反應(yīng)曲線變化,結(jié)果表明三份血清樣本在加入R2 4分鐘后已經(jīng)完全達(dá)到終點(diǎn)。結(jié)合奧林巴斯AU 5400 全自動(dòng)生化分析儀的參數(shù)設(shè)置要求,實(shí)驗(yàn)選擇R1 與樣本反應(yīng)3.5分鐘后讀取第1 點(diǎn)吸光度A1,加入R2 繼續(xù)反應(yīng)5分鐘后讀取第2 點(diǎn)吸光度A2。

2.3.4 校準(zhǔn)曲線 取一份1,5-AG 濃度為550 μmol/L 的高值標(biāo)本,采用樣本量稀釋模式(生理鹽水)制備成0、68.8、137.5、275、550 μmol/L 5個(gè)濃度,每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定3次,結(jié)果表明本法線性范圍可達(dá)550 μmol/L(圖1),回歸方程和相關(guān)系數(shù)分別為Y(測(cè)量值)=0.978X(理論值)+1.71,r=0.9999。

圖1 本法的校準(zhǔn)曲線

2.3.5 靈敏度 用本法連續(xù)測(cè)定空白樣本(生理鹽水)20次,計(jì)算和s,根據(jù)最低檢測(cè)限(LLD)=+3s,得LLD 為1.05 μmol/L。

2.3.6 精密度 取三份不同1,5-AG 濃度的混合血清,按本法測(cè)定,批內(nèi)精密度和批間精密度分別為1.03%～2.88%和1.87%～3.78%,詳見(jiàn)表1。

表1 血清1,5-AG 檢測(cè)精密度(n=20,±s)

表1 血清1,5-AG 檢測(cè)精密度(n=20,±s)

注：*每個(gè)樣品用本法平行檢測(cè)20次;△同一樣品用本法連續(xù)檢測(cè)20 天

2.3.7 回收率試驗(yàn) 按本法測(cè)定,在已測(cè)得1,5-AG 為112 μmol/L 的血清標(biāo)本中分別加入100、200、300μmol/L 的1,5-AG 純組份進(jìn)行回收試驗(yàn),血清1,5 -AG 的回收率分別為103.4%、100.2%、97.6%,平均回收率為100.4%。

2.3.8 方法對(duì)比試驗(yàn) 用本法(Y)和參考方法(X)[2]分別測(cè)定50例血清標(biāo)本,本法的測(cè)定結(jié)果為(128.9±88.3)μmol/L(n=50),參考方法的測(cè)定結(jié)果為(128.7±87.2)μmol/L(n=50),回歸方程Y=1.011X-1.137,r=0.9987,經(jīng)配對(duì)t 檢驗(yàn),兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.3.9 試劑穩(wěn)定性 將新配的1,5-AG 測(cè)定試劑分成A、B 兩組,A組在4℃冰箱中開(kāi)蓋儲(chǔ)存30 天,B組在4℃冰箱加蓋儲(chǔ)存12個(gè)月。兩組試劑到達(dá)儲(chǔ)存時(shí)間后,空白管及標(biāo)準(zhǔn)管吸光度值基本恒定,對(duì)含量為(75.0±7.5)μmol/L 的1,5-AG 質(zhì)控品進(jìn)行測(cè)定,A組試劑測(cè)定值為(74.2±4.7)μmol/L,B組試劑測(cè)定值為(73.3±5.2)μmol/L,與原值比較均無(wú)顯著性差異(P＞0.05),說(shuō)明本法1,5-AG 測(cè)定試劑具有良好的穩(wěn)定性

2.3.10 參考值 選擇200例體檢合格的成年人,男100例,女100例,年齡18～60歲?？崭轨o脈采血,用本法測(cè)得血清1,5-AG 濃度為：(168±50)μmol/L,參考范圍(±2s)為：68～268μmol/L,與文獻(xiàn)[2-5]報(bào)告基本一致。

3 討論

在建立血清1,5-AG 的勻相自動(dòng)分析法的過(guò)程中,由于吡喃糖氧化酶底物特異性不佳,血清葡萄糖是需要重點(diǎn)排除的干擾物。Fukumura 等[2]、陳國(guó)軍等[3]在測(cè)定1,5-AG 時(shí),將葡萄糖通過(guò)葡萄糖激酶(GK)轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖,由于葡萄糖轉(zhuǎn)化地不徹底,常導(dǎo)致1,5-AG 測(cè)定結(jié)果假性升高。馮景等[4-5]通過(guò)葡萄糖激酶(GK)和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)將樣品中葡萄糖(Glu)轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖內(nèi)酯(G6PL),該法具有較好的抗干擾性,但當(dāng)葡萄糖濃度大于44.4mmol/L 時(shí)仍然會(huì)對(duì)1,5-AG 的測(cè)定帶來(lái)干擾。本文在用ATP 依賴性葡萄糖激酶(ATP-GK)、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶(PGI)、6-磷酸果糖激酶(PFK)、果糖-1,6-二磷酸醛縮酶(FDA)構(gòu)建的酶法轉(zhuǎn)化途徑將葡萄糖分解為磷酸二羥丙酮和3-磷酸甘油醛,結(jié)果表明,高達(dá)85.0mol/L 的葡萄糖水平也不會(huì)干擾本法測(cè)定。血清中的抗壞血酸和膽紅素可以消耗反應(yīng)過(guò)程中生成的過(guò)氧化氫而對(duì)1,5-AG 的測(cè)定具有負(fù)干擾,可以分別通過(guò)抗壞血酸氧化酶、膽紅素氧化酶等的作用得以消除。此外,目前文獻(xiàn)報(bào)道的Trinder' s 反應(yīng)色源多為N-乙基-N-2-羥基-3-磺丙基-3-甲基苯胺鈉鹽(TOOS)、2,4,6-三溴間羥基苯甲酸(TBHBA)等,顯色后最大波長(zhǎng)在550nm 及更短波長(zhǎng),抗三酰甘油、血紅蛋白的能力并不強(qiáng)。在本文介紹的1,5-AG 測(cè)定試劑中,使用了一種新型的水溶性顯色劑N-羧甲基氨基羰基-4,4-二甲基氨基-聯(lián)苯胺(DA-64),吸收光譜掃描結(jié)果表明,標(biāo)準(zhǔn)管、測(cè)定管二者絡(luò)合物最大吸收波長(zhǎng)均在725nm,遠(yuǎn)離脂濁、血紅蛋白等干擾物質(zhì)的最大吸收峰,使測(cè)定試劑抗干擾能力進(jìn)一步增強(qiáng)。

通過(guò)動(dòng)力學(xué)曲線研究發(fā)現(xiàn),線性范圍的高低顯著依賴于試劑R2 中PROD 酶的用量。R2 中PROD酶的濃度越小,反應(yīng)到達(dá)終點(diǎn)所需的時(shí)間越長(zhǎng),方法的線性范圍越窄;當(dāng)R2 中PROD 酶為200KU/L時(shí),550 μmol/L 的1,5-AG 可在加入R2 4分鐘后達(dá)到反應(yīng)終點(diǎn)。校準(zhǔn)曲線測(cè)試表明,在本法選定的實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)定1.5-AG,線性范圍至少可達(dá)550 μmol/L(圖1)。

為了觀察本法的準(zhǔn)確性,本文進(jìn)行了回收率試驗(yàn)和方法對(duì)比試驗(yàn),結(jié)果表明,本法的平均回收率為100.4%,測(cè)試結(jié)果與參考方法相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),提示本法具有良好的準(zhǔn)確性。此外本法也具有較高的靈敏度(LLD=1.05 μmol/L)和較好的重復(fù)性(批內(nèi)和批間CV分別為1.03%～2.88%和1.87%～3.78%)。另外測(cè)定200例體檢合格的成年人血清1,5-AG,其參考范圍為68～268 μmol/L,與文獻(xiàn)[2-5]報(bào)告基本一致;測(cè)定試劑置4℃開(kāi)蓋儲(chǔ)存可穩(wěn)定30 天,加蓋儲(chǔ)存可穩(wěn)定12個(gè)月,具備臨床實(shí)際推廣應(yīng)用價(jià)值。

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