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    萎胃湯對(duì)大鼠血清SOD活性、MDA、GAS的影響研究

    2013-11-07 08:22:14張倫劉蔚戈焰榮尚一
    關(guān)鍵詞:湯高胃泌素胃液

    ★ 張倫 劉蔚 戈焰 榮尚一

    (1.廣東省第二中醫(yī)院 廣州 510095;2.南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與熱帶醫(yī)學(xué)學(xué)院 廣州 510515)

    慢性萎縮性胃炎屬于中醫(yī)學(xué)“胃脘痛”、“胃痞”等范疇[1]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為本病病因不外乎飲食不節(jié)、情志所傷與脾胃虛弱。慢性萎縮性胃炎患者久病脾虛,加之調(diào)養(yǎng)失當(dāng),外邪侵襲等因素,使中氣更虛不足以行血,漸致壅滯成瘀。脾虛血瘀證是慢性萎縮性胃炎中醫(yī)學(xué)臨床最常見證型,萎胃湯驗(yàn)之臨床屢獲良效,本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究萎胃湯可能的作用機(jī)制,為今后更深一步的研究工作打下基礎(chǔ),現(xiàn)將動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究報(bào)告如下。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠,雌雄各半,體重180-220g,由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(粵)2003-0002。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境:廣東省中醫(yī)研究所SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào):SCXK(粵)2005-0059,溫度20℃-25℃,濕度60%-70%,SPF級(jí)大鼠飼料,飲用無(wú)菌水。

    1.1.2 藥品 試驗(yàn)藥:萎胃湯(黃芪、黨參、當(dāng)歸、白術(shù)、甘草、枳殼、石斛、雞內(nèi)金、山楂、三七、莪術(shù)),由廣東省第二中醫(yī)院中藥房提供,單味顆粒劑由廣東省一方制藥廠生產(chǎn);對(duì)照藥:胃復(fù)春片(成分為紅參、香茶菜、炒枳殼等),杭州胡慶余堂藥業(yè)有限公司生產(chǎn),國(guó)藥準(zhǔn)字:Z200040003,批號(hào):090604。

    1.2 方法

    1.2.1 MNNG飲用液配制 用滅菌自來(lái)水將MNNG配制成10mg/L濃度的儲(chǔ)存液,避光冷藏保存,用時(shí)將其配成1 500 μg/mL的飲用液,裝入200mL的飲水瓶中,外貼黑色避光紙,整個(gè)配制過程全部避光操作。

    1.2.2 劑量設(shè)置 以藥品說明書標(biāo)示臨床日用量作為基礎(chǔ),參考《中藥藥理研究方法學(xué)》中的劑量換算方法“體表面積比”換算動(dòng)物試驗(yàn)劑量作為臨床等效劑量。換算后,胃復(fù)春片為0.54g/kg(2倍臨床等效劑量),萎胃湯高劑量為20.8 g生藥/kg、中劑量為10.4 g生藥/kg、低劑量為5.2 g生藥/kg(分別為4倍臨床等效劑量、2倍臨床等效劑量、臨床等效劑量)。

    1.2.3 動(dòng)物造模 取SPF級(jí)SD大鼠70只,雌雄各半,常規(guī)喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)抽取雌雄各5只作為空白對(duì)照組,其余大鼠采用1 500 μg/mL的MNNG飲水加饑飽失常的方法復(fù)制CAG模型[2-3],連續(xù)3個(gè)月。具體操作如下。

    (1)MNNG溶液自由飲用:濃度為1 500 μg/mL的MNNG溶液,裝入外涂黑色的飲水瓶中,每天更換并給足量,自由飲用。

    (2)饑飽失常:2d足量喂食,1d停食,循環(huán)實(shí)施。

    3個(gè)月后,隨機(jī)抽取5只動(dòng)物,脫頸椎處死動(dòng)物,迅速取胃。經(jīng)病理組織學(xué)檢查,判斷動(dòng)物造模情況。造模成功標(biāo)準(zhǔn):參照《中藥(新藥)臨床研究指導(dǎo)原則》(2002)中GAG的病理診斷標(biāo)準(zhǔn),經(jīng)病理確診:①固有腺體萎縮;②黏膜肌層增厚;③可有腸上皮化生或假幽門腺上皮化生;④固有膜炎癥;⑤可有淋巴濾泡形成。

    CAG動(dòng)物模型復(fù)制成功后,稱重,10只/組,將造模動(dòng)物按體重隨機(jī)均分為模型組、胃復(fù)春組(0.54g/kg)、萎胃湯高(20.8 g生藥/kg)、中(10.4 g生藥/kg)、低(5.2 g生藥/kg)劑量組(分別為4、2、1倍臨床等效劑量)。

    1.2.4 給藥方法 各組大鼠按劑量灌胃給藥,10mL/kg,1次/d,空白對(duì)照組給予等體積蒸餾水。連續(xù)12周。

    1.2.5 指標(biāo)檢測(cè)與標(biāo)本采集 測(cè)定胃酸、血清SOD活性、MDA、胃泌素含量。

    胃酸測(cè)定:于末次給藥后,大鼠禁食24 h,禁水8 h,眼眶采血;用25%烏拉坦腹腔注射麻醉,剖腹,結(jié)扎幽門、賁門,取出全胃,沿胃大彎剖開胃腔,傾出內(nèi)容物,用5.0 mL生理鹽水沖洗,收集于沖洗液于離心管中,3 000 rpm離心20 min,吸取上清液1.0 mL,用PH計(jì)測(cè)量pH值,計(jì)算原胃液PH值;二步滴定法[4]測(cè)胃液總酸度。將血液于3 000rmp離心10min,吸取血清。嚴(yán)格按照試劑盒說明書,測(cè)定血清中的SOD活性、胃泌素、MDA含量。

    1.3 統(tǒng)計(jì)方法

    計(jì)量資料多組間均數(shù)的比較先采用單因素方差分析,方差齊時(shí),以均值加減標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間的均數(shù)兩兩比較用SNK法;方差不齊時(shí),以平均秩次、下四分位數(shù)、中位數(shù)和上四分位數(shù)(P25,P50,P75)表示,多組間平均秩次比較用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn),組間平均秩次的兩兩比較用Mann-Whitney U法。以上數(shù)據(jù)均由SPSS15.0完成,α=0.05。

    2 研究結(jié)果

    2.1 一般情況

    CAG模型大鼠精神萎靡、眼睛無(wú)神、活動(dòng)緩慢,毛發(fā)色澤枯稿、疏松粗糙、豎毛、易脫落,食量減少,常有便溏、形體偏小,耳色淡白,拱背,喜扎堆,消瘦、體重增加緩慢。治療期間,空白組未發(fā)現(xiàn)上述表現(xiàn),各治療組大鼠經(jīng)治療后,其毛色、精神狀態(tài)、食欲、大便、活動(dòng)情況等均有不同程度的改善,而以萎胃湯高、中劑量組最好、萎胃湯低劑量組和胃復(fù)春組次之,模型組最差。

    2.2 對(duì)CAG大鼠胃液PH值、胃泌素的影響

    與空白對(duì)照組比較,各組大鼠胃液PH顯著升高(均P<0.01);與模型組相比,胃復(fù)春組、萎胃湯高、中、低3個(gè)劑量組大鼠胃液PH均顯著性降低(P<0.01);與胃復(fù)春組相比,萎胃湯高、中劑量組大鼠胃液PH有顯著性降低(均P<0.01),萎胃湯低劑量組大鼠胃液PH降低不明顯(P>0.05)。

    與空白對(duì)照組相比較,模型組大鼠胃液總酸度和血清胃泌素含量顯著降低(P<0.01);與模型組相比,萎胃湯高、中、低3個(gè)劑量組和胃復(fù)春組大鼠胃液總酸度和血清胃泌素含量顯著升高(均P<0.01);與胃復(fù)春組相比,萎胃湯低劑量組大鼠胃液胃液總酸度無(wú)顯著性差異(P>0.05),萎胃湯低劑量組大鼠血清胃泌素含量有顯著性升高(P<0.01),萎胃湯高、中劑量組大鼠胃液胃液總酸度和血清胃泌素含量均顯著性升高(均P<0.01)。

    表1 萎胃湯對(duì)CAG大鼠PH值、總酸度、胃泌素含量的影響(±s)

    表1 萎胃湯對(duì)CAG大鼠PH值、總酸度、胃泌素含量的影響(±s)

    注:與空白組比較,*P<0.05,**P<0.01;與模型組#P<0.05,##P<0.01;與胃復(fù)春組比較,§P<0.05,§§P<0.01.

    分組血清胃泌素/pg?mL-1 145.58±7.38##§§73.89±8.71**§§95.17±7.21**##129.85±5.27##§§120.53±13.18**##§§112.89±7.17**##§§空白組模型組胃復(fù)春組高劑量組中劑量組低劑量組胃液pH值2.11±0.52##§§5.17±0.52**§§4.48±0.45**##2.99±0.49**##§§3.43±0.43**##§§4.27±0.57**##總酸度/mmol?L-1 150.60±14.87##§§75.45±4.53**§§95.86±3.84**##132.56±12.92**##§§120.64±10.84**##§§105.45±8.90**##

    2.3 對(duì)大鼠血清SOD(超氧化物歧化酶)活性和MDA(丙二醛)含量的影響

    與空白對(duì)照組相比較,模型組CAG大鼠血清SOD活性顯著降低(P<0.01);與模型組相比較,胃復(fù)春組和萎胃湯高、中、低3個(gè)劑量組SOD活性顯著升高(均P<0.01);與胃復(fù)春組相比較,萎胃湯高劑量組SOD活性顯著升高(P<0.01),萎胃湯中、低劑量組SOD活性亦有升高但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

    與空白對(duì)照組相比較,模型組CAG大鼠MDA顯著升高(P<0.01);與模型組相比較,胃復(fù)春組和萎胃湯高、中、低3個(gè)劑量組MDA顯著降低(均P<0.01);與胃復(fù)春組相比較,萎胃湯高劑量組MDA顯著降低(P<0.01),萎胃湯中、低劑量組MDA亦有降低但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

    表2 萎胃湯對(duì)CAG大鼠血清SOD和MDA的影響(±s)

    表2 萎胃湯對(duì)CAG大鼠血清SOD和MDA的影響(±s)

    注:與空白組比較,*P<0.05,**P<0.01;與模型組#P<0.05,##P<0.01;與胃復(fù)春組比較,§P<0.05,§§P<0.01.

    MDA/mmol?L-1 9.48±2.06##§§16.88±1.06**§§14.29±0.98**##10.96±1.61*##§§12.96±1.83**##13.58±1.50**##分組空白組模型組胃復(fù)春組高劑量組中劑量組低劑量組SOD/U?mL-1 152.61±10.37##§§97.84±9.95**§§132.93±11.49**##150.13±12.84##§§137.14±9.12**##137.53±6.68**##

    2.4 不良事件發(fā)生率

    2組大鼠于灌藥期間均無(wú)出現(xiàn)死亡、消化道出血、血尿等的不良事件,提示萎胃湯為安全的藥物。

    3 討論

    本研究采用以MNNG為主的加饑飽失常法復(fù)制CAG大鼠模型。造模開始后6周大鼠即開始出現(xiàn)活動(dòng)量、飲食量、體重、毛色、二便等方面的異常變化,至12周時(shí)上述改變更加明顯,而且胃粘膜肉眼觀和顯微鏡鏡下觀呈不同程度的萎縮、胃壁厚變薄、彈性降低、皺壁減少、黏膜色澤發(fā)白或變暗,有出血點(diǎn)等情況的發(fā)生,符合人類CAG的臨床和病理特征。

    近年來(lái),超氧化物歧化酶(SOD)的防御和修復(fù)氧代謝產(chǎn)物的損傷作用得到了廣泛的重視,測(cè)定SOD可在一定程度上反映機(jī)體清除自由基能力的大小。丙二醛(MDA)是脂質(zhì)過氧化的最終分解產(chǎn)物,可與脂質(zhì)過氧化中間產(chǎn)物自由基損傷膜結(jié)構(gòu),改變膜成分的活性及抗原性而影響膜的正常功能。因此,MDA水平是脂質(zhì)過氧化物損傷效應(yīng)的特征性指標(biāo)。蔣時(shí)紅等[5]在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),慢性萎縮性胃炎(CAG)大鼠模型血清和胃黏膜SOD水平明顯下降,而MDA水平明顯升高,表明CAG大鼠脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強(qiáng),超出了抗氧化系統(tǒng)的抗氧化能力,使MDA增高,自由基代謝異常起著重要作用。

    胃泌素主要由胃竇G細(xì)胞釋放,除存在于血液和組織中,也存在于胃液內(nèi),具有刺激胃酸分泌,促使胃腸粘膜的蛋白質(zhì)、RNA、DNA的合成,促使胃腸粘膜的生長(zhǎng)與更新速度加快等作用。還能引起幽門括約肌松弛,胃竇肌收縮,加快胃排空。在CAG時(shí)由于腺體萎縮,腸上皮化生,G細(xì)胞數(shù)量減少,GAS分泌下降,由于失去了激素的營(yíng)養(yǎng)作用,胃粘膜進(jìn)一步萎縮,腸化加劇,形成惡性循環(huán)。因此,檢測(cè)胃酸、胃蛋白酶活性及血清胃泌素含量對(duì)于CAG的診斷及藥物療效的判定,具有非常重要的意義。

    本研究提示萎胃湯各劑量組均能改善CAG模型大鼠的生存質(zhì)量:即大鼠的精神狀況、飲食量、活動(dòng)度、體重、毛色、二便等一般情況,且萎胃湯高、中劑量組較對(duì)照藥胃復(fù)春為好。在改善胃液PH方面,萎胃湯高、中、低3個(gè)劑量組大鼠均顯著性降低胃液PH值(P<0.01),且萎胃湯高、中劑量組較胃復(fù)春組大鼠胃液PH值亦有顯著性降低(均P<0.01)。在胃酸分泌功能方面,萎胃湯高、中、低3個(gè)劑量組和胃復(fù)春組均升高了胃泌素的分泌情況(均有P<0.01),且萎胃湯高、中劑量組較胃復(fù)春組大鼠胃泌素亦有顯著性升高(均P<0.01)。在抗氧化能力方面亦有改善,萎胃湯3個(gè)劑量組均顯著升高了SOD活性(均P<0.01),降低MDA的含量(均P<0.01)。通過實(shí)驗(yàn)研究也可以看出,治療作用中以萎胃湯高劑量效果最好;治療劑量呈現(xiàn)了一定的劑量正相關(guān)關(guān)系。通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步闡明了萎胃湯治療慢性萎縮性胃炎的作用機(jī)制。

    [1]白兆芝,張彥敏,張潤(rùn)順,等.胃安泰膠囊治療慢性萎縮性胃炎癌前病變的臨床研究[J].上海中醫(yī)藥雜志,2005,39(2):16-17.

    [2]陳云逸.胃癌動(dòng)物模型研究進(jìn)展[J].腫瘤基礎(chǔ)與臨床,2006,19(1):751.

    [3]雪輝,王建國(guó).大鼠慢性萎縮性胃炎模型的建立[J].張家口醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2002,19(2):11.

    [4]陳奇.中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1994:859.

    [5]蔣時(shí)紅,劉旺根,王雪萍,等.黃芪建中湯對(duì)脾虛型慢性萎縮性胃炎大鼠血象、血液和胃黏膜生化指標(biāo)的影響[J].中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志,2006,12(4):279-281.

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