延魚止痛顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

★ 畢曉黎 程青云 李素梅

（1.廣東省中醫(yī)研究所 廣州 510095；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 廣州 510405）

延魚止痛顆粒是廣東省第二中醫(yī)院醫(yī)院制劑，由黃連，魚腥草，延胡索，白花蛇舌草，茵陳，蒲公英，川楝子等藥物組成，具有清胃祛濕、疏肝理氣、和胃止痛的功效。在臨床上常用于治療慢性淺表性胃炎，屬脾胃濕熱兼肝郁氣滯證型者，癥見胃脘部疼痛或脹滿，或牽連兩脅，噯氣，反酸，燒心，納呆，口干苦或口臭，尿黃，大便不爽等，具有較好的治療效果。其中君藥為黃連[1]，具有清熱燥濕，瀉火解毒的作用，以清胃火濕熱見長(zhǎng)。延胡索[1]為臣藥，具有化瘀止痛的作用。為了更好地控制其內(nèi)在質(zhì)量，保證臨床療效。本文采用薄層色譜法對(duì)處方中延胡索、枳殼、魚腥草進(jìn)行了定性鑒別，采用高效液相色譜法對(duì)處方中鹽酸小檗堿的含量進(jìn)行了測(cè)定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1100高效液相色譜儀（美國(guó)）；DAD檢測(cè)器；CAMAG AUTOMAIC TLC SAMPER 4全自動(dòng)薄層點(diǎn)樣儀（瑞士）；CAMAG Reprostar 3薄層成像系統(tǒng)（瑞士）；KQ5200 DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山）；PBQ-II型薄層自動(dòng)鋪板器（重慶）；電熱恒溫干燥箱：DHG-9070A（上海）：METILER XS 205DU電子分析天平（瑞士）；電熱恒溫水浴槽（上海）。

1.2 試藥

延胡索對(duì)照藥材（批號(hào)：120928-201007）、枳殼對(duì)照藥材（批號(hào)：120981-200403）、魚腥草對(duì)照藥材（批號(hào)：121046-200904）均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所；延魚止痛顆粒（批號(hào)：121101、121102、121103由廣東省第二中醫(yī)院制劑室提供）；

2 定性鑒別

2.1 延胡索[2]、枳殼TLC鑒別

取本品5g，研細(xì)，加甲醇30mL，超聲處理30分鐘，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0mL使溶解，加濃氨試液調(diào)至堿性（pH9-10），加乙醚振搖提取3次，每次10mL，合并乙醚液，水浴蒸干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為供試品溶液。另取延胡索對(duì)照藥材和枳殼對(duì)照藥材各1g，同法分別制成延胡索對(duì)照藥材溶液和枳殼對(duì)照藥材溶液。按處方比例，取缺延胡索、枳殼的其他各味藥，分別按制備工藝制成延胡索、枳殼陰性樣品，再按以上處理方法制成延胡索、枳殼陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅥB）試驗(yàn)，吸取供試品溶液5μL、延胡索對(duì)照藥材溶液2μL、枳殼對(duì)照藥材溶液5μL、枳殼陰性對(duì)照溶液5μL、延胡索陰性對(duì)照溶液5μL，分別點(diǎn)于同一用1%氫氧化鈉溶液制成的硅膠G薄層板上，以甲苯-丙酮（8：2）為展開劑（展開前另槽加濃氨試液5mL預(yù)飽和5分鐘），展開，取出，晾干，置紫外光燈（365nm）下檢視，供試液色譜中，在與枳殼對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照均無(wú)干擾。置碘缸中約3分鐘后取出，揮盡板上吸附的碘后，置紫外光燈（365nm）下檢視，供試品色譜中，在與延胡索對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照均無(wú)干擾，見圖1。

圖1 延胡索、枳殼TLC圖

2.2 魚腥草TLC鑒別

取本品5g，研細(xì)，加濃氨試液2mL潤(rùn)濕，加三氯甲烷25mL，超聲處理30分鐘，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為供試品溶液。另取魚腥草對(duì)照藥材粉末1g，加水80mL，煮沸30分鐘，濾過(guò)，濾液濃縮至30-40mL，冷卻，加氨水調(diào)節(jié)pH11-12，加三氯甲烷振搖提取2次，每次20mL，合并三氯甲烷液，蒸干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為魚腥草對(duì)照藥材溶液。按處方比例，取魚腥草的其他各味藥，按制備工藝制成魚腥草陰性樣品，再按以上處理方法制成魚腥草陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅥB）試驗(yàn)，吸取供試品溶液10μL、魚腥草對(duì)照藥材溶液5μL，分別點(diǎn)于同一用1%氫氧化鈉溶液制成的硅膠G板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水（20：10：1：1）上層液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365nm）下檢視，供試品色譜中，在與魚腥草對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾，見圖2。

圖2 魚腥草TLC圖

3 鹽酸小檗堿含量測(cè)定[2]

3.1 色譜條件

色譜柱：Agilent TC-C18（4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液（50：50）（每100mL中加十二烷基硫酸鈉0.4g，再以磷酸調(diào)節(jié)pH值為4.0）；流速：1mL/min；柱溫：25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)345nm。理論板數(shù)按鹽酸小檗堿峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000。

3.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，加甲醇制成每1mL含90.5μg的溶液，即得。

3.3 供試品溶液的制備

取本品粉末（過(guò)二號(hào)篩）約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-鹽酸（100：1）的混合溶液50mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250W，頻率40kHz）30分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液2mL，置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

3.4 陰性對(duì)照溶液制備

按處方比例，取缺黃連的其他各味藥，按制備工藝制成陰性樣品，再按“3.3”項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照溶液。

3.5 測(cè)定

分別精密吸取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液、黃連陰性對(duì)照溶液各10μL，注入液相色譜儀，在上述色譜條件下測(cè)定，見圖3。結(jié)果顯示在上述色譜條件下，鹽酸小檗堿與其他峰較好的分離，陰性對(duì)照溶液在鹽酸小檗堿峰相對(duì)應(yīng)的位置上無(wú)其他色譜峰的干擾。

圖3 HPLC色譜圖

3.6 線性關(guān)系考察

精密吸取鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液（90.5μg/mL）4、8、12、16、20μL進(jìn)行色譜測(cè)定，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，并以峰面積（Y）對(duì)鹽酸小檗堿含量（X）進(jìn)行回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線：

表明鹽酸小檗堿在0.362-1.448μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.7 精密度試驗(yàn)

精密吸取鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液（90.5μg/mL）10μL注入液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得其峰面積RSD值為0.31%，表明儀器精密度良好。

3.8 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取供試品（批號(hào)：121101）5份，分別按照“3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按照上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果鹽酸小檗堿平均含量為0.030μg/g，RSD=0.66%，表明該方法重現(xiàn)性好。

3.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別精密吸取同一份供試品溶液（批號(hào)：121101），分別于0、2、4、8、12h進(jìn)樣10μL，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果鹽酸小檗堿峰面積RSD=0.31%，表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.1 0加樣回收試驗(yàn)

精密稱取9份已知含量的樣品（批號(hào)：121101），分別精密加入一定量的鹽酸小檗堿對(duì)照品，按“3.3”項(xiàng)下供試品制備方法處理，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1 鹽酸小檗堿加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

3.1 1供試品測(cè)定結(jié)果

分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀，測(cè)得三批樣品中鹽酸小檗堿的含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

4 討論

4.1 對(duì)方中延胡索進(jìn)行薄層鑒別時(shí)，按照藥典中延胡索的TLC鑒別方法，結(jié)果斑點(diǎn)清晰，但分離效果不夠好，Rf值也較小，故將展開劑中甲苯所占的比例降低。結(jié)果斑點(diǎn)清晰，分離效果好，且陰性無(wú)干擾。

4.2 對(duì)方中枳殼進(jìn)行薄層鑒別時(shí)，按照藥典中枳殼的制備方法[2]制備，結(jié)果供試品色譜中與對(duì)照藥材色譜沒(méi)有相對(duì)應(yīng)的斑點(diǎn)，且背景較深。參考了文獻(xiàn)中多種方法[3-6]，結(jié)果均不理想，后發(fā)現(xiàn)采用文中延胡索的鑒別方法鑒別枳殼可行，結(jié)果斑點(diǎn)清晰，分離效果較好，且陰性無(wú)干擾。

4.3對(duì)方中魚腥草進(jìn)行薄層鑒別時(shí)，因該處方中魚腥草是采用水煮的提取方法，制劑中無(wú)魚腥草揮發(fā)油成分，故無(wú)法用藥典方法對(duì)魚腥草進(jìn)行TLC鑒別。因此，在參考文獻(xiàn)中多種鑒別方法[7-10]之后，本文采用上述方法進(jìn)行鑒別，結(jié)果斑點(diǎn)清晰，分離效果好，且陰性無(wú)干擾。

4.4 鹽酸小檗堿的含量測(cè)定方法，是按照《中國(guó)藥典》2010年版黃連項(xiàng)下鹽酸小檗堿的含量測(cè)定方法，通過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證，該法準(zhǔn)確、可靠，可作為延魚止痛顆粒中鹽酸小檗堿的含量測(cè)定方法。

4.5 本文所建立的方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確可靠、重現(xiàn)性好，可作為延魚止痛顆粒的質(zhì)量控制方法。

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