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    梔子苷對慢性腦缺血大鼠神經(jīng)元凋亡及Bcl-2和Bax表達的影響*

    2013-11-07 08:22:28高龍?zhí)?/span>王智勇吳俊霞王飛汪建民
    江西中醫(yī)藥大學學報 2013年4期
    關(guān)鍵詞:藥組梔子腦區(qū)

    ★ 高龍?zhí)?王智勇 吳俊霞 王飛 汪建民*

    (1.江西中醫(yī)學院 南昌 33004;2.上海市百神健康投資管理有限公司 上海 200030)

    慢性腦缺血性疾病深深困擾著我們的健康,尤其在進入老齡化社會的中國,65歲以上的老年人已經(jīng)達到1.35億(占全國人口的8%),而其中患有腦血管疾病的老年人群占到13.6%,腦血管疾病而今已是全球老年人的第一大殺手[1]。中藥在腦缺血性疾病的應用越來越受到重視,從葛根、三七到熱點的銀杏、梔子等,眾多實驗研究和相關(guān)新型中成藥的研制開發(fā)都驗證了這些中藥的有效性。中藥在治療腦缺血性疾病上有“多途徑、多環(huán)節(jié)、多靶點、整體干預”的特點,在防治慢性缺血性疾病方面有獨特的優(yōu)勢和臨床效果。Adachi和余芬等實驗研究已證明DNA損傷和修復失衡所造成的神經(jīng)細胞凋亡是腦缺血性疾病的重要發(fā)病機制[2,3]。本項目通將梔子苷口服給藥于慢性腦缺血模型大鼠,采用TUNEL染色和免疫組化染色方法檢測梔子苷對慢性腦缺血大鼠神經(jīng)元凋亡及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax陽性表達的影響,并從抗凋亡的角度探討梔子苷的神經(jīng)保護作用和機制,為梔子苷治療慢性腦缺血疾病提供實驗依據(jù)。

    1 材料

    1.1 動物

    實驗選用清潔級雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠40只,體重280±20g,由江西中醫(yī)學院實驗動物中心提供,動物質(zhì)量合格證號:JZDW-NO:2011-0106,許可證號:SCXK(贛)2005-0001。

    1.2 藥物

    梔子苷口服溶液:取梔子苷提取物,加入甘露醇、尼泊金甲酯加水溶解,即得。梔子苷(含量96.2%)由四川雙子葉生物有限公司提供,生產(chǎn)批號:syz090911。

    1.3 試劑

    TUNEL原位基因凋亡檢測試劑盒,rocel公司(批號:11684817910);兔抗Bcl-2多克隆抗體,Santa cruz公司(批號:B2208);兔抗Bax多克隆抗體,Santa cruz公司(批號:J2407);牛血清白蛋白,國藥集團化學試劑有限公司(批號:F20070228);小鼠SP檢測試劑盒,北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司(SP-9001)。

    1.4 儀器與設備

    石蠟切片機(RM2135型),德國Leica公司;電子天平(DT10K),江蘇常熟長青儀器儀表廠;恒溫箱(PH140A型),上海一恒科技有限公司;顯微照相儀(leika,Bp-3000),德國Leica公司。

    2 方法

    2.1 分組

    將40只SD大鼠隨機分成4組:假手術(shù)組(10只),慢性腦缺血模型組(10只),口服給藥組(10只),陽性藥物安理申對照組(10只)。其中除了假手術(shù)組外的其它各組大鼠均采用雙側(cè)頸總動脈(CCA)永久性結(jié)扎法(2-VO法)[4,5]進行慢性腦缺血造模,假手術(shù)組只剝離雙側(cè)頸總動脈,不結(jié)扎。4組大鼠均分籠飼養(yǎng),溫度(25±2℃),濕度50%-60%,自然晝夜節(jié)律,自由飲水,保持室內(nèi)安靜。

    2.2 給藥

    梔子苷溶液口服給藥組,給藥劑量50 mg/(kg?d)、安理申對照組,給藥劑量1.75 mg/(kg?d),假手術(shù)組和模型組給予生理鹽水灌胃,按體表面積計算[6]各給藥組連續(xù)給藥30d,每d給藥1次。

    2.3 TUNEL原位DNA凋亡檢測和免疫組化檢測

    給藥就術(shù)后,將所有大鼠經(jīng)左心室用4%多聚甲醛灌注固定,切取包含大腦海馬及扣帶回壓部皮質(zhì)等部位的腦組織塊,行冠狀位連續(xù)切片,片厚5 μm。每隔5片取一張,每個動物相鄰切片分為3套,每套各2張,選取其中一套運用TUNEL原位DNA凋亡檢測,剩余兩套分別運用兔抗Bax多克隆抗體(工作濃度1:100)和兔抗Bcl-2多克隆抗體(工作濃度1:50)進行免疫組織化學染色,并觀察其陽性神經(jīng)元表達部位。光鏡下(10×20倍)對每一腦片的海馬CA1區(qū)、CA2區(qū)、CA3區(qū)和扣帶回皮質(zhì)的外顆粒及錐體區(qū)4個腦區(qū)進行觀察拍照,每個腦區(qū)隨機選取相鄰3個視野,通過鏡下計數(shù)TUNEL陽性神經(jīng)元Bcl-2和Bax免疫陽性神經(jīng)元,取各組的各區(qū)陽性神經(jīng)元數(shù)的平均值作為計數(shù)結(jié)果。

    2.4 統(tǒng)計學分析

    3 結(jié)果

    3.1 TUNEL原位DNA凋亡檢測結(jié)果

    由表1可知:模型組與假手術(shù)組相比較,各腦區(qū)TUNEL陽性神經(jīng)元明顯增多,表明相對的神經(jīng)元凋亡數(shù)量明顯,其差異均有極顯著性意義(P<O.01),此結(jié)果說明永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈所致慢性低灌注腦缺血造模成功??诜o藥組與模型組相比較,海馬CA1區(qū)、CA2區(qū)、CA3區(qū)、扣帶回皮質(zhì)的粒上層4個腦區(qū)神經(jīng)元細胞TUNEL陽性神經(jīng)元數(shù)明顯減少,差異均有極顯著性意義(P<O.01),此結(jié)果說明口服梔子苷對慢性腦缺血所致的神經(jīng)元損傷具有較好的抗凋亡作用??诜o藥組與安理申對照組相比較,除皮質(zhì)區(qū)的TUEL陽性神經(jīng)元數(shù)略低于安理申組外,差異無顯著性意義(P>0.05),其余各腦區(qū)TUNEL陽性神經(jīng)元數(shù)均略高于安理申對照組,其中CA1區(qū)和CA3區(qū)差異均有顯著性意義(P>0.05)外,CA2區(qū)的神經(jīng)元細胞數(shù)目只有顯著性差異(P<0.05),此結(jié)果說明口服梔子苷與安理申的慢性腦缺血性神經(jīng)抗凋亡作用具有相似效果。見表1。

    表1 各組大鼠海馬各區(qū)和皮質(zhì)區(qū)TUNEL陽性神經(jīng)元比較(±s,n=10)

    表1 各組大鼠海馬各區(qū)和皮質(zhì)區(qū)TUNEL陽性神經(jīng)元比較(±s,n=10)

    注:與假手術(shù)組比較,*表示P<0.05,**表示P<0.01;與模型組比較,▲表示P<0.05,▲▲表示P<0.01;與安理申對照組比較,◆表示P<0.05,◆◆表示P<0.01

    后扣帶回皮質(zhì)區(qū)33.23±1.33▲▲◆◆77.00±2.36**◆◆42.23±4.50*▲▲43.30±2.65**▲▲組別假手術(shù)組模型組口服給藥組安理申對照組海馬CA1區(qū)30.67±2.89▲▲◆◆67.90±4.00**◆◆40.67±2.71**▲▲39.58±5.37**▲▲海馬CA2區(qū)25.33±0.65▲▲36.43±2.80**◆◆27.23±1.74▲▲◆23.57±1.50▲▲海馬CA3區(qū)17.03±1.53▲▲◆◆37.00±0.89**◆◆24.33±2.06**▲▲21.67±3.35**▲▲

    3.2 免疫組化檢測結(jié)果

    3.2.1 各組大鼠Bcl-2免疫組化結(jié)果 見表2。

    由表2可知:模型組與假手術(shù)相比較,大鼠各腦區(qū)Bcl-2陽性神經(jīng)元表達明顯較少,差異均有極顯著性意義(P<0.01),口服給藥組與模型組相比較,各腦區(qū)Bcl-2陽性神經(jīng)元明顯增多,差異均有極顯著性差異(P<0.01),口服給藥組與安理申對照組相比較,各腦區(qū)Bcl-2陽性神經(jīng)元數(shù)目均比安理申組略多,差異均無顯著性意義(P>0.05),結(jié)果表明,梔子苷能夠有效促進慢性低灌注缺血性大鼠各腦區(qū)的Bcl-2免疫反應陽性神經(jīng)元細胞表達,從而證明梔子苷可以通過促進各腦區(qū)Bcl-2表達對缺血性大鼠腦損傷發(fā)揮很好的神經(jīng)保護作用。

    表2 各組大鼠海馬各區(qū)和皮質(zhì)區(qū)Bcl-2陽性神經(jīng)元的比較(±s,n=10)

    表2 各組大鼠海馬各區(qū)和皮質(zhì)區(qū)Bcl-2陽性神經(jīng)元的比較(±s,n=10)

    注:與假手術(shù)組比較,*表示P<0.05,**表示P<0.01;與模型組比較,▲表示P<0.05,▲▲表示P<0.01;;與口服給藥組比較,◆表示P<0.05,◆◆表示P<0.01

    后扣帶回皮質(zhì)區(qū)66.90±2.42▲▲36.38±3.02**◆◆70.05±0.56▲▲66.37±1.27▲▲組別假手術(shù)組模型組口服給藥組安理申對照組海馬CA1區(qū)65.75±2.80▲▲36.12±1.97**◆◆66.60±1.17▲▲63.63±1.29▲▲◆海馬CA2區(qū)62.57±2.24▲▲◆26.93±1.16**◆◆60.55±1.76*▲▲59.72±1.14**▲▲海馬CA3區(qū)64.07±1.36▲▲29.73±1.50**◆◆64.47±4.20▲▲63.62±4.51▲▲

    3.2.2 各組大鼠Bax免疫組化檢測結(jié)果 見表3。

    由表3可知:模型組與假手術(shù)相比較,大鼠各腦區(qū)Bax陽性神經(jīng)元表達明顯增多,差異均有極顯著性意義(P<0.01),口服給藥組與模型組相比較,各腦區(qū)Bax陽性神經(jīng)元明顯減少,差異均有極顯著性差異(P<0.01),口服給藥組與安理申對照組相比較,在扣帶回皮質(zhì)區(qū)略高于安理申組,且差異有顯著性(P<0.05),其他各腦區(qū)Bax陽性神經(jīng)元數(shù)目均比安理申組略少,差異均無顯著性意義(P>0.05),結(jié)果表明,梔子苷能夠有效抑制慢性低灌注缺血性大鼠各腦區(qū)的Bax免疫反應陽性神經(jīng)元細胞表達,從而證明梔子苷可以通過抑制各腦區(qū)Bax表達對缺血性大鼠腦損傷發(fā)揮很好的神經(jīng)保護作用。

    表3 各組大鼠海馬各區(qū)和皮質(zhì)區(qū)Bax陽性神經(jīng)元的比較(±s,n=10)

    表3 各組大鼠海馬各區(qū)和皮質(zhì)區(qū)Bax陽性神經(jīng)元的比較(±s,n=10)

    注:與假手術(shù)組比較,*表示P<0.05,**表示P<0.01;與模型組比較,▲表示P<0.05,▲▲表示P<0.01;與口服給藥組比較,◆表示P<0.05,◆◆表示P<0.01

    后扣帶回皮質(zhì)區(qū)43.67±1.20▲▲◆◆71.12±5.04**◆◆58.30±1.83**▲▲53.73±10.27*▲▲組別假手術(shù)組模型組口服給藥組安理申對照組海馬CA1區(qū)28.15±0.96▲▲◆◆48.30±5.45**◆◆34.63±1.86**▲▲35.65±6.33**▲▲海馬CA2區(qū)28.02±2.23▲▲◆◆41.22±1.28**◆◆35.17±1.88**▲▲36.18±1.92**▲▲海馬CA3區(qū)22.47±3.20▲▲◆◆41.73±5.67**◆◆28.27±1.95*▲▲31.13±4.20**▲▲

    4 討論

    目前可知海馬各段對缺血易損傷性又有以下順序CA1門區(qū)>CA2>CA3>齒狀回[7]。海馬CA1區(qū)是海馬結(jié)構(gòu)中與人類學習記憶關(guān)系最為密切的功能區(qū),并對腦缺血更具有選擇易損傷性[8]。LI等[9]用電鏡、DNA電泳和原位末端標記染色3種方法,證實在局灶性腦缺血時,神經(jīng)元的凋亡和壞死同時存在,海馬細胞出現(xiàn)的凋亡率最大。局灶性腦缺血的實驗在報刊上屢見不鮮,但是對慢性的全腦缺血的模型實驗研究較少,尤其是從神經(jīng)元的凋亡角度上的文章更是少之又少。本項目即是對慢性腦缺血大鼠的神經(jīng)元凋亡現(xiàn)象進行梔子苷藥物的干預,通過對海馬及扣帶回皮質(zhì)區(qū)的TUNEL檢測結(jié)果驗證了,梔子苷溶液口服給藥的方法對慢性缺血性腦損傷大鼠的神經(jīng)元DNA損傷有保護和促進修復的作用,從而減輕神經(jīng)細胞的凋亡,進而減少腦缺血性損傷的影響,恢復神經(jīng)細胞的形態(tài)和功能。

    Bcl-2為Bcl-2家族中抑制細胞凋亡的一種膜結(jié)合蛋白,Bcl-2的亞細胞定位和主要的凋亡相關(guān)作用已經(jīng)明確,能通過和Bax結(jié)合形成異二聚體,形成穩(wěn)定的非活躍的凋亡影響結(jié)構(gòu);Bax則是Bcl-2家族促進細胞凋亡的膜結(jié)合蛋白,與Bcl-2結(jié)構(gòu)上有21%的相似性,Bax是通過和Bcl-2結(jié)合形成異二聚體,從而抑制Bcl-2的作用,來加速細胞的凋亡過程。近年研究發(fā)現(xiàn),缺血性腦損傷引起的神經(jīng)元凋亡主要是由線粒體途徑介導的,在凋亡誘導因素作用下,線粒體內(nèi)的Bcl-2和Bax結(jié)合的異二聚體解離并將Bax蛋白釋放到胞漿中,從而引發(fā)下一級的凋亡進程。梔子苷可以明顯改善大鼠缺血性腦神經(jīng)元的凋亡狀況,尤其是在全腦缺血再灌注損傷所造成的海馬區(qū)缺血半暗帶的神經(jīng)元的凋亡[10],王磊等實驗證明[11]梔子苷能通過既上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的水平,又下調(diào)凋亡蛋白Bax、轉(zhuǎn)錄因子p53的水平來治療阿爾茨海默病。而本項目也實驗驗證了Bcl-2蛋白表達有抑制凋亡作用,Bax蛋白有促進神經(jīng)元凋亡的作用,以及梔子苷具有減輕慢性缺血性腦損傷大鼠大腦皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元的凋亡效果,機制可能與其促進大鼠大腦皮質(zhì)和海馬各區(qū)Bcl-2蛋白的表達同時抑制Bax蛋白的表達有關(guān)。本項目結(jié)果提示梔子苷在治療慢性腦缺血造成的疾病中有良好而肯定的應用前景,值得深入開展梔子類的中藥新藥的研發(fā)和抗凋亡研究,為探索給藥新途徑,提供了有意義的摸索。我國梔子藥材資源非常豐富,為梔子類的新藥開發(fā)提供了資源保障。而梔子作為清開靈制劑的主要組成及王永炎院士解毒通絡方劑[12]的主要藥物,其臨床療效已得到肯定,期待梔子類中藥的其它各種吸收良好,效能更強的劑型的出現(xiàn),豐富治療慢性腦缺血損傷的藥品種類。

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    [3]余芬,章軍建.慢性腦缺血大鼠海馬中APE的表達與神經(jīng)元凋亡的實驗研究[J].中華神經(jīng)醫(yī)學雜志,2006,4:363-365.

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    [12]王永炎,張伯禮,任繼學.中醫(yī)腦病學[M].第1版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2007.

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