紫薇離體莖段快速繁殖體系研究

段麗君，李國瑞，童 俊，葉要妹*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林學(xué)院，湖北 武漢 430070;2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，湖北 武漢 430070;3.武漢市林業(yè)果樹科學(xué)研究所，湖北 武漢 430075)

紫薇(Lagerstroemia indica)隸屬于千屈菜科(Lythraceae)紫薇屬，別名“百日紅”、“癢癢樹”、“滿堂紅”，主要分布在亞洲東部至南部和澳大利亞的北部［1］。作為園林觀賞植物，紫薇有其獨特的觀賞價值，樹姿優(yōu)美，在夏季少花季節(jié)開花，不僅花期長，而且花色豐富，是重要的園林綠化樹種。紫薇傳統(tǒng)繁殖方式主要是播種和扦插，但繁殖速度慢，性狀易變異。利用組織培養(yǎng)的方法培育苗木，具有繁殖速度快、繁殖系數(shù)高、保持繁殖材料及新植株的優(yōu)良種性，從而提高種苗質(zhì)量，具有重要的意義及應(yīng)用前景［2］。但長期以來，有關(guān)紫薇離體培養(yǎng)研究報道比較少，1984年黃欽才［3］最早報道培養(yǎng)利用紫薇腋芽快速繁殖，楊彥伶［4］、瞿宏杰［2］需經(jīng)過6 ～7 次繼代培養(yǎng)，得到每叢20 ～50 個叢生芽，李曉青［6］和曹受金［2］探討紫薇莖段誘導(dǎo)、增殖、生根的培養(yǎng)基配方?，F(xiàn)國內(nèi)已獲得了紫薇腋芽的增生［3，6－8］，枝條的快繁［9］，葉片的再生［10］和種子無菌苗［5］，但多局限于培養(yǎng)基配方的優(yōu)化，沒有建立從外植體消毒到生根煉苗比較系統(tǒng)、穩(wěn)定的再生體系，難以滿足科研、生產(chǎn)的需求?，F(xiàn)以紫薇莖段為材料，旨在通過消毒時間、取材季節(jié)、基本培養(yǎng)基、激素配比等一系列的研究，確定適宜于紫薇莖段植株再生的最佳途徑，建立、完善其離體再生體系，從而滿足紫薇及其相關(guān)樹種的樹木改良研究及其優(yōu)良苗木快速繁殖的需要。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)花卉基地內(nèi)選擇株高2 m左右、生長健壯的2～3年生優(yōu)良紫薇單株。

1.2 試驗方法

1.2.1 莖段消毒時間的篩選 5月份，選取紫薇當(dāng)年生的中上部枝條，剪取帶腋芽莖段和頂芽莖段部分，分別用洗衣粉水清洗后流水沖洗30 min以上。然后，在超凈工作臺上，分別用75%的酒精處理30 s，無菌水沖洗2～3次，接著用0.1%的升汞處理，具體是帶腋芽莖段分別處理6，8，10 min，頂芽莖段分別處理4，6，8 min，無菌水沖洗3～5次，最后用無菌濾紙吸干外植體上的水分，分別接種于MS+6－BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L的培養(yǎng)基上。然后將其放于培養(yǎng)室進(jìn)行培養(yǎng)，每個處理10個外植體，重復(fù)3次，15 d后統(tǒng)計污染率，萌發(fā)率、褐化率。

污染率:污染的外植體數(shù)/外植體總數(shù)×100%;褐化率:褐化的外植體數(shù)/外植體總數(shù)×100%;萌發(fā)率:萌發(fā)外植體數(shù)/外植體總數(shù)×100%。

1.2.2 取材時間對帶芽莖段萌發(fā)的試驗 分別于春季4月、夏季6月、秋季9月3個不同時間段取材對莖段進(jìn)行試驗，將帶腋芽莖段接種到培養(yǎng)基MS+6－BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L上。每個處理10個外植體，重復(fù)3次，觀察外植體污染率、腋芽萌發(fā)率及其生長情況。

1.2.3 帶芽莖段的初代培養(yǎng) 試驗采用雙因素完全隨機設(shè)計，6－BA 3個水平為0.5，1.0，2.0 mg/L，NAA 2個水平為0.05，0.1 mg/L，共6個處理組合。消毒后將帶頂芽莖段和帶腋芽莖段分別接種到6個處理組合中，每個處理10個外植體，重復(fù)3次。第15天統(tǒng)計污染率和萌發(fā)率。

1.2.4 帶芽莖段的增殖 第15天將初代培養(yǎng)萌發(fā)的腋芽和頂芽切取轉(zhuǎn)接到4種增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng):(1)MS+6 － BA 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L;(2)MS+6 － BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L;(3)MS+6－BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L;(4)MS+6 －BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L。1 個月后再次繼代與原培養(yǎng)基相同的培養(yǎng)基上，每個處理10個外植體，重復(fù)3次，培養(yǎng)30 d后觀察腋芽和不定芽發(fā)生狀況，統(tǒng)計增殖倍數(shù)。增殖倍數(shù):腋芽增殖的芽總數(shù)/外植體總數(shù)。

1.2.5 壯苗培養(yǎng) 以紫薇增殖苗為外植體進(jìn)行試驗，培養(yǎng)基設(shè)3個處理，(1)MS;(2)MS+GA30.5 mg/L;(3)MS+GA31.0 mg/L，每個處理10個外植體，重復(fù)3次，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計株高及生長情況。

1.2.6 生根培養(yǎng) 在繼代叢生芽中選取生長良好，長度在2 cm以上的嫩枝，切去基部愈傷，將其接入以 1/2MS 為基本培養(yǎng)基，同時分別附加 IBA 0.2，0.5，1.0 mg/L 或 NAA0.2，0.5，1.0 mg/L 3 個濃度的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，每個處理10個外植體，重復(fù)3次，40 d后統(tǒng)計生根率、生根數(shù)、平均根長。

生根數(shù):長度大于0.5 cm的根個數(shù);生根率:生根的外植體數(shù)/外植體總數(shù)×100%。

1.2.7 數(shù)據(jù)觀測與統(tǒng)計分析 如無特別交代，本實驗中的初代、繼代及分化的基本培養(yǎng)基為MS，瓊脂含量為7.0 g/L，蔗糖濃度為30 g/L;生根培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基為1/2MS，瓊脂為7.0 g/L;培養(yǎng)基pH值:5.8～6.0。滅菌條件:121℃、1.1 kg/cm2滅菌 20 min;培養(yǎng)室條件:溫度為(25±2)℃、光強為1 400 lx、光周期為14 h光/10 h暗的條件。

試驗數(shù)據(jù)采用SAS統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，百分率的數(shù)據(jù)分別先經(jīng)反正弦轉(zhuǎn)換、對數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒時間對莖段消毒的影響

表1 不同消毒時間對紫薇外植體消毒的影響Tab.1 Effects of different sterilization treatment on survival of Lagerstroemia indica

外植體的消毒處理對進(jìn)行組織培養(yǎng)研究有著至關(guān)重要的作用，消毒時間恰當(dāng)，可以減少外植體的污染和材料的損失。從表1可以得出HgCl2處理時間對紫薇的腋芽莖段污染率和褐化率有顯著影響，對萌發(fā)率有極顯著的影響，進(jìn)一步的多重比較結(jié)果顯示:帶腋芽的莖段用HgCl2溶液消毒6 min萌芽率最高，褐化率最低，污染率也相對較小，效果最佳;帶頂芽的莖段在用HgCl2溶液消毒4 min萌芽率高，污染率和褐化率均較低，效果好。

2.2 取材季節(jié)對腋芽莖段萌發(fā)的影響

表2 取材季節(jié)對腋芽萌發(fā)的影響Tab.2 Effects of sampling time on germinating

取材季節(jié)對腋芽莖段的污染率和萌發(fā)率均有極顯著的影響，進(jìn)一步的多重比較結(jié)果顯示，污染率的高低順序是:秋季、夏季、春季，萌發(fā)率的高低順序是:夏季、秋季、春季，且試驗觀察到夏季和秋季萌條的生長勢好于春季萌發(fā)的。綜合污染率、萌發(fā)率及萌條的生長勢，夏季的腋芽莖段培養(yǎng)效果最好。

2.3 帶腋芽莖段初代培養(yǎng)

方差分析結(jié)果表明，6－BA和NAA濃度對紫薇莖段腋芽的萌發(fā)率均達(dá)顯著的影響，6－BA和NAA不同濃度之間的交互作用對紫薇莖段腋芽的萌發(fā)率作用不明顯。從表3可以得出6－BA濃度為1.0 mg/L時萌芽率最高，萌發(fā)率和芽長都顯著好于0.5 mg/L時的，但6－BA濃度為1.0 mg/L和2.0 mg/L兩者萌發(fā)率和芽長沒有顯著性差異;NAA在濃度為0.1 mg/L時的萌芽率要顯著好于0.05 mg/L的。理論上，誘導(dǎo)紫薇莖段萌發(fā)效果比較好的是6－BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L和6－BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L 這兩個組合。

表3 6－BA和NAA對帶腋芽莖段萌發(fā)的影響Tab.3 Effects of 6 －BA and NAA on ratio of shooting

由表4的6－BA和NAA不同濃度組合對腋芽誘導(dǎo)率及芽生長勢的實際效果來看，6－BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L和6－BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L這兩個組合的萌發(fā)率較高。隨著培養(yǎng)時間的延長，腋芽的生長情況有所不同。在濃度為1.0 mg/L時腋芽生長健壯(圖1－A);濃度為2.0 mg/L時腋芽生長速度快，芽長但節(jié)間較長，苗細(xì)弱。因此，根據(jù)萌發(fā)率、生長勢及增殖倍數(shù)的結(jié)果，帶腋芽莖段的初代培養(yǎng)基選用 MS+6 －BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L。

表4 不同組合處理對紫薇帶腋芽莖段誘導(dǎo)的影響Tab.4 Effects of different treatment on axillary bud induction

2.4 帶芽莖段的增殖

切取初代培養(yǎng)萌發(fā)的腋芽繼代于不同處理的培養(yǎng)基上，開始繼代時，只有腋芽萌發(fā)增殖;經(jīng)過4次繼代后，莖基部出現(xiàn)了大量叢生芽(圖1－B)。4個處理中都有叢生芽發(fā)生，表5方差分析表明，各處理間對平均芽個數(shù)及叢生芽長有顯著性差異，多重比較結(jié)果顯示:處理3誘導(dǎo)叢生芽個數(shù)為61個，顯著高于處理1和處理4，處理2和處理3誘導(dǎo)的芽較處理4的生長健壯。綜合比較平均芽個數(shù)及叢生芽長可知，在處理3的培養(yǎng)基MS+6－BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L上對莖段腋芽的增殖效果最為理想。

2.5 GA3對叢生苗繼代生長的影響

表5 BA、NAA不同濃度組合對莖段腋芽的增殖影響Tab.5 Effects of 6 －BA and NAA on buds multiplication

將紫薇的再生芽在附加了不同濃度GA3的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)1個月后，表6方差分析結(jié)果表明不同處理對試管苗的生長量有極顯著影響。處理1的苗生長量極顯著地高于處理2和處理3。在不添加GA3的MS培養(yǎng)基上苗生長量最高，葉片綠色(圖1－C)。GA3對取自叢生芽的芽苗伸長生長的促進(jìn)作用不明顯，苗甚至不生長，隨著培養(yǎng)時間的延長，葉片發(fā)黃直至脫落(圖1－D)。GA3對紫薇無菌苗的伸長生長沒有促進(jìn)作用，因此，在紫薇叢生苗的繼代培養(yǎng)中可以不添加激素。

表6 GA3對叢生苗生長的影響Tab.6 Effects of GA3on axillary buds growth

表7 生長素對試管苗生根的影響Tab.7 Effects of auxins on rooting of plantlets in vitro

圖1 紫薇帶芽莖段的快繁Fig.1 Rapid propagation of budded stem segmant of Lagerstroemia indica

2.6 生長素對試管苗生根的影響

表7方差分析表明，IBA對紫薇試管苗的生根率有極顯著的影響，NAA對生根率無顯著影響，但添加了生長素的1/2MS培養(yǎng)基的試管苗生根率均極顯著地高于未添加生長素的1/2MS培養(yǎng)基。進(jìn)一步的多重比較結(jié)果表明，處理3的生根率卻極顯著地高于處理5和處理7;同時，結(jié)合生根率、生根數(shù)和平均根長的結(jié)果，試管苗生根應(yīng)在1/2MS培養(yǎng)基上添加濃度為0.5 mg/L的IBA。生根的健壯苗即可煉苗移栽(圖1－E、圖1－F)。

3 討論

紫薇莖段直接從大田采集，不同季節(jié)生長狀態(tài)不同，取材季節(jié)對芽的萌動有顯著影響。本研究表明，在高溫干燥的夏季截取半木質(zhì)化莖段作組織培養(yǎng)，污染率較低，萌芽率高且生長勢健康，效果明顯好于春季和秋季。這與紫薇在夏季生長旺盛、枝條半木質(zhì)化、表面污染物少和植株內(nèi)源激素含量高都有明顯關(guān)聯(lián)。在本實驗中，紫薇春季剛萌發(fā)的莖段幼嫩，容易產(chǎn)生藥害，消毒處理后，極易褐化，腋芽萌芽率低。而在秋季取材的莖段已完全木質(zhì)化，內(nèi)生菌積累較多，污染率高，應(yīng)相應(yīng)延長消毒時間為宜。這在巴戟天［11］，柑橘［12］，香椿［13］的研究上有類似報道。

培養(yǎng)基中的生長素和細(xì)胞分裂素對紫薇叢生芽誘導(dǎo)、增殖和生根有顯著作用。本研究通過系列激素配比實驗，篩選出紫薇莖段誘導(dǎo)、增殖培養(yǎng)基最佳配方為MS+6－BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，生根最佳配方為1/2MS+IBA0.5 mg/L。研究結(jié)果顯示紫薇莖段在最佳激素配比的培養(yǎng)基上，萌芽率可高達(dá)97.6%，經(jīng)過4次繼代出現(xiàn)了大量叢生芽，平均不定芽苗(長度大于1 cm)達(dá)61個且生長強壯，繼代次數(shù)少，見效快，能夠大量運用于快繁生產(chǎn)。紫薇莖段快繁體系的建立，為紫薇的繁殖添加了新途徑，對保存紫薇優(yōu)良性狀，加快紫薇工廠化生產(chǎn)具有重要意義。

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