艾塞那肽對(duì)1型糖尿病大鼠腎臟NADPH氧化酶亞單位表達(dá)的影響

劉晉津，郭志新，齊偉，吳杰萍，杜時(shí)晶，俞媛賢

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病常見的微血管并發(fā)癥，也是1型糖尿病患者死亡的主要原因之一。研究證實(shí)，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotidephosphate，NADPH)氧化酶及其產(chǎn)物活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)所致的氧化應(yīng)激與DN的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1]。胰高血糖素樣肽1(GLP-1)是一種由腸道L細(xì)胞分泌的腸促胰島素，其主要生理功能是改善血糖控制[2]。但越來越多的證據(jù)表明，GLP-1還可通過與腎組織表達(dá)的GLP-1受體結(jié)合發(fā)揮腎臟保護(hù)作用[3-5]。本研究觀察GLP-1受體激動(dòng)劑艾塞那肽對(duì)1型糖尿病大鼠腎臟組織NADPH氧化酶亞單位和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)表達(dá)的影響，探討其對(duì)1型糖尿病大鼠腎臟的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 糖尿病大鼠模型的建立及分組 30只6周齡雄性SD大鼠(購自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，體重200～220g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為正常對(duì)照組(A組，n=7)和糖尿病造模組(n=23)。糖尿病造模組給予鏈脲佐菌素(STZ，美國(guó)Sigma公司，枸櫞酸緩沖液配制)65mg/kg腹腔注射，對(duì)照組給予等量生理鹽水腹腔注射。72h后尾靜脈采血測(cè)血糖，隨機(jī)血糖≥16.7mmol/L為糖尿病造模成功，共有19只大鼠造模成功。將造模成功的19只1型糖尿病大鼠隨機(jī)分為糖尿病對(duì)照組(B組，n=10)和艾塞那肽治療組(C組，n=9)。3組大鼠繼續(xù)常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。C組給予艾塞那肽5μg/kg，2次/d皮下注射，A組和B組給予等量生理鹽水皮下注射，共干預(yù)治療8周。

1.2 標(biāo)本的采集 艾塞那肽干預(yù)治療8周后，于實(shí)驗(yàn)結(jié)束前1d用代謝籠留取24h尿標(biāo)本，保存于－20℃冰箱中，用于測(cè)定尿白蛋白排泄率。動(dòng)物禁食10～12h后稱重，用10%水合氯醛(3ml/kg)腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈采血，留取血標(biāo)本用于檢測(cè)血糖、血脂、血肌酐、尿素氮、血胰島素水平。留取血標(biāo)本后處死動(dòng)物并迅速取出腎臟，用生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干水分稱腎臟重量，計(jì)算腎臟指數(shù)(腎臟重量/大鼠體重)。分離腎皮質(zhì)，一部分用中性甲醛液固定，脫水，石蠟包埋，常規(guī)切片，用于制作病理切片及免疫組織化學(xué)染色；其余部分迅速投入液氮中，凍透后儲(chǔ)存于－70℃冰箱，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法測(cè)定腎臟NOX4及p22phox mRNA表達(dá)。

1.3 指標(biāo)檢測(cè) 血糖采用葡萄糖氧化酶法測(cè)定。血甘油三酯、膽固醇、游離脂肪酸、血肌酐、尿素氮均采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。血漿胰島素及24h尿白蛋白用放射免疫法測(cè)定。

1.4 腎臟組織NOX4和p22phox mRNA表達(dá)檢測(cè)采用Trizol試劑提取腎臟組織總RNA。用RT-PCR試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列如下：p22phox，上游5'-CTCTATTGTTGCAGGAGTGC-3'，下游5'-TCACACGACCTCATCTGTCAC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度457bp；Nox4，上游5'-TAGCTGCCCACヰ GG TGAACG-3'，下游5'-TGTAACCATGAGGAACAATA CCACC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度245bp；內(nèi)參β-actin，上游5'-GTCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3'，下游5'-AGAGGTCTTTACGGATGTCAACGT-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物片段147bp。PCR擴(kuò)增條件：預(yù)變性94℃10min；變性94℃ 15s、退火60℃ 60s、延伸72℃45s，共循環(huán)45次。目的基因表達(dá)陽性的標(biāo)本熒光定量擴(kuò)增曲線呈S形，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR電腦系統(tǒng)讀取Ct值，以2–ΔΔCt表示樣品中目的基因mRNA相對(duì)于對(duì)照組的表達(dá)量。

1.5 腎臟組織CTGF蛋白的檢測(cè) 采用免疫組化SABC法，染色流程按試劑說明書進(jìn)行。一抗稀釋比例1:400(兔抗CTGF多克隆抗體，兔抗Cu-Zn-SOD多克隆抗體，武漢博士德生物工程有限公司)，二抗(武漢博士德生物工程有限公司)稀釋比例1:100，采用DAB顯色方法。光鏡下每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行觀察，以出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。用圖形分析軟件測(cè)定CTGF陽性表達(dá)的平均灰度值。胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)顏色越深，其平均灰度值越小，陽性物質(zhì)含量越大。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)均以表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠生化指標(biāo)比較 B組大鼠空腹血糖、總膽固醇、甘油三酯、游離脂肪酸水平均顯著高于A組，但血漿胰島素水平顯著低于A組(P＜0.05)。經(jīng)艾塞那肽干預(yù)治療8周后，C組大鼠總膽固醇、甘油三酯和游離脂肪酸水平與B組比較均明顯降低(P＜0.05)，而血糖和胰島素水平與B組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，表1)。

2.2 各組大鼠腎功能、尿白蛋白和腎臟質(zhì)量指數(shù)比較 B組大鼠血尿素氮、肌酐、尿白蛋白和腎臟指數(shù)顯著高于A組(P＜0.05)。經(jīng)艾塞那肽治療的C組大鼠，其尿素氮、肌酐、尿白蛋白和腎臟指數(shù)顯著低于B組(P＜0.05，表2)。

2.3 各組大鼠腎臟NADPH氧化酶亞單位NOX4和p22phox mRNA表達(dá)比較 B組糖尿病大鼠腎臟NOX4和p22phox mRNA相對(duì)表達(dá)量(分別為1.57±0.19、3.27±0.72)顯著高于A組(分別為0.71±0.43、0.84±0.44，P＜0.05)。經(jīng)艾塞那肽治療后，C組大鼠腎臟NOX4和p22phox mRNA相對(duì)表達(dá)量(分別為1.05±0.41、1.26±0.57)與B組比較顯著降低(P＜0.05)。

表1 各組大鼠生化指標(biāo)比較Tab.1 Comparison of biochemical indexes among the 3 groups of rats )

表1 各組大鼠生化指標(biāo)比較Tab.1 Comparison of biochemical indexes among the 3 groups of rats )

FPG. Fasting plasma glucose; TC. Total cholesterol; TG. Triglycerides; FFA. Free fatty acid; FINS. Fasting insulin. (1)P＜0.05 compared with group A; (2)P＜0.05 compared with group B

Group FPG(mmol/L) TC(mmol/L) TG(mmol/L) FFA(mmol/L) FINS(U/ml)A(n=7) 4.31±0.72 1.46±0.38 0.83±0.13 1.45±0.20 19.36±0.58 B(n=10) 29.86±1.32(1) 2.79±0.29(1) 1.42±0.20(1) 2.60±0.41(1) 4.91±0.27(1)C(n=9) 28.6±0.89 2.27±0.72(2) 1.08±0.87(2) 1.53±0.34(2) 5.19±0.31

表2 各組大鼠腎功能、尿白蛋白和腎臟質(zhì)量指數(shù)比較s)Tab.2 Comparison of renal function, urine protein and the ratio of kidney weight/body weight among the 3 groups of rats±s)

表2 各組大鼠腎功能、尿白蛋白和腎臟質(zhì)量指數(shù)比較s)Tab.2 Comparison of renal function, urine protein and the ratio of kidney weight/body weight among the 3 groups of rats±s)

BUN. Blood urea nitrogen; Cr. Serum creatinine. (1)P＜0.05 compared with group A; (2)P＜0.05 compared with group B

Group BUN(mmol/L) Cr(μmol/L) Urine protein (mg/24h) Kindey weight/body weight (g/kg)A(n=7) 7.64±1.80 192.38±22.44 5.41±0.85 6.11±0.45 B(n=10) 14.58±4.89(1) 386.84±46.45(1) 31.02±4.01(1) 11.21±1.01(1)C(n=9) 10.71±2.92(2) 228.04±38.4(2) 22.09±3.03(2) 9.19±0.86(2)

2.4 各組大鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)觀察 正常對(duì)照組腎臟結(jié)構(gòu)清晰，腎小球基底膜厚度均勻一致，無足突細(xì)胞融合。糖尿病組腎臟結(jié)構(gòu)模糊不清，腎小球基底膜增厚，足突增粗、破壞、融合、消失，系膜基質(zhì)增多、腫脹，系膜區(qū)擴(kuò)大，系膜細(xì)胞腫脹，腎小管細(xì)胞增生肥大，管腔變窄并出現(xiàn)空泡樣變。艾塞那肽治療組基底膜厚度、腎小管管腔狹窄程度較糖尿病組明顯降低，有少量足突細(xì)胞融合，系膜區(qū)細(xì)胞僅可見輕度增生(圖1)。

2.5 各組大鼠腎臟組織CTGF蛋白表達(dá)比較CTGF在正常腎臟組織的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞均呈陽性表達(dá)。B組大鼠腎組織CTGF陽性表達(dá)的平均灰度值與A組比較明顯降低(P＜0.05)，提示B組大鼠腎組織CTGF陽性表達(dá)明顯增強(qiáng)。C組大鼠腎組織CTGF陽性表達(dá)的平均灰度值較B組明顯升高(P＜0.05)，提示C組大鼠腎組織CTGF陽性表達(dá)明顯降低(圖2、表3)。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，糖尿病大鼠腎臟NOX4、p22phox mRNA和CTGF蛋白表達(dá)均顯著增高，提示其氧化應(yīng)激水平增高。艾塞那肽干預(yù)治療8周后，糖尿病大鼠腎臟NOX4、p22phox mRNA表達(dá)顯著降低，腎臟CTGF蛋白表達(dá)降低，蛋白尿減輕，腎臟肥大指數(shù)降低，提示艾塞那肽能顯著降低糖尿病大鼠的氧化應(yīng)激水平，減輕氧化應(yīng)激對(duì)腎臟的損傷，對(duì)腎臟有保護(hù)作用。

圖1 各組大鼠腎臟HE染色結(jié)果(×250)Fig.1 HE staining of kidney in the 3 groups of rats (×250)

圖2 各組大鼠腎臟CTGF免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(×400)Fig.2 Immunohistochemistrial staining of renal CTGF in the 3 groups of rats (×400)

表3 各組大鼠腎臟組織CTGF蛋白表達(dá)的比較)Tab.3 Comparison of the protein expression of renal CTGF among the 3 groups of rats (gray value,±s)

表3 各組大鼠腎臟組織CTGF蛋白表達(dá)的比較)Tab.3 Comparison of the protein expression of renal CTGF among the 3 groups of rats (gray value,±s)

(1)P＜0.05 compared with group A; (2)P＜0.05 compared with group B

Group Glomerular CTGF Renal tubular CTGF A(n=7) 158.97±6.63 163.32±4.76 B(n=10) 104.06±11.55(1) 112.26±4.65(1)C(n=9) 130.15±5.22(2) 134.06±2.20(2)

DN是引起終末期腎衰的主要原因之一[6]。氧化應(yīng)激在DN的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[1]。氧化應(yīng)激水平是由活性氧簇(ROS)和抗氧化防御系統(tǒng)之間的平衡決定的[7]，當(dāng)ROS生成超過機(jī)體抗氧化能力時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生氧化應(yīng)激和氧化損傷[8-9]。糖尿病氧化應(yīng)激水平升高與NADPH氧化酶活化有關(guān)[1]。在糖尿病鼠腎臟中，NADPH氧化酶亞基Nox4和P22phox表達(dá)上調(diào)，NADPH氧化酶依賴的ROS產(chǎn)生增多引起腎臟DNA損傷，是DN發(fā)展的重要原因[1]。使用藥物抑制NADPH氧化酶活性，減少其表達(dá)，能降低糖尿病大鼠腎臟氧化應(yīng)激水平，抑制腎小球基質(zhì)沉積，減少尿蛋白，減緩DN的進(jìn)展[1,7,10]。CTGF是一種致纖維化生長(zhǎng)因子，在組織器官纖維化的發(fā)生中起重要作用[11]。CTGF具有促進(jìn)細(xì)胞增殖分化、血管生成、基質(zhì)合成積聚等作用，在DN腎小球硬化及腎間質(zhì)纖維化中具有非常重要的作用。本研究結(jié)果顯示，糖尿病大鼠腎臟NOX4和p22phox mRNA表達(dá)水平顯著升高，導(dǎo)致糖尿病大鼠腎臟氧化應(yīng)激水平升高，作用于糖尿病大鼠腎臟而引起腎組織損傷，進(jìn)一步導(dǎo)致腎臟CTGF蛋白表達(dá)增加，腎臟肥大指數(shù)和尿白蛋白增加，腎臟病理改變加重，提示NADPH氧化酶可能在DN的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

GLP-1是一種由腸道L細(xì)胞分泌的腸促胰島素，與胰島素分泌和糖代謝調(diào)節(jié)密切相關(guān)[12-14]。本研究結(jié)果顯示，艾塞那肽治療8周后，1型糖尿病大鼠腎臟NADPH氧化酶亞單位NOX4和p22phox mRNA表達(dá)顯著降低，腎臟CTGF表達(dá)減少，尿白蛋白減少，腎臟肥大及病理改變減輕，提示艾塞那肽對(duì)糖尿病大鼠腎臟具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制腎組織氧化應(yīng)激有關(guān)。

本研究結(jié)果還顯示，艾塞那肽對(duì)1型糖尿病大鼠血糖和胰島素水平無明顯影響。GLP-1的主要作用是刺激胰島素分泌，改善血糖控制。本實(shí)驗(yàn)使用的動(dòng)物模型是STZ誘導(dǎo)的1型糖尿病大鼠模型，其胰島B細(xì)胞幾乎完全被破壞，胰島素分泌量極低，GLP-1作用于胰島B細(xì)胞未能有效刺激胰島素分泌，因此血胰島素和血糖水平無明顯變化。本實(shí)驗(yàn)一次性給予大劑量STZ選擇性破壞胰島B細(xì)胞制備1型糖尿病大鼠模型。由于STZ對(duì)胰島B細(xì)胞有高度選擇性而對(duì)腎臟毒性作用較弱，且STZ在體內(nèi)半衰期較短，對(duì)腎臟的毒性作用很快消失，而高血糖持續(xù)存在。因此，造模成功8周后，STZ誘導(dǎo)的1型糖尿病大鼠腎臟結(jié)構(gòu)及功能變化是由高血糖引起而不是STZ直接毒性作用造成的。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，1型糖尿病大鼠腎臟組織NADPH氧化酶亞單位NOX4、p22phox和CTGF表達(dá)增加，尿白蛋白升高，腎臟肥大，腎臟組織病理改變加重。艾塞那肽治療后，1型糖尿病大鼠腎臟組織NADPH氧化酶亞單位NOX4、p22phox和CTGF的表達(dá)降低，尿白蛋白減少，腎臟肥大和腎臟病理改變減輕，對(duì)腎臟產(chǎn)生保護(hù)作用。后續(xù)研究擬在體和離體實(shí)驗(yàn)中，加入GLP-1受體激動(dòng)劑和GLP-1受體拮抗劑，觀察1型糖尿病大鼠腎臟和腎臟細(xì)胞NOX4、p22phox和CTGF表達(dá)的變化，以進(jìn)一步闡明GPL-1與腎臟組織NADPH氧化酶亞單位表達(dá)之間的關(guān)系。

[1]Etoh T, Inoguchi T, Kakimoto M, et al. Increased expression of NAD(P)H oxidase subunits, NOX4 and p22phox, in the kidney of streptozotocin-induced diabetic rats and its reversibility by interventive insulin treatment[J]. Diabetologia, 2003, 46(10):1428-1437.

[2]Li JH, Zhang H, Hou WL. Recent progress in the use of incretin for treating diabetes[J]. Acta Acad Med CPAPF, 2011, 20(7):597-599, 604. [李敬華, 張紅, 候雯莉. 腸促胰島素生理作用及應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 武警醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2011, 20(7): 597-599,604.]

[3]Park CW, Kim HW, Ko SH, et al. Long-term treatment of glucagon-like peptide-1 analog exendin-4 ameliorates diabetic nephropathy through improving metabolic anomalies in db/db mice[J]. J Am Soc Nephrol, 2007, 18(4): 1227-1238.

[4]Kodera R, Shikata K, Kataoka HU, et al. Glucagon-like peptide-1 receptor agonist ameliorates renal injury through its antiinflammatory action without lowering blood glucose level in a rat model of type 1 diabetes[J]. Diabetologia, 2011, 54(4): 965-978.

[5]Ojima A, Ishibashi Y, Matsui T, et al. Glucagon-like peptide-1 receptor agonist inhibits asymmetric dimethylarginine generation in the kidney of streptozotocin-induced diabetic rats by blocking advanced glycation end product-induced protein arginine methyltranferase-1 expression[J]. Am J Pathol, 2013,182(1): 132-141.

[6]Nie CY, Chen LM. Diagnosis of diabetic nephropathy[J]. Chin J Pract Inter Med, 2010, 30(5): 422-424. [聶春巖, 陳莉明. 糖尿病腎病的診斷[J]. 中國(guó)實(shí)用內(nèi)科雜志, 2010, 30(5): 422-424.]

[7]Asaba K, Tojo A, Onozato ML, et al. Effects of NADPH oxidase inhibitor in diabetic nephropathy[J]. Kidney Int, 2005, 67(5):1890-1898.

[8]Lim CS, Vaziri ND. The effects of iron dextran on the oxidative stress in cardiovascular tissues of rats with chronic renal failure[J]. Kidney Int, 2004, 65(5): 1802-1809.

[9]Li JW, Guo ZX. Effects of telmisartan on the expression of NADPH oxidase subunits in the myocardium of type 2 diabetic rats [J]. Med J Chin PLA, 2011, 36(10): 1037-1040. [李佳偉,郭志新. 替米沙坦對(duì)2型糖尿病大鼠心肌NADPH氧化酶亞單位表達(dá)的影響[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2011, 36(10): 1037-1040.]

[10]Persson P, Hansell P, Palm F. NADPH oxidase inhibition reduces tubular sodium transport and improves kidney oxygenation in diabetes[J]. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2012,302(12): R1443-R1449.

[11]Zhang C, Meng XF, Zhu ZH, et al. Role of connective growth factor in plasminogen activator inhibitor-1 and fibronectin expression induced by transforming growth factor beta1 in renal tubular cells [J]. Chin Med J (Engl), 2004, 117(7): 990-996.

[12]Yang L, Guo NJ, Cai DH, et al. Effect of liraglutide on serum AGEs and inflammatory factors in IGT-OLETF rats[J]. Med J Chin PLA, 2013, 38(2): 116-119. [楊力, 郭南京, 蔡德鴻, 等.利拉魯肽對(duì)IGT-OLETF大鼠血清糖基化終末產(chǎn)物及炎癥指標(biāo)的影響[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2013, 38(2): 116-119.]

[13]Chen RR, Liang LL, Wang JM, et al. Effects of exenatide on expression of VCAM-1, ICAM-1 in ApoE-knock-out mice with atherosclerosis[J]. Med J Chin PLA, 2013, 38(6): 467-471. [陳若然, 梁琳瑯, 王健美, 等. 艾塞那肽對(duì)載脂蛋白E基因敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型中VCAM-1、ICAM-1表達(dá)的影響[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2013, 38(6): 467-471.]

[14]Hu L, Shen H. Clinical analysis of the effects of exenatide on treatment of obese patients with type 2 diabetes--23 cases report[J]. Chin J Pract Inter Med, 2012, 32(4): 305-306. [胡玲,沈浩. 艾塞那肽治療肥胖2型糖尿病23例臨床分析[J]. 中國(guó)實(shí)用內(nèi)科雜志, 2012, 32(4): 305-306.]