兔海水浸泡脊髓損傷的病理變化觀察

張迪，裴少保，王海峰，蔣傳海，朱捷，吳成如，吳健，程迅生，方健

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷[1]。原發(fā)損傷后繼發(fā)的脊髓缺血﹑水腫﹑炎癥﹑出血﹑中心性壞死等，特別是水腫和能量代謝障礙可引發(fā)一系列級聯(lián)放大效應(yīng)，使脊髓損傷進(jìn)一步加重。海水具有低溫﹑高滲﹑低堿性的特點(diǎn)，作為一種特殊的環(huán)境因素，研究海水浸泡后脊髓損傷的病理變化特點(diǎn)有一定的現(xiàn)實(shí)意義。為此本研究建立脊髓損傷海水浸泡模型，探討海水浸泡對脊髓損傷后神經(jīng)功能﹑病理學(xué)及細(xì)胞凋亡的影響，以期為海水浸泡脊髓損傷的早期救治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 人工海水制作 根據(jù)國家海洋局第三研究所提供的配方配制人工海水，主要指標(biāo)如下：滲透濃度為1250±12mmol/L，pH值8.2，Na+濃度630.0±5.0mmol/L，Cl–濃度658.80±5.25mmol/L，K+濃度10.88±0.68mmol/L，溫度為21±2℃。具體配方為：氯化鈉26.518g/L﹑硫酸鎂3.305g/L﹑氯化鎂2.447g/L﹑氯化鈣1.141g/L﹑氯化鉀0.725g/L。

1.2 動(dòng)物分組 健康大耳白兔96只，雌雄不限，體重2.5～3.0kg，購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為4組：A組，即假手術(shù)組，僅切除椎板不損傷脊髓(n=6)；B組，切除椎板并建立脊髓損傷模型，但不浸泡(n=30)；C組，切除椎板并建立脊髓損傷模型，生理鹽水浸泡60min(n=30)；D組，切除椎板并建立脊髓損傷模型，海水浸泡60min(n=30)。除A組外，其他3組分別于處理后1﹑6﹑12﹑24﹑48h時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)選取6只動(dòng)物進(jìn)行取材觀察。

1.3 脊髓損傷動(dòng)物模型的制備 采用改良Allen's打擊器制作兔脊髓損傷模型。動(dòng)物以3mg/kg戊巴比妥鈉靜脈麻醉后俯臥位固定，頸背部備皮﹑碘附消毒。以第10胸椎(T10)為中心做后正中縱行切口，長約5cm，逐層切開，暴露T10段脊髓，在暴露的硬膜表面放置5mm×3mm大小的弧形墊片以保證打擊均勻。將質(zhì)量為20g的圓柱狀金屬棒從固定高度(5cm)自由落下制作脊髓打擊模型，以術(shù)中見兔尾出現(xiàn)痙攣性擺動(dòng)，雙下肢及軀體回縮撲動(dòng)作為打擊成功的標(biāo)準(zhǔn)。脊髓損傷模型制作成功后仔細(xì)止血，C﹑D組兔不縫合切口，固定在平板上并直立浸泡于溫度為21±2℃的生理鹽水(C組)或人工海水(D組)中，水面與胸骨柄上緣平齊，浸泡時(shí)間為60min。

1.4 神經(jīng)功能評分 在1﹑6﹑12﹑24﹑48h時(shí)間點(diǎn)，于A組中隨機(jī)選取1只動(dòng)物，B﹑C﹑D各組隨機(jī)選取6只動(dòng)物，采用Tarlov評分法進(jìn)行脊髓損傷后神經(jīng)功能評分[2]。0級：后肢無活動(dòng)，不能負(fù)重；1級：后肢可見活動(dòng)，但不能負(fù)重；2級：后肢活動(dòng)頻繁或有力，不能負(fù)重；3級：后肢可支持體重，能走1～2步；4級：可行走，僅有輕度障礙；5級：行走功能正常。

1.5 取材及標(biāo)本制作 各組于相應(yīng)的神經(jīng)功能評分后麻醉動(dòng)物，仰臥位固定，剪開胸腔，升主動(dòng)脈插管，先用生理鹽水灌注至無血液流出，再用濃度為4%的多聚甲醛2000ml灌注固定，然后從兔背部原手術(shù)切口進(jìn)入，取脊髓損傷段及其上下部分(長約3cm)，先肉眼觀察大體病理形態(tài)，然后在距離打擊區(qū)0.3cm處取材[3]，4%多聚甲醛固定24h，洗滌﹑脫水﹑透明﹑浸蠟，石蠟包埋固定，切片機(jī)切片(厚5μm)，取材的每個(gè)脊髓組織切片4張，烘干后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 病理組織學(xué)觀察 切片二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，流水沖洗后行HE染色，光鏡下觀察。

1.7 免疫組織化學(xué)染色 采用免疫組化SABC法。Bcl-2和Bax免疫組化試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。操作方法：貼片脫蠟﹑抗原修復(fù)，3%H2O2去離子水消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，滴加封閉血清阻斷非特異性抗原，添加一抗(Bcl-2，1:200稀釋；Bax，1:150稀釋)4℃過夜，然后分別滴加生物素標(biāo)記的二抗工作液﹑辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，DAB顯色，蘇木素復(fù)染后脫水﹑透明﹑樹脂封固，光鏡下觀察。400×視野下，每張切片選取3個(gè)典型Bcl-2和Bax陽性染色區(qū)域，計(jì)算機(jī)病理圖像分析系統(tǒng)測定其吸光度(A)值，結(jié)果以平均值表示。

1.8 脊髓神經(jīng)細(xì)胞凋亡檢測 采用TUNEL法，試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，具體操作按說明書進(jìn)行，最后經(jīng)DAB顯色。細(xì)胞核被染成棕黃色為陽性細(xì)胞(凋亡細(xì)胞)。400×光鏡下計(jì)數(shù)每張切片中脊髓左右前角和后角各1個(gè)視野(共4個(gè)視野)的陽性細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算每張切片陽性細(xì)胞數(shù)的平均值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 動(dòng)物一般情況 實(shí)驗(yàn)過程中，C組48h取材死亡動(dòng)物1只，D組24h取材死亡1只，48h取材死亡2只，均及時(shí)予以補(bǔ)充。

2.2 神經(jīng)功能評分 B﹑C﹑D組動(dòng)物在造模后Tarlov評分均明顯下降，1h時(shí)間點(diǎn)3組差異不明顯，6h時(shí)間點(diǎn)D組明顯高于B﹑C兩組(P＜0.05)，但12﹑24﹑48h時(shí)間點(diǎn)D組明顯低于B﹑C組(P＜0.05)。B組和C組各時(shí)間點(diǎn)Tarlov評分無明顯差異(P＞0.05)。A組僅于造模后1h出現(xiàn)后肢運(yùn)動(dòng)功能障礙，其后各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能均完好，評分為5分(表1)。

2.3 病理組織學(xué)變化 大體觀察B﹑C組可見明顯脊髓腫脹﹑充血；D組6h時(shí)間點(diǎn)腫脹較B﹑C組輕，12h時(shí)間點(diǎn)則明顯加重；24﹑48h時(shí)間點(diǎn)各組脊髓腫脹﹑充血程度減輕。HE染色光鏡下觀察見A組脊髓組織結(jié)構(gòu)完整，神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)正常，無出血現(xiàn)象。與A組比較，B組1h時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)細(xì)胞輕度水腫，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，未見破壞，白質(zhì)基本正常；6h時(shí)間點(diǎn)脊髓組織結(jié)構(gòu)開始出現(xiàn)破壞，神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)一步腫脹，白質(zhì)輕度水腫；12h各種情況進(jìn)一步惡化，部分神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)濃染現(xiàn)象，整個(gè)胞體及胞膜皺縮，并有炎癥細(xì)胞浸潤；24﹑48h灰質(zhì)中神經(jīng)細(xì)胞減少，多數(shù)神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)胞質(zhì)空泡及核固縮，白質(zhì)出現(xiàn)軸突水腫﹑空泡變性。C組各時(shí)間點(diǎn)脊髓病理變化與B組類似。D組在1h時(shí)間點(diǎn)脊髓病理變化與B組類似，6h時(shí)間點(diǎn)脊髓組織腫脹較輕，出血較少，白質(zhì)軸突水腫﹑空泡變性較輕，但12h后脊髓組織腫脹明顯加重，出血增多，神經(jīng)細(xì)胞胞質(zhì)空泡化及核固縮現(xiàn)象加重，白質(zhì)軸突水腫及空泡變性加重，48h灰質(zhì)和白質(zhì)中出現(xiàn)多量空泡，零星可見神經(jīng)細(xì)胞(圖1)。

表1 兔脊髓損傷后不同時(shí)間點(diǎn)各組Tarlov評分(±s，n=6)Tab. 1 Tarlov score at different time points in rabbits of each group after spinal cord injury (±s, n=6)

表1 兔脊髓損傷后不同時(shí)間點(diǎn)各組Tarlov評分(±s，n=6)Tab. 1 Tarlov score at different time points in rabbits of each group after spinal cord injury (±s, n=6)

(1)P＜0.05 compared with group A; (2)P＜0.05 compared with group B; (3)P＜0.05 compared with group C

Time point (h) Group A Group B Group C Group D 1 3.00±0.00 1.00±0.63(1) 0.83±0.75(1) 1.33±0.52(1)5.00±0.00 1.83±0.41(1) 1.67±0.52(1) 2.50±0.55(1)(2)(3)12 5.00±0.00 1.33±0.52(1) 1.17±0.41(1) 0.50±0.55(1)(2)(3)24 5.00±0.00 2.00±0.00(1) 1.83±0.41(1) 0.83±0.41(1)(2)(3)48 5.00±0.00 2.33±0.52(1) 2.17±0.41(1) 1.17±0.41(1)(2)(3)6

圖1 海水浸泡后(D組)各時(shí)間點(diǎn)脊髓病理組織學(xué)變化(HE ×400)Fig. 1 Histopathological changes of spinal cord at each time point after seawater immersion (group D, HE ×400)

2.4 免疫組化染色結(jié)果 光鏡下見脊髓灰質(zhì)中Bcl-2表達(dá)陽性的多角細(xì)胞形態(tài)基本正常，而Bax表達(dá)陽性的多角細(xì)胞形態(tài)不一，細(xì)胞核固縮。A組脊髓灰質(zhì)中的多角細(xì)胞各時(shí)間點(diǎn)形態(tài)正常，未見Bcl-2﹑Bax陽性表達(dá)。D組Bcl-2 A值在24h最高，之后下降，48h只見到零星陽性細(xì)胞，Bax A值于12h時(shí)間點(diǎn)達(dá)高峰，之后下降，48h只見到零星陽性細(xì)胞(圖2)。B﹑C組Bax﹑Bcl-2 A值呈上升趨勢，分別于12﹑24h時(shí)間點(diǎn)達(dá)高峰，但各時(shí)間點(diǎn)兩組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。在1h時(shí)間點(diǎn)3組Bcl-2﹑Bax A值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。D組Bax A值在6h低于B﹑C組，12﹑24﹑48h高于B﹑C組，而Bcl-2 A值在6﹑12﹑24﹑48h均低于B﹑C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，表2)。

2.5 TUNEL染色結(jié)果 A組各時(shí)間點(diǎn)可見零星TUNEL陽性細(xì)胞。B﹑C﹑D組1h時(shí)間點(diǎn)TUNEL陽性細(xì)胞較為稀疏，此后陽性細(xì)胞明顯增多，灰質(zhì)和白質(zhì)中均可見(圖3)。由表3可見，3組TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)均于12h達(dá)高峰，D組于12h達(dá)高峰后迅速下降，48h只有少量陽性細(xì)胞，B﹑C組陽性細(xì)胞數(shù)達(dá)高峰后下降幅度較低，至48h仍有較多陽性細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，D組TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)在6h時(shí)間點(diǎn)明顯低于B﹑C組，在12h時(shí)間點(diǎn)明顯增高，顯著高于B﹑C組，此后迅速下降，在24﹑48h明顯低于B﹑C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。B﹑C兩組各時(shí)間點(diǎn)TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

圖2 海水浸泡后(D組)各時(shí)間點(diǎn)Bcl-2及Bax表達(dá)情況(免疫組化 ×400)Fig. 2 Bcl-2 and Bax expression at different time points after seawater immersion (group D) (Immunohistochemical ×400)

表2 各組脊髓損傷后不同時(shí)間點(diǎn)Bcl-2﹑Bax A值比較(±s，n=6)Tab. 2 Comparison of optical density value of Bcl-2 and Bax at different time points after spinal cord injury (±s, n=6)

表2 各組脊髓損傷后不同時(shí)間點(diǎn)Bcl-2﹑Bax A值比較(±s，n=6)Tab. 2 Comparison of optical density value of Bcl-2 and Bax at different time points after spinal cord injury (±s, n=6)

(1)P＜0.05 compared with group B; (2)P＜0.05 compared with group C

Group Bcl-2 Bax B 1h 77.3±3.2 107.0±6.1 6h 104.9±3.5 127.5±2.6 12h 114.9±1.7 162.9±3.4 24h 128.7±3.5 121.9±3.5 48h 92.8±2.3 94.7±2.8 C 1h 78.8±3.2 107.4±6.0 6h 103.9±3.5 126.0±5.1 12h 112.3±1.9 163.8±3.3 24h 126.9±5.2 120.2±5.0 48h 93.9±3.1 95.0±3.3 D 1h 75.8±5.5 91.6±2.9 6h 100.5±5.3(1)(2) 107.9±5.2(1)(2)12h 107.9±4.2(1)(2) 194.1±2.8(1)(2)24h 119.8±4.9(1)(2) 132.5±4.1(1)(2)48h 88.7±1.8(1)(2) 113.4±2.1(1)(2)

表3 各組脊髓損傷后不同時(shí)間點(diǎn)TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)比較(±s, n=6)Tab. 3 Comparison of the number of TUNEL positive cells in each group at different time points after spinal cord injury (±s,n=6)

表3 各組脊髓損傷后不同時(shí)間點(diǎn)TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)比較(±s, n=6)Tab. 3 Comparison of the number of TUNEL positive cells in each group at different time points after spinal cord injury (±s,n=6)

(1)P＜0.05 compared with group B; (2)P＜0.05 compared with group C

Time point (h) Group B Group C Group D 1 4.7±1.6 4.7±1.2 2.3±1.2 6 14.2±1.2 13.5±1.4 8.2±1.2(1)(2)12 20.3±3.1 21.2±1.6 27.8±1.2(1)(2)24 19.5±2.1 18.7±2.7 15.8±1.2(1)(2)48 9.7±2.2 10.5±1.9 4.8±1.5(1)(2)

3 討 論

脊髓損傷時(shí)除了初始物理打擊造成的脊髓神經(jīng)細(xì)胞直接死亡外，還包括損傷區(qū)及臨近部位的繼發(fā)損傷，主要表現(xiàn)為細(xì)胞凋亡，而細(xì)胞凋亡可在原發(fā)損傷的基礎(chǔ)上進(jìn)一步加重脊髓損害。本研究采用改良Allen's打擊器制作脊髓損傷模型，使用人工海水模擬天然海水低溫﹑高滲﹑低堿性的特點(diǎn)，制作海水浸泡脊髓損傷動(dòng)物模型，并對模型動(dòng)物進(jìn)行神經(jīng)功能評分。結(jié)果顯示，除A組外，其余3組動(dòng)物Tarlov評分均明顯下降，D組僅于6h時(shí)間點(diǎn)評分高于B﹑C組，6h后評分明顯惡化。HE染色顯示海水浸泡早期(6h)D組脊髓神經(jīng)細(xì)胞變性﹑水腫程度較B﹑C組輕，但12h后脊髓神經(jīng)細(xì)胞腫脹﹑胞質(zhì)空泡化及核固縮等現(xiàn)象明顯加重，白質(zhì)軸突水腫﹑空泡變性加重，脊髓組織破壞較B﹑C組更嚴(yán)重，這也解釋了海水浸泡后模型動(dòng)物不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能評分變化的規(guī)律。免疫組化染色顯示，D組Bax表達(dá)量在12h前低于B﹑C組，12h后明顯增加，顯著高于B﹑C組，而Bcl-2的表達(dá)量始終呈上升趨勢，但在各時(shí)間點(diǎn)均低于B﹑C組，表明海水浸泡對凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)具有一定影響，可促進(jìn)Bax的表達(dá)，抑制Bcl-2表達(dá)。本研究通過TUNEL法檢測發(fā)現(xiàn)各組均有陽性細(xì)胞，但D組海水浸泡早期(6h)脊髓陽性細(xì)胞數(shù)低于B﹑C組，至12h明顯增多，顯著高于B﹑C組，此后則迅速下降，24﹑48h陽性細(xì)胞數(shù)明顯低于B﹑C組，這是由于24﹑48h脊髓中神經(jīng)細(xì)胞大量消失，導(dǎo)致陽性細(xì)胞數(shù)量明顯下降，這也進(jìn)一步說明海水浸泡在原有創(chuàng)傷的基礎(chǔ)上促進(jìn)了神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。

圖3 海水浸泡后(D組)各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞凋亡情況(TUNEL ×400)Fig. 3 Cell apoptosis at different time points after seawater immersion (group D) (TUNEL ×400)

本研究結(jié)果提示海水浸泡可能延遲了脊髓神經(jīng)細(xì)胞水腫﹑凋亡的發(fā)生，但最終卻是進(jìn)一步加重了神經(jīng)細(xì)胞的水腫和凋亡，與相關(guān)報(bào)道相一致[4]。這種不同于身體其他組織如骨骼肌﹑肺等經(jīng)海水浸泡后的病理變化特點(diǎn)[5]，可能與海水的低溫﹑高滲特性有關(guān)。海水浸泡早期低溫減緩了細(xì)胞的能量代謝，延遲了酸中毒的發(fā)生，減輕了脊髓損傷后的病理損害程度[6]，高滲狀態(tài)則抑制水分向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移，減輕了神經(jīng)細(xì)胞的水腫，但后期海水的高離子濃度加重了神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)外的離子濃度紊亂，大量水分進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞，同時(shí)興奮性氨基酸等有害神經(jīng)遞質(zhì)大量釋放[7]，這些因素則加重了神經(jīng)細(xì)胞的損害。

本實(shí)驗(yàn)僅模擬了自然海水的低溫﹑高滲﹑低堿性等理化性質(zhì)，對天然海水中含有大量的微生物因素未予考慮，故該結(jié)果雖可確定海水理化性質(zhì)對脊髓神經(jīng)細(xì)胞病理變化的影響，但尚不能完全展示自然海水浸泡后脊髓神經(jīng)細(xì)胞病理變化的特點(diǎn)，此外，海水浸泡后脊髓神經(jīng)細(xì)胞病理學(xué)改變的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究探討。

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