重組水蛭素對UUO大鼠腎間質(zhì)纖維化影響及機(jī)制研究

★ 何敏 徐再春 潘慶 李娜 (.浙江省立同德醫(yī)院 杭州 300；.浙江中醫(yī)藥大學(xué) 杭州 30053)

重組水蛭素對UUO大鼠腎間質(zhì)纖維化影響及機(jī)制研究

★ 何敏1*徐再春**潘慶1李娜2(1.浙江省立同德醫(yī)院 杭州 310012；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué) 杭州 310053)

目的：探討重組水蛭素(recombinant hirudin，rH)對單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)大鼠對腎間質(zhì)纖維化(RIF)的作用及其可能機(jī)制研究。方法：將48只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(N組)、模型組(M組)、依那普利治療組(Y組)和重組水蛭素組(R組)，后3組建立UUO大鼠模型。治療結(jié)束后處死大鼠，測大鼠腎功能，行HE、Masson染色觀察腎間質(zhì)病理變化，用免疫組化半定量法測定腎TGF-β1、α-SMA的表達(dá)。結(jié)果：兩治療組大鼠BUN、SCr低于模型組(Plt;0.01)，兩治療組組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)；免疫組化結(jié)果表明，兩治療組TGF-β1和α-SMA的表達(dá)量均低于模型組(Plt;0.01)，兩治療組組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)。結(jié)論：重組水蛭素可能通過下調(diào)TGF-β1和α-SMA，減少促纖維化生長因子及肌成纖維細(xì)胞的增殖、活化、表型轉(zhuǎn)化從而起到防治RIF。

重組水蛭素；腎間質(zhì)纖維化；轉(zhuǎn)化生長因子β1；α-平滑肌肌動蛋白

腎臟纖維化是各種腎臟疾病慢性進(jìn)展到終末期腎衰竭的共同途徑[3]，其中各種炎細(xì)胞的浸潤，一系列細(xì)胞因子的作用，細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)產(chǎn)生與降解的失衡等均參與了腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生與發(fā)展[4]。TGF-β1迄今為止已知作用最強(qiáng)的促纖維化細(xì)胞因子，α-SMA是肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志物。本實(shí)驗(yàn)觀察重組水蛭素對UUO大鼠模型中TGF-β1、α-SMA的表達(dá)水平的影響，探討重組水蛭素對UUO大鼠RIF的影響及可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

健康成年雄性SD大鼠48只，體重190～210g。由浙江省中醫(yī)藥研究院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

注射用重組水蛭素購于大連保稅區(qū)聯(lián)合博泰生物技術(shù)有限公司，規(guī)格：比活≥12 000 ATU/mg，純度≥95%，批號：20111013；馬來酸依那普利片劑(江蘇揚(yáng)子江制藥有限公司生產(chǎn)，批號：11031701)。治療藥物均放入4℃冰箱保存?zhèn)溆?，使用時(shí)搖勻。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

民間融資監(jiān)管法律以正當(dāng)利益為平衡點(diǎn)促進(jìn)雙方行為選擇的動機(jī)理性。融資權(quán)利作為私權(quán)利，法律設(shè)置主體行為界限是不損害他人的自由權(quán)利，凡不危及他人利益的行為皆可認(rèn)為是動機(jī)理性。監(jiān)管者是社會公共利益代表，法律設(shè)定其保護(hù)融資權(quán)利實(shí)現(xiàn)的職責(zé)以對權(quán)力行使進(jìn)行目的性限制。當(dāng)融資主體行為不傷害他人正當(dāng)利益時(shí)，監(jiān)管者不必也不得行動。因?yàn)闄?quán)力行使是防止雙方互相侵害而非直接實(shí)現(xiàn)，只要融資主體不傷害他人正當(dāng)利益就必須尊重其行為選擇的自由。此時(shí)，即使可能更有利于對方利益實(shí)現(xiàn)，權(quán)力也不可行使。只有當(dāng)融資主體行為傷害他人利益時(shí)，監(jiān)管者才能對之進(jìn)行限制和處罰。

BUN試劑盒、SCr試劑盒、HE染色試劑盒、Masson染色試劑盒、兔抗大鼠α-SMA多克隆抗體、兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗體、生物素化羊抗鼠IgG：北京博奧森生物工程有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組及造模方法

48只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后按體重隨機(jī)分為假手術(shù)組(N組)、模型組(M組)、重組水蛭素組(R組)及依那普利組(Y組)，每組12只。造模方法：所有大鼠均采用質(zhì)量濃度為10%水合氯醛(30mg/100g體重)腹腔注射麻醉。取仰臥位固定于手術(shù)臺上，碘酒及75%酒精消毒手術(shù)區(qū)，鋪無菌洞巾，沿腹白線鈍性分離皮下組織、肌層直至腹腔，游離左側(cè)腎臟及輸尿管，用組織鉗分離后托起左側(cè)側(cè)輸尿管中段部位，用4-0絲線結(jié)扎左側(cè)輸尿管上下兩端，上一道結(jié)扎點(diǎn)位于左腎下級水平，然后剪斷兩結(jié)扎點(diǎn)之間輸尿管，檢查手術(shù)視野有無持續(xù)出血，然后逐層縫合皮下組織及皮膚，清潔傷口,并用滅菌輔料包扎，喂水并觀察，術(shù)后1天即拆下輔料。假手術(shù)組手術(shù)方式對輸尿管中段僅做分離，但不結(jié)扎及剪斷輸尿管，余操作同UUO。

1.2.2 干預(yù)方式

術(shù)后1天開始干預(yù)，R組：重組水蛭素1.5mg/kg·天皮下注射；Y組：依那普利10mg/kg·天灌胃；N組、M組：給予等量生理鹽水皮下注射；療程 4周。

1.2.3 觀察指標(biāo)及操作方法

給藥結(jié)束后，采血測腎功能，留取梗阻腎臟，行HE、Masson染色、TGF-β1及α-SMA免疫組化染色檢測。采用Image-ProPlus5.0圖像系統(tǒng)進(jìn)行分析，每張切片隨機(jī)選取切片400倍鏡下選取5個不重疊視野對腎組織的病變情況進(jìn)行積分光密度值(IOD值)分析，采用平均IOD值作為該例大鼠TGF-β1、α-SMA的相對表達(dá)量。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 腎功能比較

見表1。

表1 各組大鼠治療后BUN、SCr的比較

1.模型組(HE染色×100)；2.重組水蛭素組(HE染色×100)；3.模型組(Masson染色×400)；

2.2 腎臟組織病理觀察

HE染色示：模型組見腎實(shí)質(zhì)變薄，皮髓分界不清，伴有腎小管上皮細(xì)胞腫脹、彌漫性空泡變形，遠(yuǎn)端小管上皮細(xì)胞扁平、間質(zhì)增寬，部分腎小管管腔內(nèi)有蛋白管型；腎間質(zhì)內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤、肌成纖維細(xì)胞增生，間質(zhì)纖維化，腎小球病變改變不明顯(見圖1)；重組水蛭素組及依那普利組：病變較模型組輕，腎小管擴(kuò)張、炎細(xì)胞浸潤、細(xì)胞外基質(zhì)較模型組減少(見圖2)。

Masson示：模型組可見腎間質(zhì)皮髓交界處有大量藍(lán)色膠原纖維增生，腎小球無明顯病變(見圖3)，重組水蛭素組和依那普利組腎間質(zhì)膠原纖維較模型組減少(見圖4)。

2.3 TGF-β1、α-SMA的表達(dá)情況

TGF-β1在假手術(shù)組間質(zhì)區(qū)僅有微量表達(dá)，在模型組腎小管間質(zhì)區(qū)可見較多片狀或線樣分布于腎小管上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞中(見圖5-7)。α-SMA除去在血管平滑肌上表達(dá)的部分，在間質(zhì)區(qū)的表達(dá)部位與TGF-β1相似(見圖8-11)。

各組大鼠α-SMA及TGF-β1的表達(dá)比較見表2。

表2 各組大鼠α-SMA 及TGF-β1的表達(dá)比較

3 討論

TGF-β是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化的超家族分子，其中以TGF-β1最為重要，它是迄今為止已知作用最強(qiáng)的促纖維化細(xì)胞因子。TGF-β1通過多個環(huán)節(jié)參與腎間質(zhì)纖維化，導(dǎo)致ECM過度積聚，此生物作用已被多種實(shí)驗(yàn)證實(shí)[5]。α-SMA是平滑肌和肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志蛋白，其在腎臟胚胎發(fā)育期曾被發(fā)現(xiàn)，但在正常成熟的腎臟除了腎血管平滑肌細(xì)胞外，腎臟的實(shí)質(zhì)及間質(zhì)細(xì)胞均無表達(dá)或痕量表達(dá)α-SMA。在慢性腎纖維化過程中，間充質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化表達(dá)α-SMA是其活化及損傷的標(biāo)志，且是核心環(huán)節(jié)。

水蛭，其藥性較為平和，是一味“活血不傷正”的活血要藥，臨床上常用于慢性腎臟疾病的長期治療，其能夠改善腎功能，降低蛋白尿，降低血脂，具有抗血栓，抗凝，改善血液流變性，抗炎、抗增殖等多種藥理活性[1]。重組水蛭素作為水蛭最主要的活性成分經(jīng)過基因重組技術(shù)研制的產(chǎn)物，其運(yùn)用于腎臟疾病的實(shí)驗(yàn)及臨床研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)重組水蛭素組大鼠腎功能、梗阻腎腎臟病理、免疫組化α-SMA 及TGF-β1的相對表達(dá)量等指標(biāo)明顯優(yōu)于模型組，揭示了重組水蛭素可減輕腎功能損害，減輕UUO大鼠腎臟病理結(jié)構(gòu)變化，保護(hù)殘余腎功能，有效地延緩腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展。其機(jī)制可能與下調(diào)TGF-β1和α-SMA表達(dá)，減少促纖維化細(xì)胞因子生成，抑制腎小管上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化，使細(xì)胞外基質(zhì)膠原(ECM)生成減少有關(guān)。

目前國內(nèi)外重組水蛭素主要用于腎臟病的血液透析抗凝治療領(lǐng)域[6]，對于腎臟疾病本身的研究較少。但我們相信隨著大量實(shí)驗(yàn)及臨床研究的深入，重組水蛭素在慢性腎臟病中的應(yīng)用前景將更加廣闊。

[1]危成筠.水蛭及水蛭素在腎臟病中的應(yīng)用及研究進(jìn)展.中國中醫(yī)藥科技,2001,08(2): 136-137.

[2]王金海,馮長青.活血化瘀應(yīng)貫穿于腎臟病治療之始終.甘肅中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2005,22(6): 15-17.

[3]Buhl R, Stephen G. Future directions in the pharmacologic therapy of chronic obstructive pulmonary disease[J]. ATS, 2005, 2 (11):83-93.

[4]谷海瑛,趙宗江,楊美娟.復(fù)方鱉甲軟肝片對單側(cè)輸尿管結(jié)扎大鼠腎組織NF-κB表達(dá)的影響.中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜質(zhì),2005,06(3):137-139.

[5]El Chaar M, Chen J, Seshan S V, et al. Effect of combination therapy with Enalapril and the TGF-beta antagonist1D11 in unilateral ureteral obstruction. Am J Physiol Renal Physiol, 2007,292 ( 4 ): F1 291-1 301.

[6]Vanlholder RC,Camez AA,VeysNM,et a1.Recombinant hirudin:especific thombin inhibiting anticoagulant for helnodiaiysis[J].Kindey intematlbnal,1994,45:1 754-1 759.

征稿啟事

《江西中醫(yī)藥》所設(shè)的重點(diǎn)欄目有《明醫(yī)心鑒》、《滕王閣醫(yī)話》等。《明醫(yī)心鑒》以介紹名老中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)和中醫(yī)臨證心得為主，重點(diǎn)刊載中醫(yī)關(guān)于疑難病的診療經(jīng)驗(yàn)，要求觀點(diǎn)、方法新，經(jīng)驗(yàn)獨(dú)到。《滕王閣醫(yī)話》主要反映中醫(yī)教學(xué)、科研、臨床的一得之見，要求以小見大，有感而文，語言生動流暢，可讀性強(qiáng)，富于知識性、趣味性。

何敏(1987-)，女，漢族，浙江衢州人，碩士研究生，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合臨床(腎臟病學(xué))。

**通訊作者：徐再春，男，漢族，浙江杭州人，教授，主任中醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師，研究方向：腎臟病的中西醫(yī)結(jié)合臨床與實(shí)驗(yàn)研究，Tel：18989848828，E-mail：429491507@qq.com

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2013-05-30)