葡萄糖酸錳和氯化錳作為口服磁共振肝臟對比劑的實驗研究

姚楠，高萌，張健，蔣翠花，黃德健，倪以成

Mn2＋具有很強(qiáng)的順磁性，導(dǎo)致T1弛豫時間縮短，并且可被肝細(xì)胞特異性攝取，使肝臟T1WI信號明顯升高，是一種良好的肝臟磁共振陽性對比劑［1］。其中CMC-001是由丹麥CMC Contrast AB公司研制的一種口服新型含錳肝臟磁共振對比劑，已經(jīng)進(jìn)入三期臨床研究［2］，其主要應(yīng)用集中于肝臟和膽道局灶性病變的診斷研究，如肝臟轉(zhuǎn)移腫瘤和膽管腫瘤成像［3-4］，其成像原理是錳口服后通過門靜脈進(jìn)入肝臟，被肝細(xì)胞攝取，蓄積在肝臟和膽道，因此可以提高肝實質(zhì)和膽道的信號，而轉(zhuǎn)移瘤病灶呈相對低信號，在T1WI圖像上可以把腫瘤更清晰地區(qū)分出來，實現(xiàn)成像目的［5］。

錳口服后，主要在腸道吸收，但吸收效率通常很有限，因為在PH 值較高的小腸液里，錳變成不可溶的氫氧化物多聚體，影響了腸道對錳的吸收效率［6］，從而使肝臟中錳不能達(dá)到有效含量，影響成像效果。相關(guān)畜禽飼料研究表明，螯合形式的有機(jī)錳在小腸中的吸收率高于無機(jī)形態(tài)的錳，因為螯合物可以防止金屬元素在腸道變成不溶性化合物或防止金屬元素被吸附在有礙元素吸收的不溶解膠體上，促進(jìn)元素的吸收［7］。因此螯合錳可能提高肝臟中錳的含量，具有開發(fā)為口服錳磁共振對比劑的潛在價值。

本研究通過比較有機(jī)螯合物葡萄糖酸錳和氯化錳（CMC-001的主要成像成分）口服后對肝臟的磁共振增強(qiáng)效果和肝臟中錳的含量兩方面的研究，為尋找安全有效的肝臟磁共振新型對比劑提供實驗依據(jù)。

材料與方法

1.藥品和試劑

四水合氯化錳（分析純，西隴化工股份有限公司）；葡萄糖酸錳（食品級，上海泰諾化工有限公司）；錳儲存液（國家標(biāo)準(zhǔn)溶液，國家鋼鐵測試中心冶金部鋼鐵研究總院）；異氟烷（河北九派制藥有限公司，110501）；HNO3（優(yōu)級純，上海久億化學(xué)試劑有限公司）。實驗用水均為超純水。

2.儀器

磁共振儀（美國GE EchoSpeed 1.5T），GE AW 4.3工作站；大鼠線圈（上海辰光醫(yī)療科技股份有限公司，CG-MUC18-H150-AG）；TAS-990 型原子吸收光譜儀（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；MARS-5型微波消解儀（美國CEM 公司）；Matrix VMP小動物麻醉機(jī)（北京吉安得爾科技有限公司）；電熱干燥箱（上海精宏DHG-9123A）。

3.實驗動物

SD 大鼠，48只，全雄，體重（250±20）g，SPF 級，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，動物質(zhì)量合格證號：SCXK（滬）2007-0005。

4.實驗分組與設(shè)計

取SD 大鼠36只，分為3組，每組12只。組1：四水合氯化錳灌胃組；組2：葡萄糖酸錳灌胃組；組3：超純水灌胃組。各組禁食12h后，分別灌胃，灌胃劑量為2mmol／kg，灌胃體積為10mL／kg。各組灌胃后分別在4h和8h處死6只大鼠，取出肝臟，放在80℃烘箱中烘干48h，稱重。

取剩余SD 大鼠12只，分為2組，每組6只。組1：四水合氯化錳組；組2：葡萄糖酸錳組。兩組禁食12h后吸入異氟烷麻醉，進(jìn)行肝臟MRI掃描，掃描結(jié)束后分別灌胃，灌胃劑量和體積同前，之后分別在4h和8h再次進(jìn)行肝臟MRI掃描。

5.肝臟樣品預(yù)處理和測定

供試品制備：取肝臟樣品0.5g，精密稱定，置聚四氟乙烯消解罐內(nèi)，加濃硝酸5mL 混勻，浸泡15min，再加硝酸5mL 并蓋好內(nèi)蓋，旋好外套。置微波消解爐內(nèi)消解（表1）。

表1 微波消解升溫程序

取出冷卻至室溫后，聚四氟乙烯（polytetraflilroethylene，PTFE）內(nèi)罐中的溶液以0.1%硝酸潤洗至揮酸杯再置電熱板上緩緩加熱至紅棕色蒸汽揮盡，并繼續(xù)加熱濃縮至約1mL，放冷，用純水轉(zhuǎn)移至50mL 容量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻即得［8］。

錳標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密量取不同濃度的錳標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用原子吸收法測定吸光度，記錄讀數(shù)，以濃度為橫坐標(biāo)，吸收度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w得到方程為Y＝0.2364x＋0.0101，r＝0.9998，結(jié)果表明Mn在0～4.00μg／mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

精密度試驗：精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別連續(xù)進(jìn)樣6次，測定吸光度，計算RSD，RSD 為0.35%。

穩(wěn)定性試驗：取供試品，依法制備得供試品溶液，每隔2h進(jìn)一次樣品，共進(jìn)6次，計算含量及RSD，結(jié)果RSD 為3.10%，說明樣品在10個小時內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗：取相同的6份供試品，依法制備得供試品溶液，計算含量及RSD，結(jié)果表明，含量為16.90μg／g，RSD 為2.87%。

加樣回收率試驗：采用6份樣品，每份0.25g，分別加入標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，計算平均加樣回收率為95.20%，RSD 為2.01%。

樣品含量測定：按照樣品前處理的微波消解操作對樣品進(jìn)行消解處理并得到樣品溶液，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過下列公式計算出樣品中的Mn含量。樣品中錳的最終濃度＝（樣品濃度×50）／肝臟干重（單位：μg／g肝臟組織）。

6.磁共振檢查

磁共振檢查采用GE Excite Echospeed HD 1.5T超導(dǎo)磁共振成像設(shè)備，大鼠線圈。冠狀面定位，常規(guī)行橫軸面T1WI掃描，層厚3mm，層間隔0.2mm，視野10cm×10cm，矩陣224×192，激勵次數(shù)2。T1WI SE序列，TR 550ms，TE 24ms。

7.磁共振圖像分析

在每只大鼠SE-T1WI圖像上選取肝臟圖像最明顯、連續(xù)的三個層面。在GE 后處理工作站AW 4.3上選取直徑為3mm 的興趣區(qū)（ROI），自動得到肝臟信號強(qiáng)度（singal intensity，SI），取連續(xù)三層SI的平均值代表肝臟的SI。采用下列公式計算肝臟的信噪比：

8.數(shù)據(jù)處理

所有實驗數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用SPSS 12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.大鼠肝臟中錳的含量

表2顯示了大鼠分別灌胃兩種錳溶液后4h、8h肝臟中的錳含量。由表可知，兩種錳溶液灌胃后在相同的時間點(diǎn)，四水合氯化錳組大鼠肝臟中錳含量較葡萄糖酸錳組高，并隨著時間的延長，兩組肝臟中錳含量均減低，但兩組之間錳含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 兩種錳溶液灌胃后4h和8h大鼠肝臟錳含量

2.MRI結(jié)果

圖1、2分別顯示了四水合氯化錳組和葡萄糖酸錳組大鼠灌胃前、灌胃后4h、8h肝臟MRI掃描圖像；表3、4分別顯示了四水合氯化錳組和葡萄糖酸錳組大鼠灌胃前、灌胃后4h、8h 肝臟信噪比、信號增強(qiáng)百分率和時間的關(guān)系。

表3 各時間點(diǎn)大鼠肝臟T1 信噪比

表4 各時間點(diǎn)大鼠肝臟T1 信號增加百分率

結(jié)合圖表結(jié)果可知，大鼠分別灌胃兩種錳溶液后，在相同的時間點(diǎn)，四水合氯化錳組大鼠肝臟的信號強(qiáng)度高于葡萄糖酸錳組，隨著時間的延長，四水合氯化錳組大鼠肝臟的信號強(qiáng)度逐漸減弱，而葡萄糖酸錳組大鼠肝臟的信號強(qiáng)度逐漸增高。其中，灌胃后4h兩組間T1信噪比和信號增加百分率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

配置相同摩爾濃度的四水合氯化錳溶液和葡萄糖酸錳溶液，將兩種溶液分別裝在5mL 注射器中，等距離放置在線圈里，進(jìn)行磁共振T1WI掃描。圖3顯示了兩種溶液的MRI掃描圖像。在相同錳摩爾濃度（0.55μmol／mL）的情況下，四水合氯化錳溶液的信號強(qiáng)度（138.65±1.88）高于葡萄糖酸錳溶液（132.65±2.81），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.0434）。

討 論

目前全球廣泛使用含釓磁共振對比劑，由于其會引起一種罕見但極其嚴(yán)重的疾病-腎源性系統(tǒng)纖維化，美國FDA 于2007年發(fā)布警告，要求修改含釓對比劑的說明書，以盡量減少使用該類藥物［9］。而另一類順磁性元素錳為人體必需微量元素，Mn2＋最外層軌道上具有5個不成對的電子，能縮短水質(zhì)子T1值，導(dǎo)致T1弛豫時間縮短，和釓具備相似的增強(qiáng)作用，成為繼釓之后一種很有前景的磁共振對比劑［10］。

圖1 氯化錳灌胃前和灌胃后大鼠肝臟磁共振圖像。a）基線掃描圖像；b）氯化錳灌胃后4h圖像；c）氯化錳灌胃后8h圖像。圖2 葡萄糖酸錳灌胃前和灌胃后大鼠肝臟磁共振圖像。a）基線掃描圖像；b）葡萄糖酸錳灌胃后4h圖像；c）葡萄糖酸錳灌胃后8h圖像。

圖3 同摩爾濃度氯化錳和葡萄糖酸錳溶液的磁共振圖像。1，2，3 葡萄糖酸錳溶液；4，5，6 氯化錳溶液。

錳福地吡三鈉注射液是世界上第一種肝細(xì)胞特異性錳類磁共振對比劑，已在臨床使用多年［11］，然而其緩慢推注的給藥方式一方面增加了額外的費(fèi)用和時間，另一方面使全身大部分臟器暴露在高濃度的Mn2＋環(huán)境中，容易產(chǎn)生副作用，如臉色潮紅、惡心、嘔吐等［12］?？诜o藥一方面通過肝臟首過效應(yīng)減少了錳的毒性，另一方面使Mn2＋蓄積在肝臟，經(jīng)過膽汁排泄，因此口服錳對比劑是一種安全有效的肝膽磁共振對比劑，目前正處于研究階段［13］。

錳經(jīng)腸道吸收后主要和a2巨球蛋白結(jié)合，通過肝門靜脈進(jìn)入肝臟，被肝細(xì)胞攝?。?4］。一些促吸收劑如維生素C、D3、丙氨酸等可以促進(jìn)錳在腸道的吸收，從而增強(qiáng)肝臟T1WI圖像信號［15］。

葡萄糖酸錳是一種營養(yǎng)強(qiáng)化劑，人體吸收率高，廣泛應(yīng)用于食品、保健品、嬰幼兒配方食品中補(bǔ)充礦物質(zhì)錳。結(jié)合它的安全性和吸收性，本研究選用葡萄糖酸錳作為一種口服錳對比劑和CMC-001的成像成分氯化錳從磁共振成像效果和肝臟的錳含量兩方面進(jìn)行研究，從本組實驗結(jié)果可見，口服氯化錳后，肝臟中的錳含量和磁共振增強(qiáng)效果呈正相關(guān)，即肝臟錳含量越高，磁共振增強(qiáng)效果越明顯；而口服葡萄糖酸錳后，肝臟錳含量最高時（即灌胃后4h），磁共振強(qiáng)化效果反而最低。對此，本研究配制了相同摩爾濃度的葡萄糖酸錳和氯化錳溶液，濃度均為0.55μmol／mL（即兩種錳溶液灌胃后4h大鼠肝臟中錳的平均含量），比較了兩種溶液的T1WI圖像，結(jié)果表明，氯化錳溶液的T1信號強(qiáng)度高于葡萄糖酸錳溶液（P＜0.05），說明相同摩爾濃度的錳溶液T1信號強(qiáng)度可能和錳的存在形式有關(guān)，溶液中離子形式的氯化錳T1增強(qiáng)效果高于螯合物形式的葡萄糖酸錳。

結(jié)合前面的整體實驗，灌胃兩種錳溶液后4h，四水合氯化錳組大鼠肝臟錳含量略高于葡萄糖酸錳組（P＞0.05），但磁共振增強(qiáng)效果前者明顯高于后者（P＜0.01），這種整體和體外實驗的差異可能是由于體內(nèi)環(huán)境和體外環(huán)境不同、肝臟中錳的存在狀態(tài)不同所致。

無論從肝臟錳含量或磁共振增強(qiáng)效果來看，口服氯化錳皆優(yōu)于葡萄糖酸錳，說明氯化錳更適合作為肝臟磁共振口服錳對比劑。

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