瘤內(nèi)注射臭氧致兔VX2瘤組織超微結構改變的研究

魏 強， 方 亮， 楊繼金， 霍寧寧， 呂 虎， 熊源長， 江 旭， 李 慧

目前，醫(yī)用臭氧（O3）在國際上已廣泛用于創(chuàng)傷或褥瘡愈合、外周動脈包括心腦動脈阻塞性疾病、糖尿病足、口腔疾病、病毒性肝炎、化膿性膽管炎、類風濕性關節(jié)炎、關節(jié)疼痛等輔助治療，在我國尤其在椎間盤突出癥的治療上取得了非常明顯的療效［1-2］。1980 年，Sweet等［3］在《Science》雜志上報道了臭氧在體外具有抑制人類腫瘤細胞生長的作用，然而近30年來，臭氧在腫瘤治療方面的研究卻很少［4-7］，并且多為臭氧對機體免疫功能調節(jié)作用的研究［4，8-10］。2008年 Schulz等［5］報道，通過腹腔內(nèi)注射臭氧，可以使部分荷瘤新西蘭大白兔的VX2瘤完全消失，但這一結果遭到質疑［11］。 張學彬等［6］采用臭氧化碘油經(jīng)肝動脈灌注栓塞治療兔VX2瘤，取得了較好的療效。管京樂和汪蓓蓓［12］通過瘤內(nèi)直接注射不同濃度臭氧治療兔VX2瘤，也取得了一定的療效。本實驗旨在通過對兔VX2瘤內(nèi)直接注入不同濃度臭氧，觀察不同時間腫瘤組織超微結構的改變，以判斷不同濃度臭氧對腫瘤細胞的殺傷程度。

1 材料與方法

1.1 兔VX2瘤模型制作

取體重2.5～3 kg的新西蘭大白兔20只，雌雄不限，由第二軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院動物實驗中心提供。兔VX2瘤株由復旦大學附屬中山醫(yī)院介入放射科惠贈（種植成功的荷瘤大白兔）。以0.03 g/kg戊巴比妥耳緣靜脈麻醉成功后，將荷瘤兔仰臥縛于專用手術臺上，腹股溝處剪毛，安爾碘消毒后切開皮膚剝離腫瘤，取魚肉樣瘤組織置生理鹽水中洗滌2次，剪碎并制成1 mm大小瘤塊，接種于實驗兔后腿內(nèi)側肌肉內(nèi)，2周后進行實驗。

1.2 實驗分組及取材

20只兔共分4組，對照組2只，T20（20%臭氧）、T40（40%臭氧）和 T60組（60%臭氧）各 6 只，其中對照組及各治療組取2只兔在實驗完成后即刻取材。方法：按前述靜脈麻醉、消毒，直視下切開瘤區(qū)皮膚，用游標卡尺測量腫瘤長短經(jīng)，按照公式V=1/2a×b2計算腫瘤體積［6］，并按腫瘤體積 2倍量不同濃度的O2/O3混合氣體用注射器直接注入瘤體內(nèi)，為減少對腫瘤組織的擠壓而引起超微結構改變，即刻處死取材的實驗兔均沿腫瘤長徑單次穿刺注射，對照組兔僅穿刺腫瘤而不注射氣體，沿針道切開腫瘤，取針道周圍的瘤組織，置于放有4℃專用固定液（2.5%戊二醛）的硬紙板上，切成0.5 mm大小的組織塊，并置于固定液內(nèi)固定，冷藏備用。T20、T40、T60組各剩余4只兔按腫瘤體積2倍量直視下用注射器多點穿刺注射不同濃度的O2/O3混合氣體，以盡量使臭氧彌散到全部腫瘤組織，然后縫合皮膚、消毒，再放入籠內(nèi)飼養(yǎng)，分別于術后第4、8天各處死2只，按前述方法取材、固定保存。臭氧發(fā)生器由德國Humares公司制備。

1.3 制片及電鏡觀察

將冷藏固定2 h以上的標本用緩沖液漂洗后置1% 四氧化鋨中固定2 h，再次漂洗，逐級脫水后，包埋于Epon812中，常規(guī)聚合、切片、鈾鉛染色，置銅網(wǎng)上用Hitachi76透射電鏡觀察，放大倍數(shù)7 500～25 000。

2 結果

電鏡觀察可見對照組細胞核、細胞膜完整，線粒體較小且少、密度增高，內(nèi)質網(wǎng)尚完整（圖1），部分腫瘤細胞退行性變、壞死。腫瘤內(nèi)的小血管完整。與對照組相比，T20組注射臭氧后即刻可見腫瘤細胞有輕微損傷，表現(xiàn)為線粒體輕微嵴溶解，少許線粒體呈球狀腫脹，內(nèi)質網(wǎng)擴張，部分核周間隙增寬（圖2）。類似改變可以延續(xù)至術后第4、8天，但總體改變較輕微，細胞間隙正常。T40組注射臭氧后即刻可見腫瘤細胞有明顯損傷改變，表現(xiàn)為線粒體明顯腫脹，內(nèi)質網(wǎng)擴張，細胞核腫脹，核周間隙增寬，部分細胞膜崩裂（圖3），組織結構崩解。血管內(nèi)皮細胞異染色質少。術后第4天，可見大片壞死，腫瘤細胞膜不完整，溶酶體線粒體形成（呈新月形黑顆粒）或線粒體溶解，內(nèi)質網(wǎng)擴張，部分胞質溶解，細胞核不規(guī)則，核周間隙擴張（圖4）。術后第8天，仍可看到細胞間隙明顯增寬，內(nèi)質網(wǎng)擴張，線粒體密度增高、形狀不規(guī)則，提示損傷已部分恢復。T60組注射臭氧后即刻也可見腫瘤細胞有明顯的損傷改變，表現(xiàn)為線粒體密度增高，內(nèi)質網(wǎng)擴張，細胞核腫脹，細胞間隙明顯增寬，部分細胞崩解。第4天，組織溶解，細胞分辨不清，可見白細胞浸潤（比T40組更明顯），炎細胞內(nèi)可見嗜酸、嗜堿顆粒（圖5）。瘤周血管內(nèi)皮細胞外膜分離，胞質內(nèi)見空泡變（圖6）。第8天，仍然可見大片組織崩解，細胞較分散，線粒體呈球狀腫脹，崩解細胞及相對正常細胞溶酶體內(nèi)有高密度影，內(nèi)質網(wǎng)明顯擴張。

圖1 對照組細胞核、細胞膜完整，線粒體較小且少、密度增高，內(nèi)質網(wǎng)尚完整

圖2 T20組注射后即刻少許線粒體呈球狀腫脹，內(nèi)質網(wǎng)擴張，部分核周間隙增寬

圖3 T40組注射后即刻線粒體明顯腫脹，內(nèi)質網(wǎng)擴張，細胞核腫脹，核周間隙增寬，細胞膜崩裂

圖4 T40組注射后第4天，腫瘤細胞膜不完整，溶酶體線粒體形成（黑顆粒），部分胞質溶解，細胞核不規(guī)則，核周間隙擴張

圖5 T60組注射后第4天，組織溶解，腫瘤細胞分辨不清，可見白細胞浸潤

圖6 T60組注射后第4天，瘤周血管內(nèi)皮細胞外膜分離，胞質內(nèi)見空泡變

3 討論

醫(yī)用臭氧在臨床上應用已有100多年，但在腫瘤防治方面的應用研究僅為40余年，且多以離體實驗為主，在體研究較少。臨床上也僅將臭氧作為輔助治療手段，從刺激相關細胞因子的合成與釋放、提高機體免疫功能角度，達到增強抗腫瘤的效果。事實上，臭氧作為強氧化劑，很容易游離出1個原子氧 （初生態(tài)氧），與有機分子反應產(chǎn)生自由基，而使細胞膜上不飽和脂肪酸發(fā)生脂質過氧化作用，生成的過氧化脂質及其分解產(chǎn)物丙二醛使蛋白質分子交聯(lián)，影響酶活性，對細胞膜和細胞器造成損傷，從而直接殺滅腫瘤細胞（與消毒殺滅微生物類似）。目前，有關醫(yī)用臭氧對髓核組織超微結構的影響已有報道［13］，但對其直接作用于腫瘤組織造成其損傷的形態(tài)學改變尚少見報道。

從本研究可見，臭氧對腫瘤細胞具有即刻的損傷、殺滅作用，并且隨著濃度的提高而增強。20%臭氧對腫瘤細胞只是造成了比較輕微的損傷，線粒體輕微嵴溶解，少許呈球狀腫脹，內(nèi)質網(wǎng)擴張，部分核周間隙增寬，并未見大片腫瘤壞死，而40%的臭氧則直接對腫瘤細胞產(chǎn)生了明顯的損傷，可見線粒體明顯腫脹，內(nèi)質網(wǎng)擴張，細胞核腫脹，核周間隙增寬，部分細胞膜崩裂，組織結構崩解。術后第4天可見腫瘤細胞膜不完整，溶酶體線粒體形成或線粒體溶解，內(nèi)質網(wǎng)擴張，部分胞質溶解，細胞核不規(guī)則，核周間隙擴張，術后第8天仍有類似改變，但逐漸恢復。60%的臭氧對腫瘤造成的損傷較40%更明顯，壞死區(qū)周圍的炎細胞浸潤也更明顯。以上不同濃度的臭氧對腫瘤細胞超微結構的影響，在術后第8天仍然可見，但與第4天相比已有所減輕，提示正在恢復。除了腫瘤細胞本身外，腫瘤組織內(nèi)血管內(nèi)皮細胞也有損傷，表現(xiàn)為胞核內(nèi)異染色質減少、胞質內(nèi)空泡形成及細胞外膜分離，這意味著腫瘤內(nèi)微循環(huán)會發(fā)生障礙，從而影響腫瘤的營養(yǎng)供應及代謝產(chǎn)物的排出，增加腫瘤組織的壞死。

綜上所述，單純從兔VX2瘤內(nèi)注射不同濃度臭氧后腫瘤細胞超微結構的改變來看，40%～60%臭氧都可以起到很好的治療作用，但綜合考慮安全性和治療效果，可能40%臭氧更好一些，因為在我們以往的肝臟動物實驗中，觀察到在注射高濃度的臭氧時，偶有突然死亡案例發(fā)生。另外，如果應用于臨床，肯定需要多次、重復治療，而治療間隔以4～8 d為宜。

［1］ 陳 輝，許 華，熊源長.醫(yī)用臭氧研究進展［J］.國際麻醉學與復蘇雜志，2009，30：258-261.

［2］ 高宗根，殷世武，項廷淼，等.臭氧聯(lián)合膠原酶注射與單純臭氧治療腰椎間盤突出癥的療效觀察 ［J］.介入放射學雜志，2011，20：42-44.

［3］ Sweet F， Kao MS， Lee SC， et al.Ozone selectively inhibits growth of human cancer cells ［J］.Science， 1980， 209： 931-933.

［4］ Witschi H， Wilson DW， Plopper CG.Modulation of N-nitrosodiethylamine-induced hamster lung tumors by ozone［J］.Toxicology，1993，77：193-202.

［5］ Schulz S， H?ussler U， Mandic R， et al.Treatment with ozone/oxygen-pneumoperitoneum results in complete remission of rabbit squamous cell carcinomas［J］.Int J Cancer， 2008， 122： 2360-2367.

［6］ 張學彬，花迎雪，仇曉霞，等.肝動脈臭氧化碘油栓塞治療兔VX2肝癌的初步研究 ［J］.介入放射學雜志，2012，21：760-764.

［7］ Selvendiran K， Kuppusamy ML， Ahmed S，et al.Oxygenation inhibits ovarian tumor growth by downregulating STAT3 and cyclin-D1 expressions ［J］.Cancer Biol Ther， 2010， 10： 386-390.

［8］ Cannizzaro A，Verga Falzacappa CV，Martinelli M，et al.O（2/3）exposure inhibits cell progression affecting cyclin B1/cdk1 activity in SK-N-SH while induces apoptosis in SK-N-DZ neuroblastoma cells［J］.J Cell Physiol， 2007， 213： 115-125.

［9］ Enzelsberger H， Metka M， Salzer H.Effect of a parenteral ozone-oxygen mixture on the concentration of immunoglobulins（IgA，IgG，IgM），of vitamin A and lysozyme activity in patients with cervical Cancer ［J］.Geburtshilfe Frauenheilkd， 1987， 47：343-345.

［10］ Bocci VA.Scientific and medical aspects of ozone therapy.State of the art［J］.Arch Med Res， 2006， 37： 425-435.

［11］ Bocci V.Does ozone really “cure” cancer？ ［J］.Int J Cancer，2008，123：1222.

［12］管京樂，汪蓓蓓.經(jīng)皮穿刺瘤內(nèi)注射醫(yī)用臭氧治療兔VX2移植瘤實驗［J］.安徽醫(yī)科大學學報， 2010， 45： 777-779.

［13］俞志堅，何曉峰，陳 勇，等.臭氧對髓核超微結構的影響［J］.介入放射學雜志， 2001， 10： 161-163.