腦絡(luò)欣通及其拆方對腦缺血再灌注大鼠NGF、PI3K、Akt以及Bad蛋白表達的影響

郜 巒，王 鍵*，厙 宇，胡建鵬，何 玲，唐 巍

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽合肥 230038;2.中華中醫(yī)藥學(xué)會，北京 100029)

中風(fēng)病以其高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率、高致殘率、高死亡率的四高特點，成為世界上第二位最常見的死亡原因，也是主要的致殘原因［1］。而缺血性卒中最為多見，約占卒中的80%，因此一直得到臨床和科研工作者的關(guān)注。目前越來越多的研究表明，中醫(yī)藥防治本病正在得到國內(nèi)外醫(yī)學(xué)界的重視［2］。已有的研究證實，PI3K-Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，是一條重要的細胞存活信號通路。因此，本研究以PI3K-Akt通路為切入點，在既往工作基礎(chǔ)上，繼續(xù)使用線栓法制備局灶性腦缺血再灌注動物模型，動態(tài)觀察新安醫(yī)家王樂匋教授針對缺血性腦血管病的臨床驗方腦絡(luò)欣通及其拆方，對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠NGF、PI3K、Akt以及Bad蛋白的影響，探討其神經(jīng)保護機制。

1 材料

1.1 實驗動物 健康 SD雄性大鼠120只(安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供)，體質(zhì)量280～320 g，實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)觀察3 d。

1.2 藥物與試劑 藥物:(1)腦絡(luò)欣通組為黃芪30 g、川芎10 g、三七10 g、蜈蚣兩條等;(2)拆方益氣組為黃芪30 g;(3)拆方活血組為川芎10 g、三七10 g、蜈蚣兩條等。

試劑:NGF、PI3K、Akt、Bad試劑盒、DAB顯色劑等均購自武漢博士德生物科技有限公司。

1.3 主要儀器和設(shè)備 日本LKB超薄切片機(日本太陽株式會社產(chǎn)品)，OlympasPM—20型顯微照相設(shè)備(日本奧林巴斯光學(xué)株式會社產(chǎn)品)，日本Olympas BX—51光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯光學(xué)株式會社產(chǎn)品)，電熱恒溫箱HH.BII.600(上海躍進醫(yī)療器械廠)，CHR—Ⅲ雙極電凝器(上海Fisher實驗器材有限公司)，TB—718自動包埋機(泰維電子設(shè)備有限公司)，TK—218I恒溫攤片烤片機(泰維電子設(shè)備有限公司)，美國Image-proplus專業(yè)圖像分析軟件系統(tǒng)(美國Media Cybernetics公司)。

2 方法

2.1 分組方法 實驗動物隨機分為模型組、拆方益氣組、拆方活血組以及腦絡(luò)欣通組共4組，每組30只，3、7、14 d 3個不同時間點各10只。

2.2 模型制備方法 參考Longa法制作局灶性腦缺血再灌注動物模型［3-4］。簡要模型制作步驟如下:大鼠仰臥固定，10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，脫毛、消毒，暴露手術(shù)視野，分離頸總、頸外、頸內(nèi)動脈，電凝頸外動脈的分支(枕動脈、甲狀腺上動脈)，結(jié)扎頸內(nèi)動脈的分支翼腭動脈。結(jié)扎頸外動脈遠心端，用微型動脈夾夾閉頸總動脈和頸內(nèi)動脈，眼科剪在頸外動脈殘端作一“V”形切口，插入線栓感覺少許阻力為止(約18～20 mm)，縫合切口。缺血2 h后再灌注時，將線栓輕輕拔出約10 mm。

2.3 給藥方法 所有中藥藥物均購自安徽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，由安徽中醫(yī)學(xué)院中藥制劑室制備成湯劑，根據(jù)既往藥效學(xué)給藥經(jīng)驗［5］，腦絡(luò)欣通方、益氣方、活血方分別按 8.54、3.5、5.04 g/(kg·d)，早晚各1次灌胃。模型組予以等量生理鹽水灌胃。給藥時間分別為3、7 d和14 d。

2.4 取材方法 (1)在缺血2 h再灌注3、7、14 d的相應(yīng)時間位點，10%水合氯醛腹腔注射麻醉(按0.36 mL/100 g體質(zhì)量)大鼠。(2)動物打開胸腔，從右心耳部剪口，導(dǎo)管自左心室插至主動脈，注入37℃肝素化生理鹽水至右心房流出液變清亮為止，約200 mL左右。(3)注入4%多聚甲醛溶液250 mL進行內(nèi)固定，灌流30 min。(4)斷頭取腦，除去小腦和腦干，留存大腦，放入相同的固定液中固定1周。(5)脫水、透明、浸蠟，在視交叉前后連續(xù)制作腦部冠狀切片。

2.5 指標檢測方法 由專業(yè)人員按試劑盒說明書，使用免疫組化染色SABC法分別測定NGF、PI3K、Akt以及Bad指標。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 選擇大腦中動脈阻塞的同側(cè)額頂葉皮質(zhì)觀察，利用美國Image-proplus專業(yè)圖像分析軟件系統(tǒng)進行圖像分析，取平均吸收光密度的平均值。數(shù)據(jù)結(jié)果用()表示，用 SPSS 17.0 for Windows軟件分析處理。

3 結(jié)果

3.1 不同時間點腦絡(luò)欣通對PI3K、Akt的影響見表1。

實驗結(jié)果顯示，和模型組比較，腦缺血再灌注損傷發(fā)生后，腦絡(luò)欣通組在腦缺血再灌注3、7、14 d后，能夠明顯增加PI3K、Akt的表達(P＜0.01或P＜0.001)。在腦缺血再灌注14 d時，活血組PI3K、Akt的表達亦明顯增加(P＜0.01或P＜0.001)。組間比較顯示，腦缺血再灌注14 d時，腦絡(luò)欣通組PI3K、Akt的表達顯著高于益氣組和活血組(P＜0.01)。

3.2 不同時間點腦絡(luò)欣通對NGF及Bad表達的影響 見表2。

實驗結(jié)果表明，與模型組比較，3個中藥治療組在再灌注7 d時，NGF表達均有顯著升高(P＜0.05或P＜0.01)。而腦絡(luò)欣通組在再灌注14 d，NGF表達顯著增加(P＜0.01)。缺血再灌注14 d，與模型組相比，拆方活血組和腦絡(luò)欣通組的Bad蛋白表達均顯著降低(P＜0.05)。

表1 不同時間點腦絡(luò)欣通對PI3K、Akt的影響(，n=10)Tab.1 Influence on expression of PI3K and Akt at different time with Naoluo Xintong Decoction(，n=10)

表1 不同時間點腦絡(luò)欣通對PI3K、Akt的影響(，n=10)Tab.1 Influence on expression of PI3K and Akt at different time with Naoluo Xintong Decoction(，n=10)

注:與模型組比較，*P＜0.01，＊＊P＜0.001;和腦絡(luò)欣通組組間比較，#P＜0.01;##P＜0.001

PI3K Akt分組3 d 7 d 14 d 3 d 7 d 14 d模型組 0.51±0.14 0.51±0.14△ 0.57±0.12△0.34±0.04 0.38±0.08 0.38±0.06益氣組 0.65±0.25 0.57±0.10 0.57±0.15## 0.38±0.12## 0.40±0.15## 0.46±0.15##活血組 0.72±0.25 0.67±0.32 0.93±0.33*# 0.53±0.12# 0.56±0.15 0.85±0.14＊＊#腦絡(luò)欣通組 0.78±0.12* 0.87±0.21* 1.00±0.15＊＊ 0.73±0.12* 0.82±0.09＊＊ 1.08±0.13＊＊

表2 不同時間點腦絡(luò)欣通對NGF及Bad表達的影響(，n=10)Tab.2 Influence on expression of NGF and Bad at different time with Naoluo Xintong Decoction(，n=10)

表2 不同時間點腦絡(luò)欣通對NGF及Bad表達的影響(，n=10)Tab.2 Influence on expression of NGF and Bad at different time with Naoluo Xintong Decoction(，n=10)

注:和模型組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

NGF Bad分組3 d 7 d 14 d 3 d 7 d 14 d模型組 0.230±0.004 0.206±0.003 0.234±0.008 0.187±0.034 0.202±0.002 0.282±0.002益氣組 0.260±0.003 0.274±0.017* 0.250±0.024 0.176±0.002 0.198±0.017 0.212±0.002活血組 0.230±0.003 0.302±0.009＊＊ 0.245±0.036 0.172±0.003 0.173±0.004 0.183±0.004*腦絡(luò)欣通組 0.273±0.009 0.301±0.008＊＊ 0.306±0.004＊＊ 0.134±0.004 0.189±0.002 0.181±0.008*

4 討論

神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)作為最初被發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)營養(yǎng)因子，是神經(jīng)系統(tǒng)最重要的生物活性分子之一，能夠促進神經(jīng)元的發(fā)育和生存、促進軸突的生長以及突觸的重構(gòu)?，F(xiàn)有的研究從臨床、實驗角度，都表明局灶性腦缺血后NGF的表達增加，有利于受損神經(jīng)元的修復(fù)，在腦缺血損傷過程中發(fā)揮作用。中醫(yī)工作者在研究中也發(fā)現(xiàn)，益氣活血中藥以及針刺的腦保護作用機制也與調(diào)節(jié)大鼠腦組織NGF表達和保護梗死區(qū)神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)有關(guān)［6-7］。其作用機制，近年研究認為，NGF可能通過激活PI3K-Akt信號通路抑制細胞凋亡，發(fā)揮腦保護作用。如補陽還五湯可促進腦缺血后腦組織的NGF表達并上調(diào)其PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的表達，調(diào)控神經(jīng)細胞的凋亡，對腦缺血模型大鼠腦組織發(fā)揮積極保護作用［8］。

PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是重要的細胞存活信號通路［9］。磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidy1inosito1-3 kinase，PI3K)，主要由催化亞基P110和調(diào)節(jié)亞基P85組成，是一種細胞內(nèi)蛋白激酶，可被生長因子、細胞因子、激素等細胞外信號刺激激活。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，也叫蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)，是PI3K的主要下游信號分子?；罨腁kt通過磷酸化進一步激活或抑制其下游的靶蛋白，進而發(fā)揮其調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、遷移及能量代謝等作用［10］。越來越多的研究均證實，中醫(yī)藥通過PI3K/Akt信號通路的激活發(fā)揮其神經(jīng)保護作用［11］，近年來更有學(xué)者日漸重視其對神經(jīng)干細胞增殖、分化的作用［12］。

PI3K/Akt信號途徑激活后，可以經(jīng)由多種途徑促進細胞存活，而減少神經(jīng)細胞凋亡是公認的一個重要環(huán)節(jié)［13-14］。新近就有實驗觀察了葛根素的效應(yīng)機制，認為激活PI3K/Akt信號通路可能是葛根素減少神經(jīng)細胞凋亡、起到神經(jīng)保護作用的機制之一［15］。凋亡是一種受相關(guān)基因調(diào)控的自主性、程序性死亡過程。其中，B細胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2)是研究較多的與凋亡有關(guān)的基因。Bad蛋白也是Bcl-2家族中一員，因為可與Bcl-2和Bcl-xL結(jié)合形成異源二聚體，具有促進細胞凋亡作用，故名Bad(Bcl-xL/Bcl-2 associated death promoter)［16］。Bad 蛋白在多種細胞中表達，參與細胞凋亡的全過程，其在腦缺血損傷方面的研究日益受到重視［17-18］。研究認為PI3K/Akt通路的保護途徑之一就是通過磷酸化Bad，從而減少神經(jīng)元的凋亡，Bad蛋白有三個磷酸化的部位［19-20］。

“氣虛血瘀”是中風(fēng)病的主要病機特點，氣虛為本，血瘀為標。氣虛則無力行血而為瘀，瘀血阻滯腦之脈絡(luò)，上氣不足，腦脈氣血運行不暢，氣血無以濡養(yǎng)，溫煦元神，使腦髓失養(yǎng)，神明失用，而致“氣虛血瘀”之證。針對這一病機特點，治療理應(yīng)益氣活血，使氣盛而脈絡(luò)通利。研究中選用的藥物腦絡(luò)欣通，是新安王氏內(nèi)科代表醫(yī)家王樂匋教授針對缺血性腦血管病的臨床驗方，主要由黃芪、川芎、三七、蜈蚣等組成，益氣活血、熄風(fēng)通絡(luò)，臨床療效顯著。在既往的研究中，本課題組已探索建立起穩(wěn)定、可靠的大鼠腦缺血損傷動物模型制備方法，并從多角度探討了其多靶點多環(huán)節(jié)的作用機制。

本次研究在既往研究的基礎(chǔ)上，進一步闡明了腦絡(luò)欣通的神經(jīng)保護作用機制。研究提示，腦絡(luò)欣通能夠保護腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織，其作用機制可能與促進NGF表達，激活PI3K/Akt通路并降低Bad蛋白表達有關(guān)。研究結(jié)果表明，腦缺血再灌注損傷發(fā)生后，在腦缺血再灌注中晚期，益氣活血方藥腦絡(luò)欣通能夠明顯誘導(dǎo)NGF的表達，進而激活PI3K/Akt細胞存活信號通路，降低下游Bad蛋白的表達，抑制凋亡，從而起到神經(jīng)保護作用，在部分時段和指標上要優(yōu)于單純的益氣和活血方，體現(xiàn)了其組方的完備，揭示了其調(diào)控PI3K/Akt通路的作用機制，為腦絡(luò)欣通的臨床應(yīng)用和開發(fā)提供了理論依據(jù)。

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