利用6-磷酸-β-葡萄糖苷酶在低溫條件下獲得酶-底物復(fù)合物實(shí)際結(jié)構(gòu)的方法

王薇，劉一葦，李宏濱

中國科學(xué)院微生物研究所，北京 100101

準(zhǔn)確地把握生物大分子及其復(fù)合物的結(jié)構(gòu)是了解生命過程的基礎(chǔ)，對(duì)其三維結(jié)構(gòu)的解析，可給出大量的其本身及所屬體系的信息。該工作可大致分成以下4個(gè)環(huán)節(jié)：高純度大分子樣品的制備；晶體的獲得；結(jié)構(gòu)的解析；結(jié)構(gòu)信息指導(dǎo)下的生物學(xué)研究。在目前的技術(shù)條件下，樣品晶體的質(zhì)量是影響其結(jié)構(gòu)解析的主要原因[1-3]。影響生物大分子晶體及其復(fù)合物質(zhì)量的主要原因是分子的化學(xué)穩(wěn)定性及構(gòu)象一致性較差而得不到穩(wěn)定的復(fù)合物晶體。例如，在通常條件下，當(dāng)酶與底物發(fā)生反應(yīng)時(shí)，底物會(huì)被酶降解，所以不易清楚地看到底物和酶的結(jié)合情況。突變酶中關(guān)鍵基團(tuán)使酶失活以及選用底物類似物替代原有底物的的方法，經(jīng)常被用來捕捉酶和底物的結(jié)合，但由此方法獲得的結(jié)構(gòu)多為近似結(jié)構(gòu)。另外，在常溫條件下酶與底物的結(jié)合一般不太穩(wěn)定，這樣底物即便在失活酶中的位置也經(jīng)常不易確定。

我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)[4-7]：在低溫 (?20 )℃條件下，分子構(gòu)象的一致性、分子間結(jié)合的穩(wěn)定性都會(huì)大大改善，一般酶的生物活性也會(huì)大幅度降低。由此獲得的酶-底物復(fù)合物更為穩(wěn)定，得到的晶體結(jié)構(gòu)衍射數(shù)據(jù)更趨于復(fù)合物結(jié)合時(shí)的實(shí)際結(jié)構(gòu)[8-9]。More等的研究也發(fā)現(xiàn)[10]，當(dāng)溫度由70 ℃降到?20 ℃時(shí)，β-葡萄糖苷酶的活性由100%降到 0.01%，也就是說在?20 ℃條件下，該酶基本失活?；谏鲜隹紤]，我們提出了“酶晶體低溫抑活底物固定”方法。該方法是在低溫環(huán)境下浸泡底物，此時(shí)酶基本失去活性，底物不易降解，而酶和底物結(jié)合的穩(wěn)定性卻大大提高，平衡后迅速進(jìn)行液氮固定，首先，可以獲得真實(shí)的酶-底物復(fù)合物結(jié)構(gòu)；其次，可進(jìn)一步提高底物的占有率和空間穩(wěn)定性，提高底物電子密度的質(zhì)量。

為了進(jìn)行低溫浸泡試驗(yàn)[11]，我們選擇了 6-磷酸-β-葡萄糖苷酶 (BglA)。根據(jù)催化底物分解時(shí)是否需要輔因子，BglA分兩類：糖基水解酶家族1 (Glycoside hydrolase family 1，GH1)和糖基水解酶家族4 (Glycoside hydrolase family 4，GH4)。GH4的 6-磷酸-β-葡萄糖苷酶在催化底物分解時(shí)需要金屬離子 (Mn2+、Ni2+、Co2+或Fe2+)和NAD+的輔助，同時(shí)需要一個(gè)還原性環(huán)境[12-15]，而GH1的6-磷酸-β-葡萄糖苷酶則可以獨(dú)立完成催化作用[16-17]，其大小約50 kDa。BglA于1972年首次從產(chǎn)氣桿菌 Aerobacter aerogenes中被分離得到[18]，隨后1974年在大腸桿菌Escherichia coli中又再次被純化出來[19]。BglA能專一性地水解6-磷酸-β-葡萄糖苷鍵，可將底物對(duì)硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷-6-磷酸 (pNPβG6P)水解為對(duì)硝基苯酚和 6-磷酸-β-葡萄糖[20-21]。

1 材料與方法

1.1 材料

bglA基因 (EC31211186)由上海捷瑞生物工程有限公司合成；宿主桿菌主菌株 E. coli DH5α、E. coli BL21 (DE3)和載體 pET-28a由本室保存；SDS-PAGE低分子量標(biāo)準(zhǔn)購自中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所；His-TrapTMHP 5 mL購自于美國 GE公司；蛋白晶體篩選試劑 Crystal Screen HR2-110和 HR2-112購自美國 Hampton Research公司；BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購自美國 Pierce公司；底物 pNPβG6P 由美國 National Institutes of Health (NIH)的Dr. John Thompson提供。

1.2 BglA的表達(dá)

將構(gòu)建好的 pET-28a-bglA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E. coli BL21 (DE3)，轉(zhuǎn)化成功的單克隆菌株置于20 mL LB 培養(yǎng)基中 (卡那霉素 5 μg/mL)，過夜培養(yǎng)后接種于2 L LB搖瓶，37 ℃振蕩培養(yǎng)，當(dāng)OD600達(dá)到 0.6～0.8時(shí)，加入 IPTG至終濃度0.001 mol/L，37 ℃繼續(xù)振搖5 h，6 000 r/min離心10 min收集細(xì)菌。

1.3 BglA的提取與純化

收集的細(xì)菌用80 mL PBS (pH 7.4)重懸后，超聲波破碎裂菌，12 000 r/min離心10 min，收集上清。利用蠕動(dòng)泵將上清液與His-Trap HP鎳柱過夜結(jié)合。采用快速蛋白液相色譜法，以緩沖液 A (20 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L NaCl，pH 8.0)和緩沖液 B (20 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L NaCl，500 mmol/L 咪唑，pH 8.0)對(duì)結(jié)合有蛋白的鎳柱進(jìn)行梯度洗脫，并進(jìn)行蛋白峰收集及SDS-PAGE檢測(cè)。收集到的蛋白在超濾濃縮管中置換成分子篩緩沖液 (20 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L NaCl，pH 8.0)，經(jīng) Superdex 200凝膠層析柱進(jìn)一步純化，蛋白峰收集并再次進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。BCA蛋白濃度測(cè)定法測(cè)定蛋白濃度。

1.4 蛋白晶體的生長

蛋白晶體的培養(yǎng)采用懸滴式蒸氣擴(kuò)散法，篩選試劑來源于 Crystal Screen HR2-110和HR2-112試劑盒。將1 μL蛋白溶液與1 μL池液混勻，同200 μL的池液進(jìn)行氣相平衡，靜置于16 ℃環(huán)境生長。

1.5 常溫試驗(yàn)

首先，準(zhǔn)備晶體板，并制備防凍液。防凍液成分：1 μL 50% (V/V)甘油，2 μL 池液 (0.1 mol/L N-2-羥乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸鈉鹽 (HEPES sodium)，pH 7.5，10% (V/V)異丙醇和 20%聚乙二醇4 000 (Polyethylene glycol 4 000)(W/V))。制備好的防凍液放入晶體板。用尼龍環(huán)挑取BglA蛋白晶體，放入防凍液中，加入3 μL 20 mmol/L底物 pNPβG6P。用尼龍環(huán)挑出蛋白晶體與底物復(fù)合物，放入液氮固定。

1.6 低溫試驗(yàn)

準(zhǔn)備低溫晶體板，用水將含有甘油的紙條潤濕，再將坐滴孔內(nèi)加滿水，蓋上玻璃蓋，以保持環(huán)境的濕度；制備防凍液，成分為：1 μL 50%(V/V)甘油，2 μL 池液(0.1 mol/L N-2-羥乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸鈉鹽 (HEPES sodium)，pH 7.5，10% (V/V)異丙醇和 20%聚乙二醇 4 000(Polyethylene glycol 4 000)(W/V))。制備好的防凍液放入晶體板。之后用尼龍環(huán)挑取出BglA蛋白晶體，放入防凍液中，迅速置于?20 ℃低溫冰箱中。靜置 10 min后，迅速取出蛋白晶體板，快速加入3 μL 20 mmol/L底物pNPβG6P。再次將晶體板放回?20 ℃低溫冰箱中。靜置10 min后迅速取出晶體板，用尼龍環(huán)挑出蛋白晶體與底物復(fù)合物，放入液氮固定。

2 結(jié)果

2.1 BglA的表達(dá)與純化結(jié)果

為了有效地純化蛋白，在設(shè)計(jì) bglA重組序列時(shí)，在C末端多加了1段由6個(gè)組氨酸構(gòu)成的His-tag。攜帶重組質(zhì)粒 pET-28a-bglA的 E. coli BL21在37 ℃經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，表達(dá)大量可溶性BglA蛋白，分子量大小約50 kDa。

利用組氨酸標(biāo)簽和咪唑的相互作用，通過His-Trap層析柱梯度洗脫，在40 mmol/L咪唑濃度及 60 mmol/L濃度附近獲得濃度較高的蛋白(圖 1)。收集到的蛋白在超濾濃縮管中置換成分子篩緩沖液，經(jīng)Superdex 200凝膠層析柱，BglA進(jìn)一步被純化 (圖 2)，隨后用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定，蛋白濃度高達(dá)8 mg/mL。

圖1 BglA鎳柱親和層析之后電泳結(jié)果圖Fig. 1 SDS-PAGE analysis of BglA after purified with a His-Trap HP column. M: protein marker. The collected fractions of BglA corresponding to the SDS-PAGE lanes 1,2,3.

圖2 BglA凝膠過濾層析之后電泳結(jié)果圖Fig. 2 SDS-PAGE analysis of BglA after purified with a Superdex 200 10/300 column. M: protein marker. The collected fraction of BglA corresponding to the SDS-PAGE lane 1.

2.2 晶體生長結(jié)果

晶體的生長條件篩選選用Hampton Research的Crystal Screen的HR2-110和HR2-112試劑盒，共98個(gè)不同條件的池液，每個(gè)池液含有緩沖液，沉淀劑和鹽3類成分。觀察發(fā)現(xiàn)有幾個(gè)不同的條件均生長出了晶體，其中在池液成分為0.1 mol/L HEPES sodium (pH 7.5)、10% (V/V)2-propanol、20% (W/V)PEG 4 000的生長條件下，經(jīng)過2周的時(shí)間，生長出了能夠達(dá)到X射線衍射條件的晶體 (圖 3)。

2.3 數(shù)據(jù)收集、處理結(jié)果及底物電子密度圖

圖3 在某一條件下得到的蛋白晶體Fig. 3 Crystals of BglA. The crystals of BglA grown at 16 ℃, and the longest dimension of the crystals is 290 μm.

表1 BglA晶體衍射數(shù)據(jù)Table 1 Data collection and refinement statistics

在?20 ℃的低溫條件下，利用“酶晶體低溫抑活底物固定”方法，將BglA晶體與底物進(jìn)行浸泡，并用液氮固定，通過X射線進(jìn)行衍射數(shù)據(jù)收集并處理，獲得了完整的底物電子密度圖。BglA晶體衍射數(shù)據(jù)的空間群屬于P212121，最高分辨率為2 ?，結(jié)構(gòu)采用分子置換法解析。數(shù)據(jù)收集和優(yōu)化的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)如表1所示。在利用“酶晶體低溫抑活底物固定”方法進(jìn)行低溫試驗(yàn)前，我們選用前期生長良好的BglA晶體，使用常規(guī)方法，進(jìn)行了酶與底物浸泡的對(duì)比試驗(yàn)。所用晶體的空間群屬于I222，晶胞參數(shù)為a=69.441 ?，b=86.902 ?，c=161.765 ?，最高分辨率為 2.4 ?，結(jié)構(gòu)采用分子置換法解析。經(jīng)優(yōu)化處理后得到了水解底物的電子密度圖。通過對(duì)比的衍射電子密度圖顯示，底物pNPβG6P在經(jīng)低溫處理的BglA晶體結(jié)構(gòu)中有完整的電子密度；對(duì)于未經(jīng)低溫處理的BglA晶體，底物在相應(yīng)位置已經(jīng)被水解(圖 4)。

3 討論

3.1 低溫防凍劑配方的選擇

在利用“酶晶體低溫抑活底物固定”方法進(jìn)行低溫試驗(yàn)時(shí)，選用甘油作為主防凍劑，但當(dāng)用尼龍環(huán)挑出單顆晶體放入防凍劑之后，晶體出現(xiàn)了迅速融化的現(xiàn)象。之后，我們對(duì)此環(huán)節(jié)進(jìn)行改進(jìn)，嘗試放入多顆晶體，以使溶液達(dá)到飽和狀態(tài)。在放入第1顆晶體時(shí)，晶體依然很快融化；繼續(xù)放入第2顆，晶體只是部分開裂；放入第3顆晶體后，該晶體完好。另外，我們也嘗試將晶體加入不含甘油的池液，晶體并未開裂或融化，但經(jīng)過?20 ℃低溫處理后，再次觀察發(fā)現(xiàn)晶體部分開裂，用尼龍環(huán)挑晶體時(shí)出現(xiàn)了斷裂現(xiàn)象，說明此時(shí)的晶體脆性增強(qiáng)，防凍劑的保護(hù)不可或缺。因此，找到適合各種溫度的多體系低溫防凍劑配方，使晶體不易開裂并可以承受更深的低溫是我們需要進(jìn)一步解決的問題。

3.2 “酶晶體低溫抑活底物固定”方法對(duì)底物電子密度的影響

圖4 不同條件下獲得的底物電子密度圖Fig. 4 Comparison between the electron density of bound substrates from two methods. 2Fo-Fc electron density map is contoured at 1.0 σ, the left shows that the substrate was hyzrolyzed at normal temperature, the right shows that the electron-density of the substrate was intact at ?20 ℃.

本研究使用的“酶晶體低溫抑活底物固定”方法，是在?20 ℃條件下將 BglA晶體與pNPβG6P進(jìn)行浸泡，通過X射線收集衍射數(shù)據(jù)并處理，最終獲得了完整的底物電子密度圖。與常規(guī)方法相比較，使用的底物相同，但取得的效果卻差別明顯。我們認(rèn)為，用常規(guī)方法無法獲得完整的底物電子密度，因?yàn)橐话忝冈诔Ｒ?guī)溫度下都能夠迅速水解底物，而“酶晶體低溫抑活底物固定”方法是在保持天然結(jié)構(gòu)的狀態(tài)下，將酶活力降低到幾乎失活的水平，延緩底物的水解。另外在低溫狀態(tài)下，pNPβG6P的 β糖苷鍵的柔性會(huì)降低，使得硝基苯基團(tuán)的位置更固定，也有利于取得較好的電子密度。

3.3 低溫酶學(xué)及復(fù)合物中間態(tài)的進(jìn)一步研究

為了進(jìn)一步試驗(yàn)“酶晶體低溫抑活底物固定”方法在低溫酶學(xué)研究領(lǐng)域的普適性，在獲得了BglA與其底物復(fù)合物的實(shí)際結(jié)構(gòu)后，我們還利用本實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的酰亞胺酶 (Imidase)與其特異性底物進(jìn)行了浸泡試驗(yàn)，獲得了比較完整的底物電子密度圖。由于復(fù)合物晶體的衍射數(shù)據(jù)低于3 ?，我們正在進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化篩選，以期獲得優(yōu)于3 ?的數(shù)據(jù)結(jié)果，進(jìn)而得到理想的底物電子密度圖。另外，我們也正在選擇其他的酶與底物進(jìn)行低溫浸泡試驗(yàn)，進(jìn)一步擴(kuò)大復(fù)合物中間態(tài)的研究范圍。

3.4 低溫條件下的單晶生長

從“酶晶體低溫抑活底物固定法”自然派生出的一個(gè)思路便是研究深低溫條件下生物大分子單晶生長的技術(shù)。如前所述，在深低溫條件下生物大分子有著更好的化學(xué)穩(wěn)定性和構(gòu)象一致性，有望得到分辨率更高的晶體。目前，我們已經(jīng)利用溶菌酶在?20 ℃低溫環(huán)境下進(jìn)行晶體生長實(shí)驗(yàn)，以不同濃度 DMSO替代甘油作為主防凍劑進(jìn)行梯度試驗(yàn)，獲得了生長良好的晶體，并得到了較高分辨率的衍射數(shù)據(jù)。

[1]Heras B, Martin JL. Post-crystallization treatments for improving diffraction quality of protein crystals. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2005,61(9): 1173?1180.

[2]Abergel C. Spectacular improvement of X-ray diffraction through fast desiccation of protein crystals. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2004,60(8): 1413?1416.

[3]Su D, Lou ZY, Sun F, et al. Dodecamer structure of severe acute respiratory syndrome coronavirus nonstructural protein nsp10. J Virol, 2006, 80(16):7902?7908.

[4]Liu Y, Xiong Y, Naidenko OV, et al. The crystal structure of a TL/CD8αα complex at 2.1 ? resolution-implications for modulation of T cell activation and memory. Immunity, 2003, 18:205?215.

[5]Bowman GD, O'Donnell M, Kuriyan J. Structural analysis of a eukaryotic sliding DNA clamp-clamp loader complex. Nature, 2004, 429(6993):724?730.

[6]Mi Y, Wood G, Thoma L. Cryoprotection mechanisms of polyethylene glycols on lactate dehydrogenase during freeze-thawing. AAPS J,2004, 6(3): e22.

[7]Dobrianov I, Kriminski S, Caylor CL, et al.Dynamic response of tetragonal lysozyme crystals to changes in relative humidity: implications for post-growth crystal treatments. Acta Cryst Crystallogr D Biol Crystallogr, 2001, 57(1):61?68.

[8]Kuo A, Bowler MW, Zimmer J, et al. Increasing the diffraction limit and internal order of a membrane protein crystal by dehydration. J Struct Biol, 2003, 141: 97?102.

[9]Ellis MJ, Antonyuk S, Hasnain SS. Resolution improvement from `in situ annealing' of copper nitrite reductase crystals. Acta Cryst Crystallogr D Biol Crystallogr, 58: 456?458.

[10]More N, Daniel RM, Petach HH. The effect of low temperatures on enzyme activity. J Biochem, 1995,305(1): 17?20.

[11]Liu WD. Structural analysis of hydroxyquinol 1,2-dioxygenase from Pseudomonas putida DLL-E4 and crystallographic study on two pesticide degradation related enzymes [D].Nanjing: Nanjing Agricultural University, 2010 (in Chinese).劉衛(wèi)東. Pseudomonas putida DLL-E4 1,2,4-苯三酚1,2-雙加氧酶的晶體結(jié)構(gòu)及兩種農(nóng)藥降解相關(guān)酶的蛋白質(zhì)晶體學(xué)研究[D]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2010.

[12]Raasch C, Streit W, Schanzer J, et al. Thermotoga maritima AglA, an extremely thermostable NAD+-,Mn2+-, and thiol-dependent alpha-glucosidase.Extremophiles, 2000, 4(4): 189?200.

[13]Robrish SA, Fales HM, Gentry-Weeks C, et al.Phosphoenolpyruvate-dependent maltose:phosphotransferase activity in Fusobacterium mortiferum ATCC 25557: specificity,inducibility, and product analysis. J Bacteriol,1994, 176(11): 3250?3256.

[14]Suresh C, Rus'd AA, Kitaoka M, et al. Evidence that the putative alpha-glucosidase of Thermotoga maritima MSB8 is a pNP alpha-D-glucuronopyranoside hydrolyzing alpha-glucuronidase.FEBS Lett, 2002, 517(1/3): 159?162.

[15]Thompson J, Gentry-Weeks CR, Nguyen NY, et al.Purification from Fusobacterium mortiferum ATCC 25557 of a 6-phosphoryl-O-alpha-D-glucopyranosyl: 6-phosphoglucohydrolase that hydrolyzes maltose 6-phosphate and related phospho-alpha-D-glucosides. J Bacteriol, 1995,177(9): 2505?2512.

[16]Thompson J, Robrish SA, Bouma CL, et al.Phospho-beta-glucosidase from Fusobacterium mortiferum : purification, cloning, and inactivation by 6-phosphoglucono-delta-lactone. J Bacteriol,1997, 179(5): 1636?1645.

[17]Thompson J, Ruvinov SB, Freedberg DI, et al.Cellobiose-6-phosphate hydrolase (CelF)of Escherichia coli : characterization and assignment to the unusual family 4 of glycosylhydrolases. J Bacteriol, 1999, 181(23): 7339?7345.

[18]Palmer RE, Anderson RL. Cellobiose metabolism in Aerobacter aerogenes 3. Cleavage of cellobiose monophosphate by a phospho-β-glucosidase. J Biol Chem, 1972, 247(11): 3420?3423.

[19]Wilson G, Fox CF. The beta-glucoside system of Escherichia coli IV. Purification and properties of phospho-beta-glucosidases A and B. J Biol Chem,1974, 249(17): 5586?5598.

[20]Yin J, Liu YW, Li J, et al. Cloning, expression,crystallization and characterization of a novel 6-phospho-β-glucosidase from Thermoanaerobacter tengcongensis. Chin J Biochem Mol Biol, 2008,24(10): 916?924 (in Chinese).尹捷, 劉一葦, 李潔, 等. 騰沖嗜熱厭氧桿菌 6-磷酸-β-葡萄糖苷酶的表達(dá)與結(jié)晶及其功能鑒定.生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào), 2008, 24(10): 916?924.

[21]Totir M, Echols N, Nanao M, et al. Macro-to-micro structural proteomics: native source proteins for high-throughput crystallization. PLoS ONE, 2012,7(2): e32498.