葉酸受體在食管癌細(xì)胞中的表達(dá)及其與食管癌生物學(xué)行為的關(guān)系

李秋元 林曉斌 陳杰武 郭光華

AKT又稱蛋白激酶(PKB), 其活性形式為磷酸化蛋白激酶B(P-Akt), 位于多種基因信號(hào)通路的核心部位, PI3K/AKT信號(hào)通路廣泛存在于細(xì)胞中, 是參與細(xì)胞生長(zhǎng)﹑增殖﹑凋亡﹑分化調(diào)節(jié)的重要信號(hào)通路, 研究發(fā)現(xiàn), FR在人食管癌細(xì)胞中異常高表達(dá)［1］, 而hnRNP-E1作為FR的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子, 在小鼠的乳腺上皮癌中, hnRNP-E1與PI3K/AKT信號(hào)通路存在一定的關(guān)系, 但在人食管癌細(xì)胞中是否存在關(guān)聯(lián)目前尚未報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過PI3K/AKT信號(hào)通路靶向抑制劑LY294002對(duì)人食管癌EC109細(xì)胞作用, 以探討PI3K/AKT信號(hào)通路與FR表達(dá)之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 人食管癌細(xì)胞系EC109由汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng), LY294002﹑胰蛋白酶(江蘇碧云天)﹑胎牛血清(杭州四季青), RPMI1640(無葉酸)(GIBCO公司), 二甲基亞砜﹑四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)﹑AKT,P-Akt抗體 (CST)﹑hnRNP-E1(Santa Cruz), FR 抗體 (ENZO)。

1.2 方法

1.2.1 LY294002工作液的配置及細(xì)胞培養(yǎng) 將20 μL(10 mg/ml)LY294002 溶液加入到 630 μLPBS 中 , 稀釋成 1000 μmol/L 的溶液, 置于-20℃冰箱中儲(chǔ)存, 使用前再稀釋成指定濃度, 將食管癌細(xì)胞EC109加入含10%胎牛血清的無葉酸RPMI1640培養(yǎng)基中, 置于37℃, 5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng), 每2～3 d傳代一次。

1.2.2 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)活性 實(shí)驗(yàn)分組：空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組, 實(shí)驗(yàn)組分為終濃度10﹑20﹑30﹑40﹑50 μmol/l LY294002組。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的食管癌細(xì)胞EC109, 用0.25%胰酶消化, 離心收集后用無葉酸RPMI1640培養(yǎng)基配制成5×104個(gè)細(xì)胞/ml的懸液, 接種于96孔板, 每孔細(xì)胞數(shù)約為6000,置于37℃, 5%CO2飽和濕度條件下過夜。實(shí)驗(yàn)組分別給予終濃度為 10﹑20﹑30﹑40﹑50 μmol/L LY294002, 總體積200 μL。每組5個(gè)復(fù)孔, 分別培養(yǎng)8 h﹑12 h﹑24 h后,每孔分別加入5 mg/ml的MTT10 μl繼續(xù)培養(yǎng)4 h后去上清液, 再加入DMSO150 μL,水平震蕩20 min。用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)490 m處測(cè)細(xì)胞增殖的抑制率：細(xì)胞抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組平均OD490值/對(duì)照組平均OD490值)×100%

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)食管癌細(xì)胞中FR的表達(dá) 收集經(jīng)10﹑20﹑30﹑40﹑50 μmol/L LY294002 作用 24h 后的實(shí)驗(yàn)組﹑空白對(duì)照組和同型對(duì)照組細(xì)胞, 用PBS洗滌3次,棄上清,各實(shí)驗(yàn)組分別加入1 ml FR-FITC, 空白對(duì)照組加入1mlPBS,同型對(duì)照組加入1ml IgG-FITC(0.25 μg/ml), 37℃避光孵育1 h后, 用PBS洗滌2次, 棄上清, 各組加入500 μlPBS懸浮細(xì)胞,上機(jī)檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LY294002對(duì)食管癌細(xì)胞EC109的生長(zhǎng)抑制效應(yīng) MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示, 隨著時(shí)間延長(zhǎng), 濃度加大, 細(xì)胞增殖抑制率呈現(xiàn)時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系, 濃度-效應(yīng)關(guān)系, 各濃度組分別與其對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P＜0.05, 表1)

表1 LY294002對(duì)EC109細(xì)胞的增殖抑制率(±s, %)

表1 LY294002對(duì)EC109細(xì)胞的增殖抑制率(±s, %)

*P＜0.05(藥物作用組VS對(duì)照組)

LY294002濃度（μmol/l）8h 12h 24h OD值 抑制率（%） OD值 抑制率（%） OD值 抑制率（%）空白對(duì)照組 0.59±0.01 0 0.64±0.04 0 0.96±0.04 0 10 0.55±0.02* 8.11 0.59±0.02* 8.02 0.86±0.02* 10.41 20 0.54±0.01* 9.72 0.55±0.03* 13.81 0.80±0.08* 16.55 30 0.45±0.01* 23.89 0.48±0.01* 25.95 0.73±0.03* 28.72 40 0.43±0.01* 28.49 0.45±0.01* 29.63 0.67±0.06* 30.47 50 0.38±0.01* 36.45 0.40±0.01* 38.36 0.58±0.07* 39.16

3 討論

PI3K/AKT處于眾信號(hào)通路的中心地位, 其重要性日益受到關(guān)注, 研究表明多種腫瘤組織中存在AKT基因的過度表達(dá)和活化［2］, 而在食管癌組織細(xì)胞中也呈現(xiàn)出高表達(dá)狀態(tài)［3］。本實(shí)驗(yàn)通過使用PI3K/AKT 信號(hào)通路特異性抑制劑LY294002作用于人食管癌EC109細(xì)胞, 采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖抑制率, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 隨著藥物作用濃度的增大和作用時(shí)間的延長(zhǎng), 增殖抑制率逐漸降低, 存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。其機(jī)制可能是LY294002通過抑制AKT的磷酸化水平, 使得細(xì)胞周期蛋白降解增加﹑表達(dá)減少, 促使細(xì)胞停滯于G0/G1期, 細(xì)胞增殖明顯受到抑制, 死亡細(xì)胞增多。

葉酸, 又名維生素B11, 是一種水溶性維生素, 在體內(nèi)參與一碳單位的轉(zhuǎn)移反應(yīng)和嘌呤﹑胸腺嘧啶的合成, 葉酸缺乏與DNA損傷﹑修復(fù)和甲基化異常密切相關(guān), 而后者是腫瘤發(fā)生的重要環(huán)節(jié), hnRNP E1可調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性, 同時(shí)參與成熟mRNA的轉(zhuǎn)運(yùn), 定位［4］。本實(shí)驗(yàn)用LY294002作用食管癌細(xì)胞24h后, 用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)FR的表達(dá)水平。結(jié)果顯示FR的表達(dá)較對(duì)照組明顯降低, 提示葉酸受體的表達(dá)與PI3K/AKT通路存在一定的聯(lián)系, 其中, 可能與抑制PI3K/AKT通路, 使得細(xì)胞增殖減少, 從而所需的葉酸受體減少有關(guān), 另一方面也可能是通過抑制通路PI3K/AKT,影響了hnRNP-E1的磷酸化水平, 而hnRNP-E1做為FR轉(zhuǎn)錄的調(diào)控因子, 可進(jìn)一步影響FR的轉(zhuǎn)錄, 最終使得FR的表達(dá)減少。

綜上所述, 阻斷PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可以明顯抑制人食管癌EC109細(xì)胞的增殖, 同時(shí)影響FR的表達(dá), 但FR是否可反作用通過PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作用食管癌細(xì)胞的生物學(xué)行為有待進(jìn)一步研究。

［1］ 劉璇芝, 陳素鉆, 俞晶, 荊緒斌, 李秋元, 郭光華.葉酸受體α在食管癌及癌旁組織表達(dá)和患者飲食習(xí)慣的關(guān)系.廣東醫(yī)學(xué),2008,26(3):456-458.

［2］ Mariette C, Finzi L, Fabre S, et al Factors predictive of complete,resection of operable esophageal cancer: a prospective study.Ann Thorac Surg, 2003, 75(6): 1720-6.

［3］ 曹偉, 于在誠(chéng), 劉芝華, 駱愛萍.磷酸化AKT在食管鱗癌中的表達(dá)及其臨床意義.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2008,45(1):24-4

［4］ Parkin DM, Bray F, Ferlay J, et al.Global Cancer Statistics, 2002.CA Cancer J Clin,2005,55(2):74-108.