丙型肝炎病毒抗體檢測(cè)的幾種方法的臨床應(yīng)用

朱瑞敏 孫來芬 馬冬玲

HCV是一種有包膜的RNA病毒，其潛伏期約6～7周，50%～80%的患者可發(fā)展成慢性丙型肝炎，20%的慢性丙肝患者如發(fā)展為肝硬化，一旦到肝硬化階段，每年約有1% ～7%可進(jìn)展為原發(fā)性肝細(xì)胞癌［1］。我國(guó)約有10%肝癌患者血中存在抗-HCV。其嚴(yán)重危害著人們的身體健康，本文對(duì)幾種檢測(cè)丙肝技術(shù)的相關(guān)性的應(yīng)用加以闡述。

1 具體方法

1.1 實(shí)驗(yàn)室有關(guān)丙型肝炎檢測(cè)的流程:

1.1.1 樣品-→初篩試驗(yàn)-→陰性-→報(bào)告抗-HCV陰性。

1.1.2 樣品-→初篩試驗(yàn)-→陽性反應(yīng)-→用原在試劑雙孔或原有試劑加另一種不同原理(或廠家)試劑做復(fù)檢試驗(yàn)-→均陽性反應(yīng)或一陰一陽-→做補(bǔ)充試驗(yàn)

1.1.3 樣品-→初篩試驗(yàn)-→陽性反應(yīng)-→用原在試劑雙孔或原有試劑加另一種不同原理(或廠家)試劑做復(fù)檢試驗(yàn)-→均陰性反應(yīng)-→報(bào)告抗-HCV陰性

1.1.4 補(bǔ)充試驗(yàn):①ELISA法測(cè)定吸光度值〉5倍cutoff值時(shí)-→報(bào)告抗-HCV陽性;②免疫印跡試驗(yàn)陰性-→報(bào)告抗-HCV陰性;③免疫印跡試驗(yàn)陽性-→報(bào)告抗-HCV陽性;④免疫印跡試驗(yàn)不確定-→報(bào)告抗-HCV不確定，建議定期復(fù)查。

2 其具體操作原理及判斷標(biāo)準(zhǔn)如下所述

2.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)我實(shí)驗(yàn)室用的是上海科華試劑公司生產(chǎn)的試劑，其檢測(cè)原理是:所用包被抗原為合成多肽原和基因工程抗原(包括HCV病毒結(jié)構(gòu)區(qū)核心抗原和非結(jié)構(gòu)區(qū)抗原)。待測(cè)樣本加入已包被抗原的反應(yīng)孔內(nèi)孵育，若標(biāo)本中含有抗-HCV抗體，則該抗體與微孔內(nèi)抗原形成抗原抗體復(fù)合物，加入酶結(jié)合物，經(jīng)孵育后，酶結(jié)合物連接至抗原抗體復(fù)合物上，在TMB底物參與反應(yīng)的情況下，產(chǎn)生顯色反應(yīng)。其cottoff值=陰性對(duì)照平均值+陽性對(duì)照平均值*10%(若陰性對(duì)照平均值小于0按0計(jì)算，陽性對(duì)照平均值大于2.5按2.5計(jì)算)。當(dāng)所檢測(cè)樣品吸光度值小于cottoff值時(shí)，我們判定為陰性。當(dāng)所檢測(cè)樣品吸光度值大于cottoff值時(shí)，分三個(gè)區(qū)間判斷a:吸光度值大于cottoff值5倍時(shí)判斷為陽性。b:吸光度值介于cottoff值3.8～5倍之間時(shí)，做膠體金試驗(yàn)或化學(xué)發(fā)光試驗(yàn)如果陽性則判斷為陽性，如果膠體金試驗(yàn)或化學(xué)發(fā)光試驗(yàn)為陰性則做確診實(shí)驗(yàn)，結(jié)果判定以確診實(shí)驗(yàn)為準(zhǔn)。C:吸光度值介于cottoff值1～3.8倍之間時(shí)的結(jié)果判定以確診實(shí)驗(yàn)為準(zhǔn)。

2.2 化學(xué)發(fā)光試驗(yàn)我實(shí)驗(yàn)室用雅培公司生產(chǎn)的試劑，機(jī)器為IS2000R。其檢驗(yàn)原理為:丙型肝炎病毒采用免疫檢測(cè)，定性測(cè)定人血清和血漿中的HCV抗體，技術(shù)是化學(xué)發(fā)光微粒子免疫檢測(cè)法與靈活的檢測(cè)方案的結(jié)合。第一步，將樣本HCV重組抗原包被的順磁微粒子和項(xiàng)目稀釋液混合。樣本中的HCV抗體結(jié)合到HCV包被的微粒子上。沖洗后進(jìn)入第二步，加入啶酯標(biāo)記的抗-人的結(jié)合物。再次沖洗后，身反應(yīng)混合物中加入預(yù)激發(fā)興高采烈和激發(fā)液。通過相對(duì)發(fā)光單信對(duì)產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)進(jìn)行測(cè)量。樣本中的HCV抗體含量與ARCHITECT光學(xué)系統(tǒng)檢測(cè)到時(shí)的RLU成正比。其參考范圍為0-1。當(dāng)結(jié)果小于1時(shí)判斷為陰性。當(dāng)結(jié)果介于等于1～5之間時(shí)，做確診實(shí)驗(yàn)，結(jié)果判定以確診實(shí)驗(yàn)為準(zhǔn)。當(dāng)結(jié)果大于等于5時(shí)，報(bào)告為陽性。

2.3 膠體金法快速試驗(yàn):1)免疫滲濾試驗(yàn):斑點(diǎn)免疫膠體金快速試驗(yàn)以硝酸纖維膜為載體，HCV抗原點(diǎn)狀固定上膜上，加待檢樣品。陽性結(jié)果在膜上抗原部信顯示出有色斑點(diǎn)。反應(yīng)時(shí)間在10 min以內(nèi)。有效試驗(yàn)的質(zhì)控點(diǎn)必須顯色。2)免疫層析試驗(yàn):以硝酸纖維膜的載體，HCV抗原線狀固定在膜上，待檢樣品沿著固相載體遷移，陽性結(jié)果在膜上抗原部位顯示出有色條帶。有效試驗(yàn)的質(zhì)控線必須顯色。我實(shí)驗(yàn)室用此法僅限于做胃腸鏡或支氣管鏡檢查的初篩試驗(yàn)，還用于如上所述酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)結(jié)果在3.8-5倍cottoff值之間的復(fù)查的附助檢查。

3 檢測(cè)結(jié)果的解釋［2］

見表1。

表1

［1］ 中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì).丙型肝炎防治指南.中華肝臟病雜志，2004，4.

［2］ 中國(guó)疾病預(yù)防控制中心.丙型肝炎病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)規(guī)范，2011.