HPLC法測(cè)定龍膽瀉肝丸中梔子苷的含量

姚鴻雁 席璐

龍膽瀉肝湯方劑出自清·汪昂《醫(yī)方集解》，是由龍膽、梔子、黃芩、澤瀉等十味藥制成，為古今臨床常用方劑，具有清肝膽，利濕熱等功效，主治肝膽實(shí)火上擾［1］，對(duì)頭暈頭痛、耳鳴耳聾、眼底出血、淋證陰癢、赤白帶下、不孕癥、泄瀉、帶狀皰疹等各病，臨床驗(yàn)之確有療效［2］。該方的特點(diǎn)為瀉中有補(bǔ)，降中寓升，去邪而不傷正，瀉火而不伐胃［3］。方中龍膽為君，梔子、黃芩為臣。本方臨床應(yīng)用廣，療效卓著，且劑型較多，而文獻(xiàn)中的含量測(cè)定多是測(cè)定其君藥成分，如《中國(guó)藥典》2005版一部收載了龍膽瀉肝水丸中的龍膽苦苷的含量，由于梔子也是本方的主要藥物，且梔子苷為其主要的藥理活性成分之一，本研究建立的方法可測(cè)定梔子苷的含量，方法可靠、快速，可較好地用于控制該類(lèi)制劑的質(zhì)量，為院內(nèi)制劑質(zhì)量控制提供可靠的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Shimadzu LC-10ATvp型高效液相色譜儀(自動(dòng)進(jìn)樣器SIL-20A，輸液泵LC-10ATvp，檢測(cè)器SPD-M10AVP)，工作站CLASS-VP V6.14 SP1;賽多利CP225D電子分析天平(德國(guó));AEL-200電子分析天平(湘儀天平儀器設(shè)備有限公司);AP-01P型真空泵(天津奧特賽恩斯儀器有限公司);色譜柱:Agilent XDB-C18 柱(4.6×150 mm 5μm)。

1.2 試藥 梔子苷對(duì)照品 (110749-200410，中國(guó)藥品生物制品檢定所)，甲醇為色譜純，水為純化水，龍膽瀉肝丸 (自制:批號(hào) SY1001、SY1002、SY1003)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為 Agilent C18柱(5 m，4.6 mm×250 mm);柱溫為40℃;流動(dòng)相為甲醇-水(23∶77);體積流量:1.0 ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng):238nm;進(jìn)樣量:5 l。

2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取梔子苷對(duì)照品適量，加甲醇制成濃度為0.0831 mg/ml的對(duì)照品溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備 參考藥典中的方法［4］。因藥典方法中規(guī)定超聲提取的條件為功率250W、頻率為33kHz、超聲45 min，但實(shí)驗(yàn)室超聲設(shè)備的頻率與之不同，故對(duì)超聲時(shí)間做一考察。分別選擇超聲35 min、45 min、55 min所制得樣品進(jìn)行測(cè)定指標(biāo)成分峰面積，分別測(cè)定3次，結(jié)果顯示，峰面積均數(shù)隨超聲時(shí)間延長(zhǎng)而增大，而通過(guò)t檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，超聲45 min效果較35 min有極顯著性差異(P＜0.01)，而超聲55 min峰面積均數(shù)雖較45 min大，但差異沒(méi)有顯著性(P＞0.05)。為節(jié)省分析時(shí)間，故選擇超聲45 min。

取龍膽瀉肝丸，研細(xì)，取約1 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 ml，密塞，稱(chēng)定重量，超聲處理(功率250W，頻率50KHz)45 min，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性樣品溶液的制備 參考藥典中的方法，按處方量取除梔子外所有藥物，并按供試品溶液制備方法操作，得陰性對(duì)照溶液，進(jìn)樣 5 μl。

2.5 專(zhuān)屬性檢查 以丸劑供試品和陰性對(duì)照溶液的HPLC圖譜對(duì)比可以看到(見(jiàn)圖1)，陰性對(duì)照?qǐng)D譜中梔子苷峰對(duì)應(yīng)位置處無(wú)干擾。

2.6 線(xiàn)性相關(guān)考察 精密量取梔子苷對(duì)照品溶液1、3、5、7、9 ml分別置10 ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻。分別精密吸取對(duì)照品溶液5 l，依次注入液相色譜儀中，按上述色譜條件測(cè)定，記錄梔子苷峰面積，以梔子苷峰面積對(duì)梔子苷量進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得線(xiàn)性回歸方程:Y=1636850x-8178.6，r=0.9998，表明梔子苷在0.0831～0.7479 g/ml時(shí)，質(zhì)量濃度與峰面積積分值呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

圖1 龍膽瀉肝丸中梔子苷的HPLC圖譜

2.7 精密度試驗(yàn) 取梔子苷對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，每次 5 l。結(jié)果峰面積分別為 677891、677968、672102、672987、674067、676024，RSD 為 0.37%。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別在樣品制備0 h、4 h、8 h、12 h、24 h后測(cè)定。測(cè)得峰面積的RSD為0.82%，(n=5)?？梢?jiàn)供試品溶液中梔子苷在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取供試品溶液，按含量測(cè)定方法重復(fù)測(cè)定6 次。峰面積分別為:372065、372463、374512、376328、373407、376694，RSD 為 0.52%。

2.10 加樣回收試驗(yàn) 采用加樣回收試驗(yàn)。取本品，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入梔子苷對(duì)照品溶液20 ml，再精密加入甲醇5 ml，密塞，稱(chēng)定重量，超聲處理(功率250W，頻率50KHz)45 min，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液5 ml，用甲醇稀釋至10 ml。進(jìn)樣10 l測(cè)定含量。共操作6次。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.11 樣品測(cè)定 取3批龍膽瀉肝丸按“供試品溶液的制備”項(xiàng)制備供試品溶液，依法測(cè)定。結(jié)果 0.3424%、0.3395%、0.3411%，RSD為0.43%。

3 討論

3.1 測(cè)定波長(zhǎng)選擇。梔子苷為環(huán)烯醚萜苷，其紫外最大吸收波長(zhǎng)為238nm，因此選擇238nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

3.2 流動(dòng)相選擇。藥典記載梔子中梔子苷的含量測(cè)定中使用了乙腈-水(15∶85)系統(tǒng)，實(shí)際操作中對(duì)該系統(tǒng)考察發(fā)現(xiàn)，其基線(xiàn)不易走平，峰形和基線(xiàn)穩(wěn)定性較差。用甲醇-水(23∶77)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其平衡時(shí)間較短，基線(xiàn)平穩(wěn)，保留時(shí)間適中，流動(dòng)相價(jià)格總體上亦較乙腈系統(tǒng)低，且在適當(dāng)?shù)谋Ａ魰r(shí)間內(nèi)，隨著流動(dòng)相中有機(jī)相的比例減小，龍膽苦苷和梔子苷的分離度有所減?。?］。梔子苷和龍膽苦苷均為其主要的藥理活性成分之一，且二者均為環(huán)烯醚萜苷，因此，參照藥典方法最終確定使用正文中的流動(dòng)相。

3.3 梔子為龍膽瀉肝湯方中的臣藥，測(cè)定其中的梔子苷含量具有較重要的代表意義。且復(fù)方中藥多個(gè)指標(biāo)的測(cè)定不但可以減少分析誤差，更重要的是它可以直接反映藥品的質(zhì)量。該法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，適用于龍膽瀉肝制劑的質(zhì)量控制，為院內(nèi)制劑質(zhì)量控制提供適合可靠的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

［1］ 段富津.方劑學(xué).上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1995:82-84.

［2］ 孫文學(xué).龍膽瀉肝湯在臨床上的應(yīng)用.第十五屆中韓中醫(yī)藥學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集，2011.

［3］ 謝鳴.方劑學(xué).北京:人民衛(wèi)生出版社，2002:124-126.

［4］ 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典2005年版一部.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:藥典173.

［5］ 劉瑞新.HPLC同時(shí)測(cè)定龍膽瀉肝丸中龍膽苦苷和梔子苷的含量.中成藥，2007，29(8):1170-1173.