高效液相法測定市售腌制蔬菜商品中8 種生物胺的含量*

邢茜，陳浩，曲桂芹，殷麗君

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京，100083)

生物胺(biogenic amines，BAs)是一類主要由氨基酸脫羧或醛和酮氨基化形成的具有生物活性的小分子量含氮化合物［1］，作為生物體內(nèi)正常的生理活性物質(zhì)，在機體細胞活動中發(fā)揮著重要作用［2］:可以調(diào)節(jié)生長、增強代謝活力、控制血壓、消除自由基等。酪胺和組胺在人和動物激素介導(dǎo)、多巴胺和羥色胺在中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳遞方面也具有重要作用。但當(dāng)人體攝入過量的生物胺時，會造成人神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)損傷，可導(dǎo)致血壓升高和頭痛，有時主要是胃腸功能紊亂，造成腹部痙攣、腹瀉和嘔吐等［3］。

生物胺廣泛存在于各類食品中，在富含蛋白質(zhì)和氨基酸的食品及發(fā)酵食品中相對更多。食品中主要存在的生物胺包括色胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、β-苯乙胺、亞精胺及精胺［4］。大多食品本身含有低濃度的生物胺，但食品中的生物胺主要是由氨基酸經(jīng)微生物產(chǎn)脫羧酶脫羧形成，而且高濃度的生物胺往往出現(xiàn)在發(fā)酵食品中，因為發(fā)酵食品更容易污染具有高活性氨基酸脫羧酶的微生物［5］。生物胺的測定方法有多種，如氣相色譜法(GC)［6］、毛細管電泳法(CE)［7］、離子色譜法(IC)［8］、薄層色譜法(TLC)［9］、生物電化學(xué)法［10］和高效液相色譜法(HPLC)［11］，其中以HPLC法最為常用。生物胺分子中缺乏發(fā)色基團，為了提高檢測的靈敏度，需要采用柱前或柱后衍生技術(shù)，以紫外或熒光檢測器進行檢測。由于食品的基質(zhì)復(fù)雜，有必要研究各類食品中生物胺的檢測方法。目前食品中生物胺的檢測研究主要是針對魚及魚肉制品、酒類、香腸和奶酪制品等［12－16］。

腌制菜是我國的傳統(tǒng)佐餐食品，在我國，無論東西南北都有各種具有地方特色的蔬菜腌制品，諸如揚川醬菜、四川榨菜、云南大頭菜以及京津一帶的京冬菜均為其中名品［17］。其制作原理主要是利用食鹽溶液的高滲透作用抑制腐敗菌的生長，使蔬菜上附生的乳酸菌在厭氧情況下得到優(yōu)勢生長，產(chǎn)生乳酸等風(fēng)味物質(zhì)［18］。發(fā)酵過程可使蔬菜中含有的蛋白質(zhì)和氨基酸進一步分解，存在生成生物胺的可能性，而目前關(guān)于市售腌制蔬菜中生物胺的研究尚未見報道。本課題建立了高效液相色譜測定腌制蔬菜中8 種生物胺含量的方法并測定了不同市售樣品中的生物胺含量，為食品中生物胺的安全風(fēng)險評估以及對不同人群進行飲食配餐提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品和主要試劑

HCl、氨水、丙酮、NaOH、NaHCO3，均為分析純;乙腈，色譜級(CNW Technologies GmbH);純凈水，杭州娃哈哈集團有限公司。

13 種市售包裝腌制蔬菜商品，購于北京某超市。

1.1.2 標準品

色胺(98%)，Sigma-Aldrich INC;苯乙胺(97.5%)，腐胺(99%)，尸胺(99%)，Dr Ehrenstorfer GmbH;鹽酸組胺(99%)，TCI 東京化成工業(yè)株式會社;酪胺(98%)，TCI(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司;亞精胺(99%)、精胺(97%)，Alfa Aesar 公司;丹磺酰氯(98%)，ACROS ORGANICS 公司。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備

真空冷凍干燥機(LCJ-10 )，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠;均質(zhì)機(IKALABORTECHNIK，T25 basic)，冷凍離心機(GL-20G-Ⅱ)，上海安亭科學(xué)儀器廠;高效液相色譜儀(SHIMADZU，10A)，C18色譜柱，SHISEIDO.CO. Ltd。

1.2 實驗方法

1.2.1 高效液相色譜條件

色譜柱為C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相A 為水，流動相B 為乙腈，采用梯度洗脫，洗脫程序見表1。流速為0.8 mL/min，紫外檢測波長為254 nm，進樣量20 μL。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

1.2.2 樣品的衍生

衍生過程參考Ben［12］等人和丁卓平［19］的方法，并稍作修改。1 mL 生物胺標準混合溶液，加入200 μL 2 mol/L NaOH 使之呈堿性，然后加入300 μL 飽和NaHCO3溶液進行緩沖，再加入1 mL 丹磺酰氯溶液(10 mg/mL 丙酮)，在黑暗中置于40℃水浴45 min，取出后加入100 μL 氨水避光放置30 min 中斷反應(yīng)并去除多余的丹磺酰氯。最后用乙腈調(diào)整到5 mL 并用0.45 μm 的有機濾膜過濾后待測。

1.2.3 標準溶液的制備與樣品預(yù)處理

準確稱取8 種生物胺標準品各50 mg(精確到0.000 1 g)，用0.1 mol/L HCl 溶解，定容至50 mL，制成標準品儲備液(1 mg/mL)備用。分別取以上標準品儲備液10 mL 混合后定容到100 mL，再用0.1 mol/L HCl 稀釋成終濃度分別為100，50，25，10，5，1 μg /mL 的混合標準溶液，制成標準溶液于4℃避光保存。然后按1.2.2 方法衍生處理和分析，并制作標準曲線。

將腌制蔬菜樣品分別裝入編號后的封口袋中，再同時將13 個樣品放入真空冷凍干燥機凍干24h，取出后用粉碎機磨成粉末。取1 g 樣品凍干粉于50 mL離心管中，加入10 mL 0.1mol/L HCl，高速(16 000 r/min)均質(zhì)2 min，4℃15 800 g×g 離心20 min，取上清液，過濾，取濾液1 mL 按1.2.2 中的方法衍生待測，作2 個平行。

1.2.4 檢出限( LOD) 和定量限( LOQ)

取1.2.3 中所得樣品濾液衍生物100 μL 用乙腈適當(dāng)稀釋，以信噪比(S/N)大于3 作為檢出限的判斷標準，以信噪比大于10 作為定量限的判斷標準。

1.2.5 精密度、回收率及重現(xiàn)性的測定

取濃度為10 μg/mL 的衍生標準混合樣品平行進樣7 次，根據(jù)計算結(jié)果的相對標準偏差RSD測定儀器的精密度。同一測定樣品連續(xù)提取測定7 次，根據(jù)計算結(jié)果的相對標準偏差RSD測定方法的精密度。

取一號樣品凍干粉，按照1.2.3 方法處理樣品，取樣品濾液加入8 種生物胺標準溶液，使之相當(dāng)于各添加2.5、5、10 μg/mL 的含量，樣品基質(zhì)及各加標水平樣品各進行3 次平行測定，計算3 個加標水平的平均回收率和相對標準差。

2 結(jié)果分析與討論

2.1 生物胺標品與實際樣品圖譜及曲線回歸方程

結(jié)果顯示使用該流動相可在前10 min 內(nèi)流出全部溶劑峰，25 min 左右試樣中生物胺可被全部洗脫。8 種生物胺能在30 min 有效分離，且峰形良好。通過單個生物胺標準樣品的高效液相檢測，得到8 種生物胺的保留時間，色胺(Try)為(10.330 ± 0.035 min)，苯乙胺(Phe)為(12.275 ±0.041 min)，腐胺(Put)為［(12.915 ± 0.031)min］，尸胺(Cad)為［(13.860 ±0.027)min］，組胺(His)為(14.732 ±0.027 min)，酪胺(Tyr)為［(18.615 ±0.031)min］，亞精胺(Spd)為(19.415 ±0.026 min)，精胺(Spm)為(24.232 ±0.058 min)，(見圖1)。從實際樣品色譜圖(圖2)可看出各生物胺衍生物峰形對稱，雜質(zhì)干擾少，因此該流動相是可行的。

8 種生物胺標準曲線的回歸方程及檢出限、定量限見表2，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.998，說明峰面積與生物胺含量之間具有顯著的線性相關(guān)性。定量限在0.61 ～2.40 μg/g 之間，該方法靈敏度高，可以滿足樣品測定的要求。

圖1 生物胺混合標準HPLC 色譜圖Fig.1 The HPLC chromatogram for a standard mixture of biogenic amines

圖2 腌制蔬菜樣品生物胺HPLC 色譜圖Fig.2 The HPLC chromatogram for biogenic amines of a pickle sample

表2 標準曲線的回歸方程及其他線性實驗結(jié)果Table 2 Result of regression equations and other linear experiment

2.2 精密度、加標回收率及重現(xiàn)性

在對10 μg/mL 生物胺混合標準樣品連續(xù)進樣7次的試驗中，色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺和精胺測定結(jié)果的RSD值分別為:0.321%、0.587%、0.509%、0.629%、0.140%、0.102%、0.292%、0.357%，RSD≤2%。對同一樣品的7 次HPLC 檢測試驗中，各生物胺RSD值分別為:8.46%、4.52%、3.39%、2.02%、5.51%、4.51%、6.12%、6.59%，RSD≤10%。結(jié)果顯示，儀器及方法的精密度良好。各添加水平的平均回收率和相對標準偏差如表3 所示，8 種生物胺的回收率為89.19% ～103.02%，RSD在2.67% ～7.52%，因此用該方法來檢測腌制蔬菜制品中生物胺的含量是可靠的。

表3 回收率試驗結(jié)果(n=3)Table 3 Result of recovery experiment

2.3 樣品中生物胺含量

不同樣品中生物胺含量見表4。通過HPLC 測定樣品中生物胺，發(fā)現(xiàn)樣品中生物胺總量范圍在39.38 ～628.82 mg/kg。不同樣品中生物胺種類及總含量存在顯著差異(P＜0.05)，2、3、10、11 號樣品生物胺含量較高，1、5、9 含量較少，其余樣品生物胺含量很少。其中腐胺、尸胺、組胺、酪胺4 種含量占到總量的88.94%，95.12%，93.95%，78.58%，84.86%，65.41 %，77.17%，77.75%，76.49%，92.29%，96.05%，63.98%，65.42%。組胺中毒后主要損傷的器官是血管和平滑肌，導(dǎo)致頭痛、支氣管痙攣、心跳加快等疾病，酪胺和色胺會引起高血壓，也會導(dǎo)致頭痛、嘔吐、瞳孔擴張，腐胺和尸胺的毒性相對較小，主要會造成低血壓、心動過緩、破傷風(fēng)、四肢麻痹等，它們在抑制單胺氧化酶的藥物、酒精和胃腸道疾病等增效因素存在的情況下攝入會對人體健康帶來嚴重危害［4］。我國GB2733 －2005 規(guī)定鮐魚中組胺含量應(yīng)低于1 000 mg/kg，其他魚類中組胺含量應(yīng)低于300 mg/kg;FDA 規(guī)定水產(chǎn)品中組胺含量低于50 mg/kg，食品中組胺含量應(yīng)低于500 mg/kg，酪胺含量低于100 mg/kg;歐盟規(guī)定鯖科魚中組胺含量應(yīng)低于100 mg/kg，其他食品中組胺含量不得超過100 mg/kg，酪胺不得超過100 ～800 mg/kg［20］，而每餐攝入40 mg生物胺就被認為是潛在的危險。因此各樣品均在安全標準范圍內(nèi)，但某些樣品不宜大量或長期食用。

Kalac［21－22］報道，泡菜作為一種發(fā)酵蔬菜，發(fā)酵過程由于微生物作用產(chǎn)生了許多生物胺，尤其含大量的腐胺和酪胺，經(jīng)過6 個月貯藏可達到200 ～300 mg/kg。蔬菜在腌制加工時引入各類微生物，原料中蛋白質(zhì)會在蛋白酶的作用下分解為多肽，多肽在各種肽酶的作用下分解成游離氨基酸，脫羧酶在適宜條件下使氨基酸脫羧生成生物胺［5］。本文研究的腌制蔬菜在加工中存在不同程度的發(fā)酵過程，樣品產(chǎn)地包括四川、北京、福建、浙江和重慶的不同廠家，產(chǎn)品原料涉及青菜頭、芽菜、根用芥菜、蘿卜、竹筍、雪里蕻，結(jié)果中生物胺含量的顯著差異可能與原料特性、配料組成、加工工藝及加工環(huán)境有關(guān)。

表4 樣品中生物胺含量(mg/kg)Table 4 Contents of biogenic amines in samples

3 結(jié)論

以丹磺酰氯為衍生劑，建立了腌制蔬菜中生物胺含量的柱前衍生高效液相測定方法。使用該方法8種生物胺分離效果好，經(jīng)方法學(xué)驗證，各生物胺標準品衍生物線性關(guān)系良好，回收率在89.19% ～103.02%之間，精密度、重復(fù)性均小于10%。結(jié)果表明生物胺的HPLC 檢測方法對腌制蔬菜中生物胺的定性和定量檢測快捷、可靠。

測定市售腌制榨菜類生物胺含量，結(jié)果表明不同樣品中生物胺種類及生物胺含量不同。因此需進一步研究不同的原料產(chǎn)地、發(fā)酵工藝、貯存條件和貯存時間等因素對腌制蔬菜制品中生物胺合成的影響，為確保腌制蔬菜制品的食用安全性提供理論依據(jù)。

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