馬齒莧多糖提取工藝優(yōu)選及活性初篩*

米熱班古·木太力甫，敬思群

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊，830046)

馬齒莧(Portulace deraceaL．)屬馬齒莧科馬齒莧屬1 年生肉質(zhì)草本植物［1－3］。馬齒莧全草含有L-去甲腎上腺素、多巴明以及少量多巴、脂肪酸、氨基酸類、維生素、黃酮類和多糖［4－6］。具有明顯的抗癌抗衰老、治療糖尿病、降血脂、預(yù)防冠心病、高血壓、肥胖癥、抑制腫瘤細(xì)胞生長及延長細(xì)胞壽命的作用［7－9］。研究表明，馬齒莧多糖是馬齒莧的主要功能成分之一［10－11］。文中對馬齒莧多糖的提取工藝及其抗氧化活性進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑與儀器

新鮮馬齒莧，新疆源森農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司提供;纖維素酶(40 000 U/g)，購于杰諾生物科技有限公司;三氯甲烷、正丁醇、丙酮、濃H2SO4、KI、苯酚、Na2HPO4、檸檬酸等化學(xué)試劑，均為分析純;AL104 分析天平，Mettler-Toledo Group;FW-100 粉碎機，北京市永光明醫(yī)療儀器廠;RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠;AnkeTDL-5-A 離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠FZ102;SIM 真空冷凍干燥設(shè)備，德國西門子公司;KQ-250DE 型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司;722S 型分光光度計，上海安亭科學(xué)儀器廠;VER-TEX70 型紅外光譜分析儀，BRUKER 公司。

1.2 馬齒莧多糖提取工藝流程

馬齒莧→清洗、自然干燥→粉碎過80 目篩→石油醚脫脂→加酶超聲輔助提取→離心取上清液→Sevage 法除蛋白→減壓濃縮→乙醇沉淀→過濾洗滌→冷凍干燥→馬齒莧多糖干粉

1.2.1 操作要點

新鮮馬齒莧原料經(jīng)挑選清洗、自然干燥后用萬能粉碎機粉粹并過80 目篩得馬齒莧粉待用。稱取6 g馬齒莧粉置于索氏提取器中，加入石油乙醚(60 ～90℃)200 mL，90℃回流脫脂7h;脫脂之后加入體積分?jǐn)?shù)80%乙醇，90℃回流2 次(每次2 h)，除去單糖、多酚、低聚糖和皂苷等小分子物質(zhì);乙醇揮發(fā)后，在添加一定量的纖維素酶時按照不同的浸提時間、浸提溫度和超聲功率進(jìn)行馬齒莧多糖提取。將得到的馬齒莧多糖溶液經(jīng)離心取上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空濃縮，加95%的乙醇析出多糖，沉淀物用蒸餾水復(fù)溶后再加95%的乙醇醇析，反復(fù)3 次，將沉淀用無水乙醇洗滌，真空干燥，得馬齒莧水溶性多糖。采用Sevage法［12］去除提取馬齒莧多糖中的蛋白質(zhì)，少量蒸餾水溶解馬齒莧多糖，按粗多糖溶液與三氯甲烷-正丁醇(體積比4∶1)混合液以體積比5∶1 混合，充分振蕩30 min 靜止分層，4 200 r/min 離心15 min，將中間液面白色物質(zhì)和下層的有機溶劑除去。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將上清液減壓濃縮至原液的1/4 ～1/5，向濃縮液加入4倍體積的無水乙醇析出多糖，在室內(nèi)放置過夜，然后5 000 r/min 離心15 min，收集沉淀，沉淀物用蒸餾水復(fù)溶后再加體積分?jǐn)?shù)95%乙醇醇析，反復(fù)3 次，將沉淀物再分別以無水乙醇、丙酮、乙醚回流洗滌，得棕黃色粗提物經(jīng)冷凍干燥后即得馬齒莧粗多糖。

1.3 馬齒莧多糖提取得率的計算

多糖含量測定采用硫酸-苯酚比色法，其標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法參考文獻(xiàn)［13］，得線性回歸方程為:Y=0.064X－0.001(Y:吸光度，X:糖含量)。r=0.996 5，線性范圍0.0 ～1.0 mg/mL。

1.3.1 馬齒莧多糖提取得率的計算

W/% =m1/m2×100，式中:W為馬齒莧多糖的提取得率，%;m1為提取得到的馬齒莧多糖質(zhì)量，g;m2為原料質(zhì)量，g。

1.4 不同單因素對加酶超聲輔助提取馬齒莧多糖的影響

將用2.5%纖維素酶酶解后的提取液經(jīng)滅酶后，在超聲功率為70 W，溫度為60℃的條件下，分別提取10、15、20、25 和30 min，研究超聲時間對馬齒莧多糖提取率的影響;將用2.5%纖維素酶酶解后的提取液經(jīng)滅酶后，在超聲功率為70 W，時間為20 min 時，分別在30、40、50、60 和70℃的溫度條件下提取，研究超聲溫度對馬齒莧多糖提取率的影響;將用2.5%纖維素酶酶解后的提取液經(jīng)滅酶后，在超聲時間為20 min，溫度為60℃條件下，提取的超聲功率分別為50、60、70、80 和90 W，研究超聲功率對馬齒莧多糖提取率的影響。

1.5 馬齒莧多糖的光譜分析［14］

分別取2 mg 加酶超聲處理和傳統(tǒng)水提醇沉處理的2 組馬齒莧多糖干燥樣品，與200 mg 干燥的KBr粉末在紅外燈下于瑪瑙缽中輕輕研磨均勻，研磨均勻的粉末經(jīng)壓片機壓成薄片后即可上機測定。測定條件:在500 ～4 000 cm－1內(nèi)，掃描累積次數(shù)64 次，分辨率4.0 cm－1，采集樣品的紅外光譜譜圖。

1.6 多糖抗氧化活性的測定

1.6.1 總抗氧化能力的測定

操作方法按總抗氧化能力(T-AOC)測定試劑盒說明書進(jìn)行。

總抗氧化能力(U/mg 樣液)= (ODU － ODC)/0.01 ÷30 ×N÷Cprot，式中:ODU 為測定管吸光度值;ODC 為對照管吸光度值;N 為反應(yīng)體系稀釋倍數(shù)(反應(yīng)液總體積/取樣體積);Cprot 為待測樣液濃度(mg/mL)。

1.6.2 對·OH 的清除作用［15］

按艾百拉·熱合曼等的方法進(jìn)行測定。

1.6.3 馬齒莧多糖對DPPH 的清除率

將多糖母液稀釋到濃度分別為0.01、0.03、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL，取各濃度樣液2 mL，分別加入2 mL 2 ×10－4mol/L 的DPPH乙醇溶液，搖勻后室溫下反應(yīng)30 min，在517 nm 處測定吸光值A(chǔ)i，空白組以等體積無水乙醇代替DPPH溶液，對照組以等體積蒸餾水代替多糖溶液，并以等體積蒸餾水和無水乙醇混合液作空白調(diào)零，并以Vc為陽性對照。對DPPH 的清除率計算公式［16］:

式中:Ao，為對照組吸光值;Ai，為樣品組吸光值;Aj，為空白組吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶用量確定

在溫度45℃時，調(diào)節(jié)pH 為3.5，酶解2.0h 的條件下，分別以1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的添加量加纖維素酶，考察酶用量對馬齒莧多糖提取率的影響。結(jié)果如圖1 所示。

圖1 加酶量對馬齒莧多糖提取得率的影響Fig.1 Effect of cellulase amount on the extraction yield of purslane polysaccharides

由圖1 可知，隨著纖維素酶用量的增加，馬齒莧多糖提取率在酶用量為2.5%時最大，但多糖提取率的增加不明顯，這可能是因為酶添加量增加，其他成分也被纖維素酶酶解溶出，使多糖得率反而下降。

2.2 加酶超聲輔助提取馬齒莧多糖的單因素試驗

由圖2 可知，隨著超聲時間的延長，馬齒莧多糖的提取得率不斷增加，當(dāng)超聲時間在20min 后隨著時間的繼續(xù)延長，提取得率增長趨勢變緩，因此最適超聲時間為20min;由圖3 可知，馬齒莧多糖的提取得率在30 ～70℃之間隨著溫度的升高而逐漸增加，在60℃時達(dá)到最大值后隨著溫度的繼續(xù)升高提取得率有下降趨勢。溫度過高提取率反而下降的原因可能是超聲溫度過高時馬齒莧多糖結(jié)構(gòu)會發(fā)生部分變性，影響提取率，因此最適超聲溫度為60℃;由圖4 可知，隨著超聲功率的增加，馬齒莧多糖的提取得率提高，在70W 時馬齒莧多糖的提取得率達(dá)到最大值，增大功率，馬齒莧多糖提取得率反而下降，這可能是因為超聲功率太大會導(dǎo)致其他成分也被分解出來和影響多糖結(jié)構(gòu)被破壞，則提取得率降低。因此，最適超聲功率為70W。

圖2 超聲時間對馬齒莧多糖提取得率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic treatment time on the extraction yield of purslane polysaccharides

圖3 超聲溫度對馬齒莧多糖提取得率的影響Fig.3 Effect of temperature on the extraction yield of purslane polysaccharides

圖4 超聲功率對馬齒莧多糖提取得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on the extraction yield of purslane polysaccharides

2.3 加酶超聲輔助提取馬齒莧多糖的正交試驗

在纖維素酶提取馬齒莧多糖單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取超聲時間、溫度、功率以及酶用量為試驗因素，以提取率和純度為試驗指標(biāo)，選用L9(34)正交表進(jìn)行試驗。每個試驗組合重復(fù)3 次，結(jié)果取其平均值。用正交設(shè)計助手Ⅱv3.1.1 統(tǒng)計軟件進(jìn)行結(jié)果分析，結(jié)果見表1 和表2。

表1 正交試驗結(jié)果表Table 1 Orthogonal experiments result

由表1 知，各因素對提取得率的影響順序為A ＞B ＞C，即超聲時間＞超聲溫度＞超聲功率。比較k值的大小可以看出，馬齒莧多糖提取工藝的優(yōu)化條件是A2B2C1，即超聲時間20 min，超聲溫度60℃，超聲功率70 W。驗證試驗得到馬齒莧多糖提取得率為18.40%;而在本實驗室經(jīng)試驗，用傳統(tǒng)水提醇沉工藝在提取溫度95℃，提取時間2 h，料液比1 ∶12(g∶mL)，浸提次數(shù)3 次的條件下得到馬齒莧多糖的提取得率僅為9.87%，可見利用加酶超聲技術(shù)可提高馬齒莧多糖提取得率。

表2 對提取率的方差分析表Table 2 Variance analysis of the extraction rate

由表1、表2 可知，超聲時間對提取得率在所考察的范圍內(nèi)影響顯著，而超聲溫度和功率對提取得率在所考察的范圍內(nèi)影響不顯著，因為馬齒莧角質(zhì)層比較厚并且纖維素含量普遍較高，其多糖分離出來的影響較大，其次超聲溫度和功率變化會引起其解離狀態(tài)的變化。超聲波可以破碎阻礙多糖溶出的細(xì)胞壁，可使植物結(jié)構(gòu)變得松散，使多糖便于溶出，縮短提取時間和周期，有利于植物多糖的浸出。

2.4 加酶和超聲技術(shù)對馬齒莧多糖結(jié)構(gòu)影響評價［17

在500 ～4 000 cm－1波段范圍內(nèi)分別掃描加酶超聲處理和采用傳統(tǒng)水提醇沉提取得到的2 種馬齒莧多糖樣品，將紅外光譜譜圖進(jìn)行疊加就得到疊加效果圖(圖5)。

圖5 兩組馬齒莧多糖紅外光譜疊加效果圖Fig.5 Overlay effect of two groups polysaccharide in the infrared spectrum

由圖5 中可以看出，2 組光譜圖的重疊效果很好，說明2 組多糖分子結(jié)構(gòu)不存在顯著差異，所以酶解和超聲技術(shù)對馬齒莧多糖結(jié)構(gòu)無顯著影響。又可知纖維素酶只對馬齒莧肥厚的特殊表皮有溶解作用而沒有改變馬齒莧多糖的結(jié)構(gòu)(紅色為未經(jīng)加酶超聲處理，黑色為經(jīng)過加酶超聲處理的馬齒莧多糖)。

2.5 馬齒莧多糖的抗氧化活性的測定

圖6 馬齒莧多糖總抗氧化能力的測定Fig.6 Determination of the total antioxidant capacity of the purslane polysaccharide

由圖6 可知，Vc 和馬齒莧多糖的總抗氧化能力都隨著濃度的增大吸光度也逐漸增大，樣品液濃度和Vc 濃度都在0.05 ～0.4 mg/mL 時馬齒莧多糖的吸光度值小于Vc 的吸光度，總體來看馬齒莧多糖的總抗氧化能力比Vc 的總抗氧化能力弱;由圖7 可知，隨著馬齒莧多糖濃度的增加，馬齒莧多糖清除自由基能力增強，馬齒莧多糖和Vc 清除率達(dá)到50%所需濃度(IC50)分別約為0.460、0.219 mg/mL。這說明馬齒莧多糖的自由基清除力與馬齒莧多糖濃度相關(guān)，它對·OH 自由基有清除作用，但弱于Vc;由圖8 可知，馬齒莧多糖對DPPH·清除能力隨著馬齒莧多糖濃度增大，清除DPPH·能力呈一定的量效關(guān)系。馬齒莧多糖對DPPH·的清除效果稍弱于Vc，其IC50為0.492mg/mL，而Vc 的IC50為0.331 mg/mL。

圖7 馬齒莧多糖對·OH 的清除率Fig.7 Scavenging activities of purslane polysaccharides against the hydroxyl free radicals

圖8 馬齒莧多糖對DPPH 的清除率Fig.8 Scavenging activities of purslane polysaccharides against the DPPH free radicals

3 結(jié)論

加酶超聲提取馬齒莧多糖的最佳工藝條件為:加酶量為2.5%，提取溫度為60℃，提取時間20 min，提取功率70W，在此條件下，多糖提取得率為18.40%。采用加酶超聲技術(shù)均可提高馬齒莧多糖提取得率，但對馬齒莧多糖的結(jié)構(gòu)沒有顯著影響，因此利用加酶超聲輔助提取馬齒莧多糖手段是高效可行的。本實驗室結(jié)果表明馬齒莧多糖具有較好的抗氧化性，且在試驗的濃度范圍內(nèi)，該多糖總抗氧化能力、對·OH 和DPPH 的清除作用呈現(xiàn)出線性關(guān)系。馬齒莧多糖對各種形式的活性氧均有清除作用，并且清除率與濃度有關(guān)。

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