籽瓜多糖的提取分離及單糖組成的GC-MS 分析*

宋珅，趙保堂，殷振雄，劉琴，梁俊玉，2，張繼，2

1(西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州，730070)

2(甘肅特色植物有效成分制品工程技術(shù)研究中心，甘肅 蘭州，730070)

籽瓜又名打瓜，形狀與西瓜類似，但比西瓜略小，多籽，味淡。根據(jù)《本草綱目》記載“籽瓜性味甘”?！白压先胄钠⑽?，肉有降心脾胃熱，止消渴”，該功效已被眾多消費者所認(rèn)同。主要產(chǎn)地在吉林、內(nèi)蒙古、甘肅、山西、新疆等省，在甘肅其產(chǎn)量很大，其籽是加工炒食的主要原料，而目前取籽后剩余占籽瓜總質(zhì)量93%的瓤皮一般都被丟棄，不僅造成環(huán)境污染，而且浪費大量的資源。籽瓜的瓜和瓜皮，每百克含糖8%左右，含VA、VB、VC、VPP及鈣、磷、鐵等，有散熱、解渴、利尿等功效［1］。王翠平對籽瓜皮和瓢作了研究，表明籽瓜皮和籽瓜瓤具有一定的的清除DPPH·、OH·、ABTS·自由基能力和抑制肝癌細(xì)胞7721 生長的活性，可作為一種良好的天然抗氧化劑及抗腫瘤活性物質(zhì)［2］。多糖類化合物是一種免疫調(diào)節(jié)劑，它能激活免疫細(xì)胞，同時又能促進干擾素生成，促進白細(xì)胞介素生成，誘生腫瘤壞死因子等重要的生理功能［3］。從籽瓜瓜瓤中提取籽瓜多糖是對籽瓜皮瓤“廢物利用”，既解決了籽瓜去籽后產(chǎn)生污染問題，又提高了籽瓜經(jīng)濟效益，是籽瓜綜合利用的有效途徑之一。本文采用微波波輔助提取法研究了各種因素對籽瓜多糖產(chǎn)率的影響，確定了適宜的提取工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮籽瓜(甘肅白銀市靖遠(yuǎn)縣);無水乙醇、三氯甲烷、三氟乙酸、鹽酸羥胺、吡啶、乙酸酐、溴化鉀均為分析純。

1.2 實驗儀器

J0500-3 型電子天平，沈陽龍騰電子有限公司;NJC03-2 型微波提取設(shè)備，南京匯研微波系統(tǒng)工程有限公司;TDL5M 型臺式大容量冷凍離心機，湘儀離心機廠;LGJ-185 型真空冷凍干燥機，北京松源華興科技發(fā)展有限公司;RE-52AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠;UV9100B 型紫外可見分光光度計，北京萊伯泰科儀器有限公司;IS10 型傅立葉紅外光譜儀，美國Thermo 公司;氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Thermo 公司。

1.3 微波輔助提取籽瓜多糖

原材料預(yù)處理:籽瓜切碎去除瓜子和瓜皮后粉碎得到籽瓜汁待用。

取一定量預(yù)處理后的籽瓜汁，以蒸餾水為溶劑，采用不同料液比、微波功率、提取溫度、提取時間在微波提取裝置中進行籽瓜多糖的微波輔助提取試驗。提取液經(jīng)過離心后減壓濃縮至較小體積，加入無水乙醇至終濃度為85%，醇沉24h 后離心，下層沉淀經(jīng)冷凍干燥得到籽瓜粗多糖。籽瓜粗多糖經(jīng)酶和Sevage偶聯(lián)法脫蛋白后濃縮、醇沉冷凍干燥后得到籽瓜精糖備用。

多糖得率和總糖含量的計算方法:

苯酚硫酸法測定總糖含量［4］。

1.3.1 單因素實驗

影響微波輔助提取多糖得率的主要因素有液料比、微波功率、提取溫度、取時間和提取次數(shù)等。本實驗在料液比為(g∶mL)1∶1，提取溫度為60℃，功率為300 W 的前提下，提取時間分別選取5、10、20、30、60 min 這5 個水平;在料液比為1 ∶1，提取時間為30 min，功率為300 W 的前提下，提取溫度分別選取30、40、50、60、70 和80℃6 個水平;在料液比為1∶1，提取時間為30 min，溫度為60℃為的前提下，微波功率分別選取100、200、300、400、500 W 這5 個水平;在功率為300 W，提取時間為30 min，溫度為60℃為的前提下，料液比分別選取3∶2、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4(g∶mL)5 個水平進行實驗，每組平行3 次，計算籽瓜多糖的得率。

1.3.2 響應(yīng)面分析法實驗設(shè)計

選擇單因素試驗中對響應(yīng)值(籽瓜多糖得率)有顯著影響的因素。采用SAS(SAS Package，Version 8. 2)對實驗數(shù)據(jù)進行回歸分析。每一自變量的低、中、高實驗水平分別以－1，0，1 進行編碼，該模型通過最小二乘法擬合二次多項方程可以表達為:

其中Y為響應(yīng)值(籽瓜多糖得率)，A0，Ai，Aii，Aij為方程系數(shù)，Xi為自變量編碼值一次項，Xii為自變量編碼值二次項，Xij(i≠j)為自變量編碼值交互項，建立實驗數(shù)學(xué)模型，以提取時間(X1)、提取溫度(X2)、料液比(X3)和微波功率(X4)值為自變量，以－1、0、1 分別代表自變量水平，按方程xi=(Xi－X0)/ΔX對自變量進行編碼。其中xi為自變量的編碼值，Xi為自變量的真實值，X0為實驗中心點處自變量的真實值，ΔX為自變量的變化步長(表1)，4 個變量共計29 種組合。

實驗因素、水平及編碼如表1 所示:

表1 實驗因素、水平及編碼Table 1 Experiment factors，levels and code

1.4 籽瓜多糖的紅外光譜分析

充分干燥的籽瓜多糖樣品用KBr 壓片，4000 －400 cm－1波長范圍內(nèi)掃描，掃描次數(shù)16 次，分辨率為4 cm－1。

1.5 籽瓜多糖的GC-MS 分析

糖腈乙酸酯衍生物的制備:10 mg SWP，加4 mL 4 mol/L 的CF3COOH，充N2，120℃密閉水解4h。減壓蒸干，加入10 mg 鹽酸羥胺，0.5 mL 吡啶，于90℃油浴中反應(yīng)30 min。加入0.5 mL 乙酸酐，在90℃油浴乙酰化30 min，反應(yīng)產(chǎn)物減壓蒸干。

衍生物的GC-MS 分析:用1 mL 的三氯甲烷充分溶解衍生物，0.22 μm 有機濾膜過濾。然后吸取0.2 ul 進樣，GC-MS 分析。分析條件:以160℃開始，保留3 min，以2 ℃/min 線性升到210℃。載氣為氦氣，柱流量1.0 mL/min，進樣口溫度:250℃;質(zhì)譜條件:EI源;電離電壓:70eV;離子源溫度:250℃;掃描范圍:33 ～550aum;分流比:50∶1。

對照標(biāo)準(zhǔn)單糖:葡萄糖(Glu)、甘露糖(Man)、半乳糖(Gal)、核糖(Rib)、木糖(Xyl)、阿拉伯糖(Ara)、鼠李糖(Rha)、來蘇糖(Lyx)做同樣處理。

2 實驗結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗中各因素對提取率的影響

2.1.1 微波提取時間對多糖得率的影響

由圖1 可知，在一定范圍內(nèi)，隨著提取時間的延長，籽瓜多糖的得率先增大后減小，在20 min 時達到最大。這是由于微波效應(yīng)使水分子發(fā)生高速震蕩、自旋，增大了溶劑進入溶質(zhì)內(nèi)部的能力原料的細(xì)微組織結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，多糖更容易從基質(zhì)中釋放出來，使得整個提取時間縮短，提取率增高。處理時間過短，多糖溶解不充分;如果時間過長，會造成多糖降解，甚至使其中的五碳環(huán)或六碳環(huán)裂解而轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苡谝掖嫉膯翁?、寡糖或低聚糖，在醇沉過程中有所損失，最終會導(dǎo)致提取率的下降［5］。因此確定提取時間為20 min。

圖1 提取時間對多糖得率的影響Fig.1 The effect of extract times on the yield of polysaccharide

2.1.2 微波提取溫度對多糖得率的影響

由圖2 可知，溫度對于籽瓜多糖的提取有著顯著的影響。隨著溫度的增加，籽瓜多糖得率呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，在30 ～60℃時，籽瓜多糖得率隨溫度的增加而增加，并且多糖得率在60℃時達到最大，在一定范圍里，提取溫度升高，有利于分子的運動和多糖的溶出;但溫度過高則會影響到多糖的結(jié)構(gòu)，反而會使多糖得率降低。因此最終確定提取溫度范圍是60℃。

圖2 提取溫度對多糖得率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the yield of polysaccharide

2.1.3 液料比對多糖得率的影響

由圖3 可知，隨料液比的增加，籽瓜多糖得率呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，這是因為，液料比低時，多糖溶解不充分，故得率低;隨著液料比增高，多糖充分溶脹，有利于多糖的溶出，使得率增加。但是，液料比過大，使后續(xù)中的濃縮時間增加，必然使多糖在濃縮過程中有較多損失，反而使多糖得率下降［6］。由圖可知，料液比在1∶1 時，籽瓜多糖得率最佳。

圖3 料液比對多糖得率的影響Fig.3 The effect of ratio of material on the yield of polysaccharide

2.1.4 微波功率對多糖得率的影響

由圖4 可知，在100 ～300W 功率內(nèi)，籽瓜多糖的得率隨著微波功率的增加逐漸增大，但是當(dāng)功率大于300W 時，多糖得率呈現(xiàn)非常明顯的下降趨勢。這可能是因為，微波功率增大，細(xì)胞內(nèi)溫度升高使細(xì)胞內(nèi)部壓力升高，細(xì)胞破裂使得細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)大量流出。而當(dāng)功率過大時，局部溫度過高，使多糖結(jié)構(gòu)遭到破壞，導(dǎo)致提取率的下降［7］。因此最終確定提取功率是300W。

圖4 微波功率對多糖得率的影響Fig.4 Effect of microwave power on the yield of polysaccharide

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取籽瓜多糖的工藝

2.2.1 模型方程的建立與顯著性檢驗

分別以多糖提取率為響應(yīng)值Y，通過SAS 軟件對試驗資料進行響應(yīng)面分析(表2)，經(jīng)二次回歸擬合后求得響應(yīng)函數(shù)，即可得到回歸方程如下:

對回歸方程進行方差分析和模型系數(shù)顯著性檢驗(表3、表4)。

表2 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 RSM design matrix and the responses

續(xù)表2

如表2 所示，共29 個試驗點，其中24 個為析因點，5 個為零點，析因點為自變量取值在X1、X2、X3、X4所構(gòu)成的三維頂點;零點為區(qū)域的中心點，其中零點試驗重復(fù)5 次，用以估算試驗誤差。

表3 回歸模型顯著性檢驗及方差分析Table 3 Significance test and variance analysis for the regression model

由方差分析(表3)可以看出，模型Prob ＞F 值小于0.05，表明該模型方程極顯著，不同處理間的差異高度顯著，說明這種實驗方法是準(zhǔn)確可靠的. 采用F檢驗方法對模型的顯著性進行分析，F(xiàn) 值為6.75，p值小于0.01，表明模型是極顯著的，可以采用回歸模型對響應(yīng)值進行預(yù)測。

回歸模型的回歸模型的R2為0.871 0，說明模型的擬合度很好，響應(yīng)值的87.1%的是由于所選變量引起的，使用該方程模擬真實的四因素三水平的分析是可行的。由表4 的分析結(jié)果可以看出各因素中一次項XI、X2、X3、X4不顯著，二次項中X21、X22、X23、X24 是極顯著的，但是交互項XI X2、XI X3、XI X4、X2X3、X2X4、X3X4不顯著，表明各因素對響應(yīng)值的影響沒有明顯的交互作用。可以用該模型方程來分析和預(yù)測不同提取條件下籽瓜多糖的得率的變化。2.2.2 響應(yīng)面結(jié)果分析

表4 多糖得率回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗Table 4 Regression coefficient and ANOVA test of the yield of polysaccharide

根據(jù)多糖得率回歸模型作出相應(yīng)的響應(yīng)面和等高線見圖5 ～圖10，三維球面圖與二維等高曲線圖很形象地描述了二次回歸方程。通過三維圖與曲線圖，能很容易的看出實驗水平與每個變量或是變量之間的交互影響的響應(yīng)值之間的關(guān)系。等高線的形狀(圓形、橢圓形)表明了變量之間的交互影響是否顯著。圓形的等高線表明兩變量之間的交互影響是不顯著;橢圓形的等高線表明兩變量之間的交互影響是顯著的。比較圖響應(yīng)面最高點和等高線可知，在所選各因素水平范圍內(nèi)存在極值，即響應(yīng)面最高點，同時也是等高線最小橢圓的中心［8］。

圖5 是溫度和時間交互作用對多糖得率的影響。由圖可知溫度和時間兩者間的交互影響比較顯著。當(dāng)料液比為1∶1，功率是300W 時，隨著提取時間的增加，多糖得率也增大，時間越長得率越大，隨著提取溫度的升高，多糖得率先升高后降低。但是提取溫度過高、時間過長會導(dǎo)致一些大分子多糖的降解。

由圖6 可知，提取時間和料液比對多糖得率的交互影響較為顯著。在提取溫度為60℃，微波功率為300W 時，多糖得率的變化速率顯示料液比的效應(yīng)大于時間。隨著提取時間的增加，多糖得率也慢慢增大，提取時間過長會導(dǎo)致多糖發(fā)生水解，多糖得率也會減小。隨著料液比的增加，多糖得率是先增大后減小。料液比小細(xì)胞內(nèi)升溫快，破壁效應(yīng)大，多糖得率大，隨著料液比的增加，損失在提取介質(zhì)中的微波能越來越多，細(xì)胞內(nèi)的溫度升高緩慢，破壁效應(yīng)減小，多 糖得率減小。因此料液比過大不利于多糖的提取。

圖5 溫度、時間及其交互作用對得率影響的響應(yīng)面和等高線Fig.5 Response surface plot and contour plot of the combined effects of temperature and time on the yield of polysaccharide

圖6 時間、料液比及其交互作用對得率影響的等高線和響應(yīng)面Fig.6 Response surface plot and contour plot of the combined effects of time and ratio of material on the yield of polysaccharide

圖7 時間、功率及其交互作用對得率影響的響應(yīng)面和等高線Fig.7 Response surface plot and contour plot of the combined effects of time and microwave power on the yield of polysaccharide

圖7 的結(jié)果顯示，當(dāng)提取溫度為60℃，料液比為1∶1 時，多糖得率的變化速率顯示功率的主效應(yīng)大于時間。隨著提取時間的延長多糖得率慢慢增大，時間長多糖溶出率增大;隨著功率的增大，多糖得率逐漸增大，而在功率達到一定時，隨著提取時間的增加，多糖得率又呈現(xiàn)出下降的趨勢。

由圖8 可知，提取溫度和料液比的相互交互作用較強。在提取時間為20 min，微波功率為300 W 時，隨著溫度的升高多糖得率也不斷升高，且溫度越高升高速率越快，但溫度過高時多糖得率又慢慢變小，這是因為溫度過高導(dǎo)致大分子多糖降解，多糖得率減小;隨著料液比的增加多糖得率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，這主要是因為料液比影響液相主體和固相主體之間的濃度差造成的。

圖9 的結(jié)果顯示，隨著功率的增大，多糖得率逐漸增大;而當(dāng)功率增加到一定數(shù)值時，隨著溫度以及提取時間的增加，多糖得率呈現(xiàn)下降的趨勢。在較高的提取溫度下，受到微波輻射效應(yīng)的影響，多糖容易從細(xì)胞中游離出來，但是溫度過高會導(dǎo)致多糖發(fā)生水 解使得多糖得率降低。

圖8 溫度、料液比及其交互作用對得率影響的響應(yīng)面和等高線Fig.8 Response surface plot and contour plot of the combined effects of temperature and ratio of material on the yield of polysaccharide

圖9 溫度、功率及其交互作用對得率影響的響應(yīng)面和等高線Fig.9 Response surface plot and contour plot of the combined effects of temperature and microwave power on the yield of polysaccharide

圖10 功率、料液比及其交互作用對得率影響的響應(yīng)面和等高線Fig.10 Response surface plot and contour plot of the combined effects of microwave power and ratio of material on the yield of polysaccharide

由圖10 可知，在提取時間和提取溫度分別為20 min 和60℃時，料液比和微波功率對多糖得率的影響都是先增加后減少。隨著微波功率慢慢增大，細(xì)胞的破壁效應(yīng)逐漸增大，有利于細(xì)胞內(nèi)部糖的溢出，微波功率過大又會使多糖發(fā)生降解;隨著料液比增大，液相中糖的濃度增大，多糖得率增加，料液比過高會使細(xì)胞內(nèi)溫度升高緩慢，不利于糖的溶出，多糖得率降低。

2.2.3 優(yōu)化提取參數(shù)和驗證模型

表5 最優(yōu)條件與最優(yōu)條件下的預(yù)測、實際值Table 5 Optimum conditions and the predicted and experimental value of response at the optimum conditions

由SAS 分析得到最大響應(yīng)值與其相對應(yīng)的籽瓜多糖的最佳提取條件為∶時間為19.58min，功率為302.5W，溫度為62.37℃，料液比為1∶0.92，理論最佳提取率為4.599%。為了檢驗響應(yīng)面法的可行性，采用得到的最佳提取條件進行籽瓜多糖微波輔助提取的驗證實驗，同時考慮到實際操作和生產(chǎn)的便利，因此將微波輔助提取籽瓜多糖的各個實驗因素條件修訂為:時間為19.5 min，功率為302W，溫度為62℃，料液比為1∶0.9。經(jīng)過5 次平行實驗，得到的實際平均提取率為4.55%.

2.3 籽瓜多糖的紅外光譜掃描

圖11 是籽瓜多糖在4 000 ～400 cm－1的紅外光譜圖譜。3 408 cm－1處為—OH 伸縮振動峰，而2 928 cm－1和1 408 cm－1處的2 組吸收峰分別代表了C—H的伸縮振動和變角振動，基本可以確認(rèn)SWP 是糖類化合物［9］。1 645.08 cm－1處的吸收峰可能是—CHO中C=O 的伸縮振動。1 0 7 4 cm－1處的吸收峰為C—O—H 中的—OH 的變角振動［11］。

圖11 籽瓜多糖的紅外圖譜Fig.11 FTIR spectra of Seed Watermelon polysaccharide

2.4 籽瓜多糖的單糖組成分析

由GC-MS 分析得到籽瓜多糖由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖六種單糖組成，歸一化法得出各組分摩爾比為:4.48∶13.14∶4.16∶7.82∶10.1∶60.3。

圖12 標(biāo)準(zhǔn)單糖的GC 圖和籽瓜多糖的GC 圖Fig.12 The GC photo of the standard monosaccharide and the GC photo of SWP

3 結(jié)論

(1)通過單因素實驗和響應(yīng)面優(yōu)化得到微波輔助提取籽瓜多糖的最佳提取條件為∶時間為19.58 min，功率為302.5W，溫度為6 237℃，料液比為1∶0.92，提取率為4.599%?？紤]到實際操作的可控性，將響應(yīng)面優(yōu)化得到的微波輔助提取籽瓜多糖的最佳工藝條件修訂為:時間為19.5 min，功率為302W，溫度為62℃，料液比為1∶0.9。經(jīng)過5 次平行實驗，得到的實際平均提取率為4.55%。

(2)運用GC-MS 對籽瓜多糖的單糖組分進行分析表明，籽瓜多糖由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖6 種單糖組成，歸一化法得出各組分摩爾比為4.48∶13.14∶4.16∶7.82∶10.1∶60.3。

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