保加利亞乳桿菌LJJ 自溶的影響因素分析*

崔文明，劉鷺，張書文，逄曉陽，李紅娟，呂加平

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工綜合性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，100193)

乳酸菌自溶現(xiàn)象在乳酸菌發(fā)酵制品中普遍存在，是菌體自發(fā)進(jìn)行的細(xì)胞溶解現(xiàn)象，被認(rèn)為是細(xì)菌在不利環(huán)境中維持自我菌群生存的一種保護(hù)機(jī)制［1］。細(xì)菌自溶與自溶酶密切相關(guān)，通常認(rèn)為自溶是由細(xì)菌內(nèi)自溶酶的失衡作用所引起。自溶過程中自溶酶對細(xì)胞壁的水解作用會導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂而出現(xiàn)孔洞，致使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物流失［2］。

乳酸菌自溶過程中釋放的胞內(nèi)蛋白酶、肽酶、酯酶等酶類，可將蛋白、多肽和脂肪分解成不同的風(fēng)味物質(zhì)或風(fēng)味前體物質(zhì)，從而形成發(fā)酵制品的特殊風(fēng)味和口感［3］。一般情況下，發(fā)酵劑菌株自溶對發(fā)酵制品的品質(zhì)形成起著積極作用。以干酪生產(chǎn)為例，比較高自溶菌株Lactobacillus lactissubsp．cremorisAM2 與低自溶菌株Lactobacillus lactissubsp．cremorisHP 生產(chǎn)的切達(dá)干酪品質(zhì)后發(fā)現(xiàn)，前者沒有苦味且風(fēng)味濃郁，而后者則苦味明顯，且風(fēng)味物質(zhì)種類顯著少于前者［4］。由于干酪成熟過程中產(chǎn)生的良好風(fēng)味主要依賴于乳酸菌自溶所釋放酶的水解作用，所以釋放酶的種類及數(shù)量將決定著干酪成熟周期長短和風(fēng)味優(yōu)劣［5-6］，表明發(fā)酵劑菌體快速自溶在一定程度上有利于促進(jìn)干酪成熟。然而，當(dāng)發(fā)酵劑菌體自溶速率過快時(shí)，會導(dǎo)致發(fā)酵制品產(chǎn)酸不足、凝乳不良及乳糖殘留過多等問題而影響產(chǎn)品的品質(zhì)和得率［7］。

鑒于乳酸菌自溶在發(fā)酵乳制品中的普遍性、重要性，而自溶酶調(diào)控自溶的相關(guān)機(jī)制尚不清晰的現(xiàn)狀，本研究主要以保加利亞乳桿菌LJJ 菌株為研究對象，考察菌體溫育溫度、溫育時(shí)間、環(huán)境pH、菌體生長階段、SDS 濃度，Triton X-100 濃度對菌體自溶特性及溶菌酶活性、自溶過程的菌體形態(tài)變化的影響規(guī)律，以期初步解釋乳酸菌自溶的誘發(fā)原因和自溶規(guī)律，為更進(jìn)一步探討乳酸菌的自溶機(jī)理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

德式乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckiisubsp．bulgaricus)LJJ(本實(shí)驗(yàn)室分離保存);EDTA，HCl(分析純，國藥化學(xué)試劑有限公司)、十二烷基磺酸鈉(SDS)(分析純，北京拜爾迪生物有限公司)、Tris Base(Angus Chemical Company)、MRS 培養(yǎng)基(北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司)，溶菌酶檢測試劑盒(南京建成生物有限公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

AUW220 電子天平，日本 Shimadzu 公司;UV2300 分光光度儀，上海天美科學(xué)儀器有限公司;DHP-9082 型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司;DL-CJ-IN 高性能無菌試驗(yàn)臺，哈爾濱市東聯(lián)公司;LDZX-50KB 立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠;JY92-ⅡN 超聲波細(xì)胞破碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司;S-3400N 型掃描電鏡，日本日立公司。

1.3 方法

1．3．1 菌株保藏及培養(yǎng)基制備

保存于-20℃冰箱的凍干菌粉，經(jīng)MRS 液體培養(yǎng)基于37℃條件下活化3 次以上，然后儲存于4℃冰箱備用。MRS 液體培養(yǎng)基按照商品說明書所示比例配制，115℃滅菌20 min。

1．3．2 菌體培養(yǎng)、收集、洗滌及重懸

經(jīng)活化的實(shí)驗(yàn)菌株培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，以4%(v/v)的接種量接種于MRS 液體培養(yǎng)基，37 ℃下培養(yǎng)至目標(biāo)菌體濃度后，離心(5 000 r/min，4℃，10 min)收集菌體。無菌生理鹽水懸浮洗滌菌體，重復(fù)洗滌3 次，無菌備用TE 緩沖液(50 mmol/L Tris，50 mmol/L EDTA)洗滌菌體1 次，懸浮收集菌體于適當(dāng)pH 的上述TE 緩沖液，備用。

1．3．3 自溶度的檢測方法

LJJ 菌懸液(OD600nm=0．4 ～0．6)，取適量去除菌體，測定上清液OD260nm，讀數(shù)記為A0。另取適量上述菌懸液置于培養(yǎng)箱溫育t h 后，取樣去除菌體，測定上清液OD600nm，讀數(shù)記為At。超聲波冰浴破碎(400 W，工作3 s，間隙3 s)剩余菌懸液至透明(表明菌體完全破碎)，取樣去除菌體，測定溶液OD260nm，讀數(shù)記為As。菌體自溶度計(jì)算:

1．3．4 菌體生長階段對其自溶度的影響

分別選取來自對數(shù)生長初期、中期、末期，生長穩(wěn)定期和生長末期的菌體細(xì)胞，重懸于pH 8．0 的緩沖液中于37℃下振蕩溫育24h，測定其自溶度。

1．3．5 不同pH 對菌體自溶度的影響

洗滌菌體分別重懸于pH 為2．0，4．0，5．0，6．0，7．0，8．0，10．0 的洗滌緩沖液中，于37℃，振蕩溫育，測定其自溶度。

1．3．6 溫度對菌體自溶度的影響

取對數(shù)生長期的菌體細(xì)胞，重懸于pH 8．0 的洗滌緩沖液中，分別置于4，25，37，50，60 和70℃環(huán)境中振蕩溫育，測定其自溶度。

1．3．7 SDS 濃度對菌體自溶的影響

取對數(shù)生長期菌體細(xì)胞重懸于pH 8．0 的洗滌緩沖液中，懸浮液中分別添加SDS 至終濃度為0．10，0．25，0．50 及1．00 g/L，置于37℃下振蕩溫育，測定其自溶度。

1．3．8 Triton X-100 濃度對菌體自溶的影響

取對數(shù)生長期菌體細(xì)胞，重懸于pH8．0 的洗滌緩沖液中，懸浮液中分別添加Triton X-100 至終濃度為0．25，0．50 及1．00 g/L，置于37℃下振蕩溫育，測定其自溶度。

1．3．9 掃描電鏡觀察

收獲處于對數(shù)生長期的菌體細(xì)胞，生理鹽水洗滌3 次，TE 緩沖液洗滌1 次后，取部分細(xì)胞，重懸浮于電鏡樣品固定液，備用。剩余樣品取一部分添加終含量0．50 g/L 的SDS 與剩余部分樣品置于37℃培養(yǎng)箱孵育24 h 后，離心收集菌體，重懸于電鏡樣品固定液。將正常細(xì)胞，24 h 自溶細(xì)胞和SDS 自溶細(xì)胞制備電鏡樣品后，置于掃描電鏡下觀察。

1．3．10 溶菌酶活力檢測

采用比濁度法，參見試劑盒使用說明書。

1．3．11 數(shù)據(jù)處理與分析

應(yīng)用Statistics Analysis System(SAS)9．2 進(jìn)行單因素方差分析，P＜0．05 視為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生長階段LJJ 菌株自溶度的變化

圖1 結(jié)果顯示，隨著LJJ 細(xì)胞的不斷增殖，細(xì)胞自溶度逐步降低(未包括遲滯期，0 ～2 h)。對數(shù)生長期(4 ～14 h)細(xì)胞具有最大的自溶度，約為70．0%，整個(gè)對數(shù)生長期階段，生長中期(10 ～12 h)的細(xì)胞自溶度略高，但對數(shù)生長期內(nèi)細(xì)胞自溶度間無在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著性差異(P＞0．05)。穩(wěn)定期(20 ～32 h)細(xì)胞自溶度次之，約為43．0%，極顯著低于對數(shù)生長期自溶度(P＜0．01)。衰退期(36 ～45 h)細(xì)胞自溶度最低，一般低于20．0%且隨著時(shí)間的延長自溶度逐漸降低。來自對數(shù)生長期與穩(wěn)定期過渡區(qū)間(16 ～18 h)和穩(wěn)定期與衰退期過渡區(qū)間(32 ～34 h)的LJJ 細(xì)胞自溶度分別介于43．0% ～60．0% 和20．0% ～43．0%，且與來自對數(shù)生長期，穩(wěn)定期，衰退期的LJJ 細(xì)胞自溶度之間存在顯著性差異(P＜0．01)。

2.2 不同pH 對LJJ 菌株自溶的影響

研究結(jié)果表明，LJJ 菌株發(fā)生自溶的最適pH 為6．0 ～8．0。菌體自溶與環(huán)境pH 值關(guān)系密切，低酸性環(huán)境可顯著抑制乳酸菌的自溶。自溶8 h 時(shí)，LJJ 菌體自溶度隨著環(huán)境pH 升高而增大，彼此間差異顯著(P＜0．01)。自溶持續(xù)發(fā)生24h 時(shí)，除pH 5．0 菌懸體系的自溶度較低外，其余體系的自溶度開始趨于一致。當(dāng)自溶時(shí)間延長至96h 時(shí)，pH 6．0 環(huán)境體系中菌體自溶度反而高于pH 8．0 和pH 7．0 環(huán)境體系中的菌體自溶度(圖2 A)。環(huán)境pH 大于8．0 時(shí)，LJJ 自溶受到部分抑制，當(dāng)pH 大于或等于10．0 時(shí)，自溶受到顯著(P＜0．01)抑制(圖2B)。

圖1 來自不同生長階段的LJJ 菌株自溶度的變化Fig．1 The autolysis rate of LJJ from different growth phases

2.3 孵育溫度對LJJ 菌株自溶的影響

由圖3A 中所示，0 ～50℃，在相同溫育時(shí)間下，LJJ 的自溶度隨溫度升高而增大，同時(shí)到達(dá)自溶度趨于穩(wěn)定所需的時(shí)間也隨著溫度的升高而縮短。其中，環(huán)境溫度50℃時(shí)，96h 時(shí)的自溶度為90．6%，為4 個(gè)溫度水平中的最大自溶度，而且在12h 已基本達(dá)到最大，此時(shí)自溶度為81．3%顯著高于37℃時(shí)的46．8%(P＜0．01)。而圖3B 顯示，當(dāng)溫度升高至60℃以上時(shí)，LJJ 自溶度開始隨著溫度的升高而降低。

2.4 SDS 對LJJ 自溶的抑制作用

圖3 溫度對乳酸菌自溶的影響Fig．3 Effects of incubation temperature on the autolysis of LJJ

當(dāng)環(huán)境中存在SDS 時(shí)，LJJ 的自溶受到抑制。環(huán)境中SDS 濃度為0．10 g/L 時(shí)，乳酸菌自溶度即降為空白對照的約62．0%，且隨著懸浮體系中SDS 含量的增加，乳酸菌的自溶度逐漸降低，當(dāng)環(huán)境中SDS 濃度為0．50 g/L 時(shí)，乳酸菌的自溶幾乎被完全抑制，此時(shí)自溶度僅為對照的0．03%。因此，SDS 是乳酸菌LJJ 自溶的較強(qiáng)抑制劑(圖4A 所示)。如圖4B 所示，與商品溶菌酶試驗(yàn)組對比，SDS 對商品自溶酶的抑制效果與LJJ 自溶抑制基本完全對應(yīng)，表明SDS 對LJJ自溶的抑制可能是通過抑制其自溶酶活性而實(shí)現(xiàn)的。

2.5 Triton X-100 對LJJ 自溶的影響

研究結(jié)果如圖5 所示，Triton X-100 的存在可促進(jìn)LJJ 自溶的發(fā)生并增強(qiáng)溶菌酶的活性，且隨著Triton X-100 濃度的增大，菌體自溶增速和酶活增強(qiáng)作用越明顯。當(dāng)環(huán)境體系中Triton X-100 添加量為1．0 g/L 時(shí)，LJJ 的自溶度相比對照增大了20．7%(溫育24h)(圖5A)，而溶菌酶的活性與空白對照相比提高了39．5%。比較圖5A 和圖5B，發(fā)現(xiàn)Triton X-100對溶菌酶酶活性的增強(qiáng)效果與加速LJJ 自溶的效果基本趨于一致。

2.6 掃描電鏡觀察LJJ 自溶中的細(xì)胞形態(tài)變化

圖4 SDS 濃度對LJJ 自溶與溶菌酶活力的影響Fig．4 Effects of SDS concentration on the autolysis of LJJ and lysmozye activity

圖5 Triton X-100 對LJJ 自溶和溶菌酶的影響Fig．5 Effects of Triton X-100 concentration on the autolysis of LJJ and lysmozye activity

對數(shù)生長期收獲的LJJ 菌體細(xì)胞，菌體完整飽滿，表面光滑(圖6A);而將正常LJJ 細(xì)胞于TE 緩沖液(pH8．0)中37℃下溫育24 h 后，LJJ 細(xì)胞的完整性遭到破壞，細(xì)胞發(fā)生不同程度的萎縮和凹陷，而且在細(xì)胞表面出現(xiàn)孔洞(圖6B)，胞內(nèi)內(nèi)容物也開始逐步釋放至周圍環(huán)境中。相同TE 緩沖液中添加終濃度0．50 g/L 的SDS 時(shí)，雖然LJJ 的細(xì)胞出現(xiàn)了不同程度萎縮、凹陷和變形，但其細(xì)胞上并未出現(xiàn)明顯的孔洞(圖6C)，表明SDS 在一定程度上通過抑制自溶酶活性而抑制菌體自溶的發(fā)生。

圖6 LJJ 正常細(xì)胞與自溶細(xì)胞的掃描電鏡圖片F(xiàn)ig．6 Electron micrographs showing the control cells and the autolysis cells of LJJ

3 討 論

3.1 乳酸菌的最適自溶條件

本研究確定的LJJ 的最適自溶條件為最適溫度50℃(0 ～50℃)，最適環(huán)境pH 6．0 ～8．0。該結(jié)果與李艾黎［8］等人和孫潔［9］等人分別研究的保加利亞乳桿菌KLDS 1．9201 和LD3 的最適自溶溫度55℃(0～55℃)，最適環(huán)境pH 5．5 ～7．5 和pH 6．0 ～7．0 基本一致。不同之處在于孫潔［9］等研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)環(huán)境pH 7．5 時(shí)，自溶度就開始有所下降，而本研究發(fā)現(xiàn)雖然在最適pH 范圍內(nèi)的初始階段自溶度隨會隨著pH的升高而增大，但自溶24h 時(shí)，不同環(huán)境pH 下的自溶度趨于相同。此外，Kang［10］，馮鎮(zhèn)［11］等研究的干酪乳桿菌和乳桿菌LB-3 的最適自溶條件也處于相一致的溫度及pH 范圍。

對數(shù)生長期菌體細(xì)胞自溶度最大的結(jié)論與Kang［10］等人的研究結(jié)論一致，但Kang［10］等人的研究發(fā)現(xiàn)來自對數(shù)生長初中末期的菌體細(xì)胞的自溶度間也存在顯著性的差異與本研究存在不一致處。比較兩者研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)菌體生長至OD600nm約為1．5時(shí)，此時(shí)菌體細(xì)胞表現(xiàn)出最大的自溶活性。

3.2 乳酸菌自溶與自溶酶

據(jù)報(bào)道細(xì)菌自溶是由細(xì)菌中存在的若干自溶酶引起，即自溶酶破壞細(xì)胞壁對細(xì)菌自溶發(fā)揮著關(guān)鍵性作用［12-14］。

(1)最適自溶條件與乳酸菌自溶酶

LJJ 自溶的最適pH 和溫度范圍與自溶酶的最適作用條件一致。以研究較深入的溶菌酶［15-16］為例，其最適pH 范圍約在6．0 ～8．0，而最適作用溫度在65～75℃。當(dāng)溫度高于65℃以上時(shí)，其熱穩(wěn)定性開始降低，半衰期隨著溫度的升高快速減少。65℃時(shí)，溶菌酶半衰期大于3 h，75℃時(shí)半衰期則為45 min［17］。對比上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，乳酸菌的自溶最適pH 范圍在6．0 ～8．0，與溶菌酶酶活的最適范圍pH 一致。自溶的最適溫度在60℃以下，低于溶菌酶的最適作用溫度，推測這是由于當(dāng)溶菌酶在較高溫度下短期內(nèi)的酶活雖有較大增強(qiáng)，但熱穩(wěn)定性開始降低。在孵育的24 h 內(nèi)，短時(shí)間的高酶活性的自溶效果要低于較低酶活性下長時(shí)間的自溶效果。

(2)不同生長階段自溶酶的變化規(guī)律

正常情況下，自溶酶對菌體細(xì)胞分裂作用是有序進(jìn)行的，不會導(dǎo)致菌體的自溶，而一旦在外界刺激下將導(dǎo)致作用失序而引起自溶［18］。此時(shí)自溶酶產(chǎn)量越多，自溶速率也越高。對數(shù)生長期細(xì)菌快速增殖，細(xì)胞生命活動(dòng)活躍，負(fù)責(zé)分裂子母代細(xì)胞細(xì)胞壁的自溶酶得以大量產(chǎn)生，所以處于此階段的細(xì)胞在分離、洗滌、懸浮后最易發(fā)生自溶。細(xì)菌生長進(jìn)入穩(wěn)定期后，由于細(xì)菌菌體處于相對穩(wěn)定的動(dòng)態(tài)平衡中，細(xì)胞的活躍度顯著降低，自溶酶生成量減少，難以發(fā)生自溶。當(dāng)細(xì)菌生長進(jìn)入衰退期后，由于營養(yǎng)、環(huán)境等因素的制約，部分菌體開始裂解死亡，且負(fù)責(zé)破壞細(xì)胞壁的自溶酶的產(chǎn)量比穩(wěn)定期細(xì)胞有所增加［19］。

(3)乳酸菌自溶與自溶酶抑制劑和催化劑

SDS 對溶菌酶活性和對LJJ 自溶的抑制趨勢基本一致，Triton X-100 對溶菌酶活性和對LJJ 自溶的增強(qiáng)效果基本一致，均表明溶菌酶在LJJ 的自溶中起著重要作用。

已有的報(bào)道顯示，不同乳酸菌中自溶酶的種類及數(shù)量都各不相同［14，18］。因此，實(shí)現(xiàn)對LJJ 自溶的完全抑制，則需要對多種自溶酶同時(shí)存在抑制效果。而SDS 剛好是自溶酶中溶菌酶［20］、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰氨酶和部分內(nèi)肽酶的強(qiáng)抑制劑［20］。因此，SDS對乳酸菌自溶的抑制效果，是與其較廣較強(qiáng)的自溶酶抑制范圍相一致的，是SDS 對自溶酶酶活抑制作用的結(jié)果。Triton X-100 被廣泛應(yīng)用溶菌酶［21］，N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰氨酶［22］于自溶酶酶譜分析的復(fù)性劑，其可以通過與變性蛋白的結(jié)合形成復(fù)合體，從而避免蛋白間聚合并在合適的條件下使蛋白正確折疊保持活性，從而在一定程度上起到催化自溶酶活性的效果［23］。

環(huán)境pH、溫度、SDS、Triton X-100 和不同生長階段等通過影響乳酸菌自溶酶活性而影響乳酸菌自溶。所以，通過調(diào)控乳酸菌自溶酶活性即可達(dá)到調(diào)控乳酸菌自溶的目的。

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