東亞三角渦蟲(chóng)新基因Dj＿UF－1功能分析

王立飛，孫 燕，劉清梅，李 治

（陝西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安710062）

煙堿型乙酰膽堿受體（Nicotinic Acetylcholine Receptor，nAChRs）是配體門(mén)控型離子通道受體，在動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛存在，與學(xué)習(xí)、記憶、運(yùn)動(dòng)、注意力等重要功能密切相關(guān)［1］．乙酰膽堿（Acetylcholine，ACh）能激活突觸前膜的nAChRs，引起Ca2＋流入前神經(jīng)元的末端，導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)的大量釋放［2］．因此，nAChRs的激活改變了興奮和抑制之間的平衡，促使神經(jīng)興奮［3］．依據(jù)前期的文獻(xiàn)報(bào)道和研究結(jié)果，通過(guò)降低nAChR的水平或活性來(lái)維持類(lèi)膽堿信號(hào)通路的相對(duì)平衡是十分重要的，并且可以避免應(yīng)答過(guò)度激活的nAChR而導(dǎo)致的危害［4－6］．

LYNX 1屬于Ly－6／neurotoxin超家族的成員，是一種nAChRs的調(diào)節(jié)劑［7］．作為內(nèi)源性的原毒素，LYNX 1可以與nAChRs作用并改變其功能，從而調(diào)節(jié)nAChRs的活性，這對(duì)于整個(gè)類(lèi)膽堿信號(hào)通路的調(diào)控有著重要作用［7－9］．LYNX 1在進(jìn)化上類(lèi)似于蛇毒素的前體，與α－和κ－環(huán)蛇毒素有著共同的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)．α－和κ－環(huán)蛇毒素可以與nAChR緊密結(jié)合從而抑制其活性．但與環(huán)蛇毒素不同的是LYNX 1并不抑制nAChRs的功能，而是降低了nAChRs對(duì)ACh的敏感程度［8］．另外，前期研究證實(shí)LYNX 1在體內(nèi)是作為一種別構(gòu)調(diào)節(jié)劑來(lái)調(diào)節(jié)nAChRs的活性，并且在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中維持神經(jīng)元的活性和生存力［7，9－10］．此外，一 種新的Ly－6／neurotoxin超家族的成員LYNX 2也已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)［11］．

lynx1基因最早在小鼠體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，并被認(rèn)為是哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)nAChRs的調(diào)節(jié)劑．隨著基因測(cè)序和分子克隆技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)在越來(lái)越多的物種體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了LYNX 1．2008年，Young Moo Choo等人在亞洲窗螢體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的類(lèi)LYNX 1蛋白，并將其命名為Pr－lynx1，使得被證實(shí)含有l(wèi)ynx1基因的物種范圍擴(kuò)大到了無(wú)脊椎動(dòng)物［12］．

三角渦蟲(chóng)（Dugesia）是扁形動(dòng)物門(mén)的代表生物，在動(dòng)物進(jìn)化史上具有重要地位．渦蟲(chóng)具有原始的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，其神經(jīng)細(xì)胞已趨于集中形成“腦”及由腦發(fā)出的縱向神經(jīng)索，在縱神經(jīng)索之間有發(fā)達(dá)的橫行纖維相連，構(gòu)成經(jīng)典的梯式神經(jīng)系統(tǒng)．渦蟲(chóng)的神經(jīng)系統(tǒng)具有很強(qiáng)的再生能力．通過(guò)對(duì)大量EST的分析表明，渦蟲(chóng)體內(nèi)上百種與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的基因都與其他生物的同種基因保守度很高，包括人和小鼠．因此，對(duì)渦蟲(chóng)神經(jīng)系統(tǒng)的研究已經(jīng)成為神經(jīng)發(fā)育學(xué)和再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)．

本研究通過(guò)對(duì)東亞三角渦蟲(chóng)cDNA文庫(kù)的篩選，獲得一條功能未知的新基因Dj＿UF－1（Dujesia japonica Unknown Function Gene）；結(jié)合生物信息學(xué)分析和實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)Dj＿UF－1很有可能是東亞三角渦蟲(chóng)神經(jīng)系統(tǒng)中一個(gè)類(lèi)似于lynx1的重要基因．隨著lynx1基因在更多物種體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，必定會(huì)為這一神經(jīng)系統(tǒng)重要分子的研究帶來(lái)新的活力．

1 材料與方法

1．1 材料與試劑

1．1．1 東亞三角渦蟲(chóng) 東亞三角渦蟲(chóng)在實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng)于水溫為16℃的人造池塘水（Artificial Pond Water，APW，NaCl 6mmol／L，NaHCO30．1 mmol／L，CaCl20．6mmol／L，pH 7．3）中．每2d換水一次，每3d喂食新鮮豬肝一次．實(shí)驗(yàn)前一周停止喂食．

1．1．2 試劑 RNAiso Plus、M－MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑盒、Real－time PCR試劑盒（SYBR Green）均購(gòu)自TakaRa公司，無(wú)RNase的DNAase購(gòu)自羅氏公司，DEPC購(gòu)自Sigma公司．其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純．

1．2 方法

1．2．1 生物信息學(xué)分析Dj＿UF－1開(kāi)放閱讀框由ORF Finder預(yù)測(cè)（http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／gorf／gorf．html）．利用blast（http：／／blast．ncbi．nlm．nih．gov／Blast．cgi）對(duì)Dj＿UF－1編碼的氨基酸序列進(jìn)行同源序列比對(duì)，同時(shí)用CLUSTALW2（http：／／www．ebi．a(chǎn)c．uk／Tools／clustalw2／index．html）進(jìn)行氨基酸多序列比對(duì)，分析相似性．Dj＿UF－1蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、疏水性分析分別由ProtParam和ProtScal（http：／／web．expasy．org／protscale／）預(yù)測(cè)；蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)由TMHMM（http：／／www．cbs．dtu．dk／services／TMHMM／）預(yù)測(cè)；是否存在信號(hào)肽由SignalP 3．0（http：／／www．cbs．dtu．dk／services／SignalP／）預(yù)測(cè)．用Phyre2（http：／／www．sbg．bio．ic．a(chǎn)c．uk／phyre2／html／page．cgi？id＝index）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)．

1．2．2 Real－time PCR檢測(cè)重金屬離子脅迫對(duì)Dj＿UF－1基因表達(dá)的影響 用1．0mg／L CuSO4和1．0mg／L CdSO4溶液分別處理實(shí)驗(yàn)室條件下穩(wěn)定培養(yǎng)的東亞三角渦蟲(chóng)，處理時(shí)間為1h、1．5h、2h，每0．5 h更換處理液1次．以APW水飼養(yǎng)的東亞三角渦蟲(chóng)為對(duì)照組．每組設(shè)3個(gè)平行．用Trizol法提取東亞三角渦蟲(chóng)總RNA．隨后，總RNA經(jīng)無(wú)RNase的DNAase于37℃孵育40min，去除基因組污染．經(jīng)甲醛變性凝膠電泳檢測(cè)后，取1μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄獲得一鏈cDNA．Real－time PCR反應(yīng)體系參照試劑盒說(shuō)明書(shū)（TaKaRa，大連）進(jìn)行．所用Dj＿UF－1基因特異性引物為DjUF－1F：5′－ATTCATTAACGCAGCCACAT－3′和DjUF－1R：5′－ACCAACGACCTTCCTCTG－3′．同時(shí)以東亞三角渦蟲(chóng)β－actin基因作為Real－time PCR內(nèi)參基因，引物分別為DLdjBTAF：5′－ACACCGTACCAATCTATG－3′和DLdjBTAR：5′－GTGAAACTGTAACCTCGT－3′．引物由南京金斯瑞生物有限公司合成．各基因擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后繼續(xù)從65℃升溫至95℃（0．2℃／s），建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線，檢測(cè)熔鏈峰單一性．?dāng)?shù)據(jù)分析采用2－ΔΔCt方法．

1．2．3 Real－time PCR檢測(cè)東亞三角渦蟲(chóng)不同部位Dj＿UF－1基因表達(dá)水平 將東亞三角渦蟲(chóng)用DEPC（Diethyl Pyrocarbonate）水沖洗干凈，用滅菌手術(shù)刀片沿兩側(cè)耳突及眼點(diǎn)后方將渦蟲(chóng)切割成兩段．將包含腦神經(jīng)節(jié)的頭部設(shè)為實(shí)驗(yàn)組，余下的尾部設(shè)為對(duì)照組，分別提取總RNA，每組設(shè)三個(gè)平行．Real－time PCR檢測(cè)Dj＿UF－1基因在東亞三角渦蟲(chóng)頭部和尾部的表達(dá)水平．具體條件同上．

1．2．4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 運(yùn)用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析．實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用方差分析進(jìn)行顯著性差異分析（P＜0．05表示有顯著性差異）．

2 結(jié)果

2．1 Dj＿UF－1基因的生物信息學(xué)分析

圖1 東亞三角渦蟲(chóng)Dj＿UF－1基因的生物信息學(xué)分析Fig．1 Bioinformatics analysis of Dj＿UF－1gene in Dujesia japonic

東亞三角渦蟲(chóng)Dj＿UF－1基因開(kāi)放閱讀框450 bp，編碼149個(gè)氨基酸（圖1a）．同源序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，Dj＿UF－1的氨基酸序列與曼氏血吸蟲(chóng)（Schistosoma mansoni）鎘金屬硫蛋白前體序列（XP＿002575981．1）同源性最高，相似度達(dá)到49．0，其他同源性較高的均為未知功能蛋白．Dj＿UF－1蛋白分子量為17179．8D，等電點(diǎn)為8．03；在整個(gè)氨基酸序列中，所占比例最高的3種氨基酸為異亮氨酸Ile（I）9．4%，亮氨酸Leu（L）7．4%，甘氨酸Gly（G）7．4%，均為脂肪族氨基酸；不穩(wěn)定系數(shù)為36．24，說(shuō)明該蛋白穩(wěn)定［13］；全序列中脂肪族氨基酸42個(gè)，占氨基酸總數(shù)28．2%，脂肪族系數(shù)為83．29，總平均疏水指數(shù)為－0．007，說(shuō)明該蛋白為親水性蛋白．Dj＿UF－1蛋白親疏水分值最大值為4．500，最小值為－2．500，整個(gè)氨基酸序列親水性氨基酸多于疏水性氨基酸，但在氨基酸序列的C端和N端各有一個(gè)疏水性很強(qiáng)的區(qū)域［14］（圖1b）．Dj＿UF－1蛋白的20位與21位氨基酸之間存在信號(hào)肽剪切位點(diǎn)，說(shuō)明該蛋白N端具有一段信號(hào)肽序列（圖1c）．Dj＿UF－1蛋白的N端（第3～21位）和C端（第125～145位）各有1個(gè)主要由脂肪族氨基酸組成的α－螺旋結(jié)構(gòu)．兩個(gè)α－螺旋結(jié)構(gòu)之間有6個(gè)長(zhǎng)短不等的β－折疊結(jié)構(gòu)（圖1d）．Dj＿UF－1蛋白氨基酸序列的第4～21位和第125～147位有兩個(gè)跨膜的α－螺旋結(jié)構(gòu)，22～124位的氨基酸序列位于膜內(nèi)，其余的氨基酸序列位于膜外（圖1e）．Dj＿UF－1蛋白與Ly6蛋白家族的LYNX 1蛋白在三級(jí)結(jié)構(gòu)上的相似度非常高（圖1f）．

2．2 重金屬離子脅迫對(duì)Dj＿UF－1基因表達(dá)的影響

經(jīng)1．0mg／L CuSO4溶液處理后，1、1．5、2h3個(gè)處理時(shí)間的Dj＿UF－1表達(dá)量與對(duì)照組相比均沒(méi)有顯著差異（圖2a）．經(jīng)1．0mg／L CdSO4溶液處理后，3個(gè)處理時(shí)間Dj＿UF－1表達(dá)量與對(duì)照組相比沒(méi)有顯著差異（圖2b）．Dj＿UF－1基因表達(dá)水平在Cu2＋和Cd2＋脅迫下沒(méi)有明顯變化，說(shuō)明重金屬離子Cu2＋和Cd2＋對(duì)Dj＿UF－1基因的表達(dá)沒(méi)有誘導(dǎo)作用．

圖2 Cu2＋和Cd2＋處理東亞三角渦蟲(chóng)不同時(shí)間Dj＿UF－1的相對(duì)表達(dá)量Fig．2 The relative expression level of Dj＿UF－1gene in three different times treated with Cu2＋and Cd2＋

2．3 東亞三角渦蟲(chóng)不同部位Dj＿UF－1基因表達(dá)水平

將東亞三角渦蟲(chóng)沿兩側(cè)耳突及眼點(diǎn)后方切割成頭部和尾部．Real－time PCR檢測(cè)結(jié)果表明，Dj＿UF－1基因在東亞三角渦蟲(chóng)頭部的表達(dá)水平明顯高于其在尾部的表達(dá)水平（圖3），具有顯著性差異．

圖3 亞三角渦蟲(chóng)Dj＿UF－1基因在不同部位的表達(dá)量Fig．3 The relative expression level of Dj＿UF－1 gene in different body parts

3 討論

自1830年Duges首次發(fā)現(xiàn)渦蟲(chóng)（Planaria gonocephala）以來(lái)，這一扁形動(dòng)物門(mén)的模式生物便受到了生物學(xué)家的廣泛關(guān)注［15］．目前，有關(guān)渦蟲(chóng)基因組的研究取得了一定進(jìn)展，地中海渦蟲(chóng)（Schmidtea mediterranea）的基因組已經(jīng)完成測(cè)序并建立了相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)．但其他物種，如東亞三角渦蟲(chóng)，基因數(shù)據(jù)信息還是零散的．同屬扁形動(dòng)物門(mén)的吸蟲(chóng)綱的基因組數(shù)據(jù)信息要豐富的多，因此渦蟲(chóng)基因組數(shù)據(jù)的進(jìn)一步完善是十分必要的．與傳統(tǒng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)相比，生物信息學(xué)分析可以快速得到未知基因的大量信息，為研究指明方向［16］．本研究利用生物信息學(xué)分析并輔以相關(guān)實(shí)驗(yàn)，對(duì)東亞三角渦蟲(chóng)未知基因Dj＿UF－1的功能進(jìn)行了初步探究．

Dj＿UF－1氨基酸序列與曼氏血吸蟲(chóng)鎘金屬硫蛋白前體序列的相似度較高，推測(cè)Dj＿UF－1可能是東亞三角渦蟲(chóng)鎘結(jié)合金屬硫蛋白．金屬硫蛋白（Metallothioneins，簡(jiǎn)稱MTs）是一類(lèi)低分子量、富含半胱氨酸的金屬結(jié)合蛋白，與金屬離子有很強(qiáng)的親和力，普遍存在于各種生物體內(nèi)，在重金屬解毒和對(duì)抗氧化脅迫方面具有重要的作用［17－18］．前人研究表明，幾種不同金屬離子對(duì)MT基因的誘導(dǎo)能力為Cd2＋＞Cu2＋＞Hg2＋，因此本實(shí)驗(yàn)選取Cd2＋和Cu2＋對(duì)東亞三角渦蟲(chóng)進(jìn)行處理，檢測(cè)其對(duì)Dj＿UF－1的影響．然而，Real－time PCR結(jié)果顯示Dj＿UF－1基因在Cd2＋和Cu2＋脅迫下表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化，這一結(jié)果與金屬硫蛋白的特性不符，提示Dj＿UF－1并不屬于MTs家族．生物信息學(xué)可以對(duì)某一基因進(jìn)行更深入的數(shù)據(jù)挖掘和分析，但其結(jié)果仍需要實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。本研究通過(guò)重金屬離子脅迫實(shí)驗(yàn)，證明Dj＿UF－1并不是金屬硫蛋白基因，排除了生物信息學(xué)分析得出的這一可能結(jié)果．

進(jìn)一步分析Dj＿UF－1蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，半胱氨酸的含量?jī)H為6．7%，脂肪族氨基酸的含量卻高達(dá)28．2%．而大多數(shù)MTs的半胱氨酸含量很高，可達(dá)30%左右，但不含脂肪族氨基酸，如哺乳動(dòng)物的MTs一般包含61～69個(gè)氨基酸，其中有20個(gè)左右的半胱氨酸，不含脂肪族氨基酸．多序列比對(duì)結(jié)果顯示，Dj＿UF－1的149個(gè)氨基酸與曼氏血吸蟲(chóng)鎘金屬硫蛋白前體序列的226個(gè)氨基酸僅在N端（第5～103位氨基酸）相似度較高，而后者的半胱氨酸主要位于其C端（第122～216位氨基酸）．另一方面，同源性比對(duì)結(jié)果表明，除曼氏血吸蟲(chóng)鎘金屬硫蛋白前體序列之外，與Dj＿UF－1蛋白同源性較高的均為未知功能的蛋白．由此，我們推測(cè)Dj＿UF－1基因很有可能是一個(gè)功能未知的新基因．

蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能在很大程度上依賴于其空間結(jié)構(gòu)，因而進(jìn)行蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)對(duì)于探究未知蛋白質(zhì)功能具有重要意義．通過(guò)對(duì)Dj＿UF－1蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，Dj＿UF－1與Ly－6蛋白家族的LYNX 1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)具有較高相似度．LYNX 1屬于Ly－6／neurotoxin家族，通過(guò)糖基化的磷脂酰肌醇錨（GPI anchor）連接在細(xì)胞表面，并由8～10個(gè)保守的半胱氨酸形成特定的“三指結(jié)構(gòu)”［8］．同屬于“三指結(jié)構(gòu)”蛋白的還有α－神經(jīng)毒素．“三指結(jié)構(gòu)”的最大特點(diǎn)是由四對(duì)二硫鍵形成一個(gè)球狀的疏水核心，形狀好似“手掌”，從疏水核心突出三個(gè)緊鄰的富含β－折疊的環(huán)形成“手指”（loops I，II，III）．三根“手指”一般形成輕微的凹面，“三指”結(jié)構(gòu)蛋白的功能性殘基一般分布在這個(gè)凹面上．“三指”結(jié)構(gòu)中第二根“手指”（loop II）對(duì)于蛋白與受體特異性結(jié)合具有重要作用［19，20］．另外，“三指”結(jié)構(gòu)蛋白中β－折疊的含量一般較高，最高可達(dá)40%．本研究顯示，Dj＿UF－1蛋白具有信號(hào)肽序列，且N端和C端各有一個(gè)長(zhǎng)度約為20個(gè)氨基酸的α－螺旋結(jié)構(gòu)，與LYNX 1一樣屬于跨膜蛋白．在Dj＿UF－1兩個(gè)α－螺旋結(jié)構(gòu)的中間有38個(gè)氨基酸形成6個(gè)β－折疊結(jié)構(gòu)，占氨基酸總量的25%，含量較高，符合“三指”結(jié)構(gòu)蛋白的特征．因此推測(cè)，Dj＿UF－1可能是類(lèi)LYNX 1蛋白，Dj＿UF－1基因有可能是東亞三角渦蟲(chóng)神經(jīng)系統(tǒng)的一個(gè)重要基因．

東亞三角渦蟲(chóng)的神經(jīng)細(xì)胞向頭部集中，已經(jīng)具有原始的中樞神經(jīng)系統(tǒng)．Dj＿UF－1基因在東亞三角渦蟲(chóng)頭部的表達(dá)量顯著高于其在尾部的表達(dá)量，提示Dj＿UF－1蛋白可能在東亞三角渦蟲(chóng)的神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮功能．同時(shí)有研究指出，lynx1基因在脊椎動(dòng)物腦部一些離散的神經(jīng)元群體中高度表達(dá)．Dj＿UF－1蛋白與LYNX 1蛋白高水平表達(dá)部位的一致性，結(jié)合兩者三級(jí)結(jié)構(gòu)的相似性，提示Dj＿UF－1為類(lèi)LYNX 1蛋白，Dj＿UF－1基因是東亞三角渦蟲(chóng)神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)基因．

4 結(jié)論

本研究結(jié)合生物信息學(xué)分析及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，研究了東亞三角渦蟲(chóng)新基因Dj＿UF－1的功能．初步證實(shí)Dj＿UF－1為類(lèi)LYNX 1蛋白，Dj＿UF－1基因是東亞三角渦蟲(chóng)神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)基因，為進(jìn)一步探索該基因功能指明方向．Dj＿UF－1基因雖然在渦蟲(chóng)頭部高表達(dá)，但是其表達(dá)部位是否與nAChRs的位置一致；Dj＿UF－1是否同LYNX 1一樣，能與nAChRs結(jié)合并抑制其活性；如果Dj＿UF－1可以抑制nAChRs的活性，其機(jī)制是否與LYNX 1一致，這些問(wèn)題還有待于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步研究證實(shí)，從而為Dj＿UF－1基因功能的研究和東亞三角渦蟲(chóng)基因組數(shù)據(jù)的完善提供理論依據(jù)．

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