丹參錨蛋白重復(fù)序列家族基因的克隆和表達(dá)分析

張 璇，庫里滿·恰里甫，武玉翠，王喆之

（陜西師范大學(xué) 藥用資源與天然藥物化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西北瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安710062）

錨蛋白重復(fù)序列（Ankyrin Repeat，ARP）是普遍存在于真核、原核及病毒中的一種蛋白質(zhì)序列模體，它是蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中出現(xiàn)頻率最高的氨基酸模塊之一［1］．ARP在許多種功能蛋白中存在，參與了一系列的細(xì)胞學(xué)和生物學(xué)過程，如細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、線粒體酶、細(xì)胞骨架形成、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和解毒等［2］．ARP作為蛋白與蛋白相互作用的結(jié)構(gòu)平臺［3］，對于由多種信號途徑調(diào)控的細(xì)胞發(fā)育過程來說可能起重要作用．

目前對植物中錨蛋白重復(fù)序列的研究主要集中在擬南芥和水稻兩種植物中．在擬南芥基因組中共有105個基因可以編碼ARP的蛋白，蛋白的數(shù)目達(dá)到509個［4］．從水稻中已經(jīng)得到一種新的水稻抗逆相關(guān)基因－水稻錨定序列重復(fù)蛋白基因（Rice ankyrin－repeat protein，Rap）及其編碼的蛋白．這種水稻錨定序列重復(fù)蛋白基因已經(jīng)證實(shí)是抗逆相關(guān)基因，尤其可以在植物品種改良和雜交育種中用于改變植物的耐鹽性和／或抗旱性［5］．在其他植物如煙草［6］和苜蓿［7］等中也有少量報道．

丹參（Salvia miltiorrhiza Bunge）具有重要的藥用價值，具有活血調(diào)經(jīng)、祛瘀生新、鎮(zhèn)靜安神、涼血消癰、消腫止痛等功效［8］．本文從丹參中克隆得到編碼ARP基因的cDNA序列，采用生物信息學(xué)方法對其推導(dǎo)的氨基酸序列、二級和三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測和分析，采用實(shí)時熒光定量PCR檢測了其在丹參不同器官中的表達(dá)特性．

1 材料與方法

依據(jù)丹參EST庫序列，采用Primer Premier 5．0設(shè)計了RT－PCR擴(kuò)增引物ARP－S（5｀CTACAATGCCAGAGTTTGAGGT3｀）和ARP－A（5｀CAAGGTAGTTGCCAAGAATCC3｀）．丹參種子（采自陜西天士力植物藥業(yè)商洛有限公司商州藥源基地）種于含蛭石的營養(yǎng)缽中，放于人工氣候箱（寧波江南儀器廠，型號為RXZ－500D）中培養(yǎng)（溫度25±2℃，濕度48%，光照強(qiáng)度216μmol m2／s，光照時間16h／d）．RNA提取試劑pBIOZOL購自BioFlux，Bio RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于杭州博日科技有限公司．RNA提取和第一鏈cDNA合成嚴(yán)格按照試劑盒說明書完成．采用降落PCR［9］的方法進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)?2℃變性3min；92℃變性30s，59℃退火60 s，每4個循環(huán)下降1℃，直到54℃，72℃延伸90 s，92℃變性30s，54℃退火60s，72℃延伸90s，20個循環(huán)．

72℃延伸10min．?dāng)U增片段經(jīng)凝膠回收（試劑盒購自安徽優(yōu)晶生物工程有限公司）插入載體PMD19－T simple vector（寶生物公司）后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中，送至上海捷瑞生物公司測序．

依據(jù)http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／、http：／／www．cbs．dtu．dk／、http：／／cn．expasy．org／等網(wǎng)站提供的各類生物信息學(xué)軟件進(jìn)行在線分析．氨基酸序列的理化性質(zhì)分析、開放閱讀框（Open reading frame，ORF）的查找和翻譯利用ProtParam、ORF Finder在線工具；蛋白質(zhì)信號肽的預(yù)測、跨膜結(jié)構(gòu)域、親水性／疏水性、三維結(jié)構(gòu)的分析利用在線工具SignaIP、TMHMM、ProtScale、Swiss model完成［10］．

以丹參根、莖、葉、花的cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)．進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR檢測時，以丹參持家基因GAPDH（glyceraldehyde 3－phosphate dehydrogenase，3－磷酸甘油醛脫氫酶）為內(nèi)參（引物5′－CCACCGTCCACTCCATCACT－3′和5′－TGGGAACTCGGAACGACATAC－3′），檢測Sm ARP（引物5′－ACGCCCTAGTCGGTCTGCTT－3′和5′－TCCCGCAGAACTCCTCACAT－3′）的表達(dá)量．反應(yīng)條件：95℃變性3min；95℃變性10s，60℃退火30s，40個循環(huán)．每個樣品3個重復(fù)．

2 結(jié)果與討論

2．1 基因的克隆

對丹參EST序列進(jìn)行Blast分析，發(fā)現(xiàn)一條序列與錨蛋白重復(fù)序列基因有較高的相似性，在此基礎(chǔ)上設(shè)計引物，從cDNA克隆到該基因的全長．該基因序列全長587bp，包含510bp的ORF框，編碼169個氨基酸（圖1）．提取丹參總mRNA經(jīng)RTPCR擴(kuò)增出特異條帶，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測的結(jié)果顯示在500－750bp間有明顯條帶（圖2）．經(jīng)測序驗(yàn)證該片段包含該基因完整的ORF框，與電子克隆的序列完全吻合．

圖1 SmARP基因序列及編碼的氨基酸序列Fig．1 Nucleotide sequence of SmARP and the deduced amino acids．

2．2 氨基酸序列同源性分析

使用Blastp用上述核苷酸序列所推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對的結(jié)果表明，SmARP所推導(dǎo)的氨基酸序列與已報道的其他植物，如水稻（Oryza sativa，NP＿001045598）、擬南芥（Arabidopsis thaliana，NP＿568184）、玉米（Zea mays，ACG32489）、蓖麻（Ricinus communis，XP＿002531897）的一致性（Identities）分別是73%、67%、71%和76%．由此說明克隆到的基因?yàn)锳RP基因，并揭示出不同植物中ARP基因編碼的氨基酸序列間具有高度的相似性．

圖2 PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig．2 The reslut of PCR

2．3 蛋白質(zhì)的組成和理化性質(zhì)分析

用Protparam和pI／MV對丹參、水稻、擬南芥的ARP基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行分析的結(jié)果（表1）表明，各植物中ARP基因編碼的氨基酸序列長度變化不大，等電點(diǎn)、分子質(zhì)量和理論等電點(diǎn)也基本一致，并且編碼的蛋白都屬于穩(wěn)定蛋白分子．說明SmARP與其他植物的ARP基本性質(zhì)是相似的．而動物中ARP基因編碼的氨基酸序列較長、分子質(zhì)量大，等電點(diǎn)偏堿性．

用ProtScale程序?qū)mARP編碼的氨基酸序列進(jìn)行親水性疏水性分析的結(jié)果（圖3）表明，第21位天冬氨酸（Asp）親水性最強(qiáng)（分值為－2．844），第120位天冬酰胺（Asn）疏水性最強(qiáng)（分值1．311）從總體上看，大部分氨基酸分值為負(fù)值，屬于親水性氨基酸．所以SmARP編碼的氨基酸序列屬親水蛋白．

表1 不同植物SmARP的理化性質(zhì)比較Tab．1 Multiple analysis of SmARP sequences of different species

用SignalP 3．0工具對SmARP蛋白進(jìn)行信號肽預(yù)測，預(yù)測結(jié)果顯示該蛋白無信號肽．用TMHMM 2．0對SmARP氨基酸序列的跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示該蛋白無跨膜區(qū)域．

圖3 SmARP疏水性／親水性的預(yù)測Fig．3 Predicted hydrophobicity／hydrophilicity of SmARP

2．4 蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)預(yù)測

用SOPMA對該基因所編碼的氨基酸進(jìn)行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測．蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示該蛋白主要由39．64%的α螺旋，42．01%的無規(guī)卷曲構(gòu)成．

圖4 SmARP蛋白的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig．4 The three dimensional structure model of SmARP

采用Swiss－model程序?qū)mARP基因編碼蛋白進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)建模分析．并采用MOLMOL 1．2視圖軟件進(jìn)行視圖，結(jié)果如圖6所示．SmARP基因編碼蛋白三維結(jié)構(gòu)模型中每個ARP折疊成兩個反向平行的α－螺旋，每兩個α－螺旋中間形成一個長環(huán)．這個重復(fù)序列模塊是很規(guī)范的螺旋－環(huán)－螺旋結(jié)構(gòu)，重復(fù)序列的數(shù)量為3個．Sedgwick和Smerdon利用X射線得到的ARP結(jié)構(gòu)［2］中每個ARP折疊成兩個反向平行的α－螺旋，中間形成一個β發(fā)夾或一個長環(huán)．每個ANK重復(fù)都有一個非常完美的結(jié)構(gòu)：除了在主環(huán)區(qū)域有一些例外的插入序列外，這個重復(fù)序列模塊幾乎都是很規(guī)范的螺旋－環(huán)－螺旋－β－發(fā)夾或環(huán)．含ANK重復(fù)的各種蛋白中，其ANK重復(fù)數(shù)目變化范圍在0－33個，但大多數(shù)的含量少于6個［1］．說明SmARP基因編碼蛋白具有典型的ANK repeat．

用Blast－Conserved Domains Search分 析SmARP基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)域的結(jié)果顯示，在22－140位氨基酸間含有ANK結(jié)構(gòu)域，該蛋白屬于ARP超家族．

將SmARP與擬南芥、水稻、玉米、蓖麻中ARP氨基酸序列利用clustalx1．83進(jìn)行多序列比對，分析的結(jié)果表明，這4種植物中的ARP氨基酸序列從22位氨基酸開始同源性很高，這與功能結(jié)構(gòu)域分析的結(jié)果是一致的．

2．5 基因表達(dá)分析

以丹參GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，進(jìn)行SmARP基因的熒光定量分析，結(jié)果顯示（圖5），該基因?yàn)闃?gòu)成型表達(dá)基因，在丹參的根、莖、葉中均有表達(dá)，以花中表達(dá)最豐富，根中表達(dá)量最低．

圖5 SmARP基因表達(dá)的實(shí)時定量分析結(jié)果Fig．5 The results of relative SmARP mRNA expression by real－time PCR

3 結(jié)論

本研究從丹參中克隆到了SmARP基因．對SmARP基因和水稻、擬南芥的ARP基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對，發(fā)現(xiàn)有較高的一致性，而且它們編碼的蛋白都屬于堿性不穩(wěn)定蛋白．這表明丹參ARP基因的功能可能與在水稻、擬南芥中的相似，即在防御系統(tǒng)中起作用．關(guān)于ARP基因在植物防御系統(tǒng)中的具體作用有待進(jìn)一步的研究．

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