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    丹參錨蛋白重復(fù)序列家族基因的克隆和表達(dá)分析

    2013-10-29 09:32:26庫里滿恰里甫武玉翠王喆之
    關(guān)鍵詞:擬南芥丹參克隆

    張 璇,庫里滿·恰里甫,武玉翠,王喆之

    (陜西師范大學(xué) 藥用資源與天然藥物化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,西北瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實(shí)驗(yàn)室,陜西 西安710062)

    錨蛋白重復(fù)序列(Ankyrin Repeat,ARP)是普遍存在于真核、原核及病毒中的一種蛋白質(zhì)序列模體,它是蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中出現(xiàn)頻率最高的氨基酸模塊之一[1].ARP在許多種功能蛋白中存在,參與了一系列的細(xì)胞學(xué)和生物學(xué)過程,如細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、線粒體酶、細(xì)胞骨架形成、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和解毒等[2].ARP作為蛋白與蛋白相互作用的結(jié)構(gòu)平臺[3],對于由多種信號途徑調(diào)控的細(xì)胞發(fā)育過程來說可能起重要作用.

    目前對植物中錨蛋白重復(fù)序列的研究主要集中在擬南芥和水稻兩種植物中.在擬南芥基因組中共有105個基因可以編碼ARP的蛋白,蛋白的數(shù)目達(dá)到509個[4].從水稻中已經(jīng)得到一種新的水稻抗逆相關(guān)基因-水稻錨定序列重復(fù)蛋白基因(Rice ankyrin-repeat protein,Rap)及其編碼的蛋白.這種水稻錨定序列重復(fù)蛋白基因已經(jīng)證實(shí)是抗逆相關(guān)基因,尤其可以在植物品種改良和雜交育種中用于改變植物的耐鹽性和/或抗旱性[5].在其他植物如煙草[6]和苜蓿[7]等中也有少量報道.

    丹參(Salvia miltiorrhiza Bunge)具有重要的藥用價值,具有活血調(diào)經(jīng)、祛瘀生新、鎮(zhèn)靜安神、涼血消癰、消腫止痛等功效[8].本文從丹參中克隆得到編碼ARP基因的cDNA序列,采用生物信息學(xué)方法對其推導(dǎo)的氨基酸序列、二級和三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測和分析,采用實(shí)時熒光定量PCR檢測了其在丹參不同器官中的表達(dá)特性.

    1 材料與方法

    依據(jù)丹參EST庫序列,采用Primer Premier 5.0設(shè)計了RT-PCR擴(kuò)增引物ARP-S(5`CTACAATGCCAGAGTTTGAGGT3`)和ARP-A(5`CAAGGTAGTTGCCAAGAATCC3`).丹參種子(采自陜西天士力植物藥業(yè)商洛有限公司商州藥源基地)種于含蛭石的營養(yǎng)缽中,放于人工氣候箱(寧波江南儀器廠,型號為RXZ-500D)中培養(yǎng)(溫度25±2℃,濕度48%,光照強(qiáng)度216μmol m2/s,光照時間16h/d).RNA提取試劑pBIOZOL購自BioFlux,Bio RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于杭州博日科技有限公司.RNA提取和第一鏈cDNA合成嚴(yán)格按照試劑盒說明書完成.采用降落PCR[9]的方法進(jìn)行PCR反應(yīng),反應(yīng)程序?yàn)?2℃變性3min;92℃變性30s,59℃退火60 s,每4個循環(huán)下降1℃,直到54℃,72℃延伸90 s,92℃變性30s,54℃退火60s,72℃延伸90s,20個循環(huán).

    72℃延伸10min.?dāng)U增片段經(jīng)凝膠回收(試劑盒購自安徽優(yōu)晶生物工程有限公司)插入載體PMD19-T simple vector(寶生物公司)后,轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中,送至上海捷瑞生物公司測序.

    依據(jù)http://www.ncbi.nlm.nih.gov/、http://www.cbs.dtu.dk/、http://cn.expasy.org/等網(wǎng)站提供的各類生物信息學(xué)軟件進(jìn)行在線分析.氨基酸序列的理化性質(zhì)分析、開放閱讀框(Open reading frame,ORF)的查找和翻譯利用ProtParam、ORF Finder在線工具;蛋白質(zhì)信號肽的預(yù)測、跨膜結(jié)構(gòu)域、親水性/疏水性、三維結(jié)構(gòu)的分析利用在線工具SignaIP、TMHMM、ProtScale、Swiss model完成[10].

    以丹參根、莖、葉、花的cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng).進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR檢測時,以丹參持家基因GAPDH(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,3-磷酸甘油醛脫氫酶)為內(nèi)參(引物5′-CCACCGTCCACTCCATCACT-3′和5′-TGGGAACTCGGAACGACATAC-3′),檢測Sm ARP(引物5′-ACGCCCTAGTCGGTCTGCTT-3′和5′-TCCCGCAGAACTCCTCACAT-3′)的表達(dá)量.反應(yīng)條件:95℃變性3min;95℃變性10s,60℃退火30s,40個循環(huán).每個樣品3個重復(fù).

    2 結(jié)果與討論

    2.1 基因的克隆

    對丹參EST序列進(jìn)行Blast分析,發(fā)現(xiàn)一條序列與錨蛋白重復(fù)序列基因有較高的相似性,在此基礎(chǔ)上設(shè)計引物,從cDNA克隆到該基因的全長.該基因序列全長587bp,包含510bp的ORF框,編碼169個氨基酸(圖1).提取丹參總mRNA經(jīng)RTPCR擴(kuò)增出特異條帶,用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測的結(jié)果顯示在500-750bp間有明顯條帶(圖2).經(jīng)測序驗(yàn)證該片段包含該基因完整的ORF框,與電子克隆的序列完全吻合.

    圖1 SmARP基因序列及編碼的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide sequence of SmARP and the deduced amino acids.

    2.2 氨基酸序列同源性分析

    使用Blastp用上述核苷酸序列所推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對的結(jié)果表明,SmARP所推導(dǎo)的氨基酸序列與已報道的其他植物,如水稻(Oryza sativa,NP_001045598)、擬南芥(Arabidopsis thaliana,NP_568184)、玉米(Zea mays,ACG32489)、蓖麻(Ricinus communis,XP_002531897)的一致性(Identities)分別是73%、67%、71%和76%.由此說明克隆到的基因?yàn)锳RP基因,并揭示出不同植物中ARP基因編碼的氨基酸序列間具有高度的相似性.

    圖2 PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 The reslut of PCR

    2.3 蛋白質(zhì)的組成和理化性質(zhì)分析

    用Protparam和pI/MV對丹參、水稻、擬南芥的ARP基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行分析的結(jié)果(表1)表明,各植物中ARP基因編碼的氨基酸序列長度變化不大,等電點(diǎn)、分子質(zhì)量和理論等電點(diǎn)也基本一致,并且編碼的蛋白都屬于穩(wěn)定蛋白分子.說明SmARP與其他植物的ARP基本性質(zhì)是相似的.而動物中ARP基因編碼的氨基酸序列較長、分子質(zhì)量大,等電點(diǎn)偏堿性.

    用ProtScale程序?qū)mARP編碼的氨基酸序列進(jìn)行親水性疏水性分析的結(jié)果(圖3)表明,第21位天冬氨酸(Asp)親水性最強(qiáng)(分值為-2.844),第120位天冬酰胺(Asn)疏水性最強(qiáng)(分值1.311)從總體上看,大部分氨基酸分值為負(fù)值,屬于親水性氨基酸.所以SmARP編碼的氨基酸序列屬親水蛋白.

    表1 不同植物SmARP的理化性質(zhì)比較Tab.1 Multiple analysis of SmARP sequences of different species

    用SignalP 3.0工具對SmARP蛋白進(jìn)行信號肽預(yù)測,預(yù)測結(jié)果顯示該蛋白無信號肽.用TMHMM 2.0對SmARP氨基酸序列的跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測,結(jié)果顯示該蛋白無跨膜區(qū)域.

    圖3 SmARP疏水性/親水性的預(yù)測Fig.3 Predicted hydrophobicity/hydrophilicity of SmARP

    2.4 蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)預(yù)測

    用SOPMA對該基因所編碼的氨基酸進(jìn)行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測.蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示該蛋白主要由39.64%的α螺旋,42.01%的無規(guī)卷曲構(gòu)成.

    圖4 SmARP蛋白的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4 The three dimensional structure model of SmARP

    采用Swiss-model程序?qū)mARP基因編碼蛋白進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)建模分析.并采用MOLMOL 1.2視圖軟件進(jìn)行視圖,結(jié)果如圖6所示.SmARP基因編碼蛋白三維結(jié)構(gòu)模型中每個ARP折疊成兩個反向平行的α-螺旋,每兩個α-螺旋中間形成一個長環(huán).這個重復(fù)序列模塊是很規(guī)范的螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu),重復(fù)序列的數(shù)量為3個.Sedgwick和Smerdon利用X射線得到的ARP結(jié)構(gòu)[2]中每個ARP折疊成兩個反向平行的α-螺旋,中間形成一個β發(fā)夾或一個長環(huán).每個ANK重復(fù)都有一個非常完美的結(jié)構(gòu):除了在主環(huán)區(qū)域有一些例外的插入序列外,這個重復(fù)序列模塊幾乎都是很規(guī)范的螺旋-環(huán)-螺旋-β-發(fā)夾或環(huán).含ANK重復(fù)的各種蛋白中,其ANK重復(fù)數(shù)目變化范圍在0-33個,但大多數(shù)的含量少于6個[1].說明SmARP基因編碼蛋白具有典型的ANK repeat.

    用Blast-Conserved Domains Search分 析SmARP基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)域的結(jié)果顯示,在22-140位氨基酸間含有ANK結(jié)構(gòu)域,該蛋白屬于ARP超家族.

    將SmARP與擬南芥、水稻、玉米、蓖麻中ARP氨基酸序列利用clustalx1.83進(jìn)行多序列比對,分析的結(jié)果表明,這4種植物中的ARP氨基酸序列從22位氨基酸開始同源性很高,這與功能結(jié)構(gòu)域分析的結(jié)果是一致的.

    2.5 基因表達(dá)分析

    以丹參GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參,進(jìn)行SmARP基因的熒光定量分析,結(jié)果顯示(圖5),該基因?yàn)闃?gòu)成型表達(dá)基因,在丹參的根、莖、葉中均有表達(dá),以花中表達(dá)最豐富,根中表達(dá)量最低.

    圖5 SmARP基因表達(dá)的實(shí)時定量分析結(jié)果Fig.5 The results of relative SmARP mRNA expression by real-time PCR

    3 結(jié)論

    本研究從丹參中克隆到了SmARP基因.對SmARP基因和水稻、擬南芥的ARP基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對,發(fā)現(xiàn)有較高的一致性,而且它們編碼的蛋白都屬于堿性不穩(wěn)定蛋白.這表明丹參ARP基因的功能可能與在水稻、擬南芥中的相似,即在防御系統(tǒng)中起作用.關(guān)于ARP基因在植物防御系統(tǒng)中的具體作用有待進(jìn)一步的研究.

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