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    MTT法評(píng)價(jià)3種雞腿菇多糖的體外抗腫瘤活性

    2013-10-29 09:32:28李佳媚劉娜女孫潤(rùn)廣
    關(guān)鍵詞:雞腿菇羧甲基酯化

    李佳媚,劉娜女,孫潤(rùn)廣

    (陜西師范大學(xué) 物理學(xué)與信息技術(shù)學(xué)院,陜西 西安710062)

    多糖在生物體的生長(zhǎng)和發(fā)育方面起著非常重要的作用,由于多糖具有獨(dú)特的生物、化學(xué)和物理特性,近年來對(duì)多糖的研究非常廣泛,已有研究表明大部分中草藥多糖都具有特異性抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)且相對(duì)毒性較低的特點(diǎn)[1].目前對(duì)菌類多糖的研究也較多,許多專家學(xué)者的研究表明香菇多糖能顯著的抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[2-3],除了香菇多糖外,許多真菌多糖都具有很好的生物活性.雞腿菇作為一種藥食兼用的真菌具有豐富的藥用保健活性,已經(jīng)有的研究表明:雞腿菇中含有豐富的生物活性成分,如糖類和蛋白質(zhì)等,雞腿菇多糖具有抗氧化、降血壓、防止肝硬化、提高免疫力、抗菌、抗腫瘤等功效[4-5].

    目前對(duì)植物多糖的研究非常廣泛,有學(xué)者的研究表明超聲提取的龍眼多糖的理化性質(zhì)發(fā)生了改變,并且超聲處理可引起多糖微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[6],超聲處理高直鏈玉米淀粉后多糖的分子量發(fā)生降解,黏性下降,水溶性升高[7];許多學(xué)者的研究表明硫酸化修飾后的多糖的抗腫瘤活性明顯增強(qiáng)[8-9],文獻(xiàn)[10]報(bào)道等對(duì)平菇多糖進(jìn)行硫酸化修飾后多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用顯著且呈現(xiàn)出劑量依賴效應(yīng).文獻(xiàn)[11]研究發(fā)現(xiàn)硫酸酯化修飾的多糖對(duì)HepG2細(xì)胞的入侵與遷移有抑制作用并且具有劑量依賴效應(yīng);對(duì)多糖進(jìn)行羧甲基化修飾也會(huì)使多糖的結(jié)構(gòu)性質(zhì)等發(fā)生改變[12].因此對(duì)多糖進(jìn)行不同的化學(xué)方法處理會(huì)影響多糖的理化性質(zhì)及生物活性.本實(shí)驗(yàn)采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法[13-14]評(píng)價(jià)超聲輔助提取雞腿菇多糖經(jīng)季銨鹽沉淀分級(jí)得到的堿性組分(UCP-3)、經(jīng)過硫酸酯化修飾的雞腿菇多糖(SWCP)和經(jīng)過羧甲基化修飾的雞腿菇多糖(CWCP)對(duì)人白血病K562細(xì)胞的體外增殖的影響作用,并分析比較不同的提取方法和化學(xué)修飾對(duì)雞腿菇多糖體外抗腫瘤活性的影響.

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    1.1.1 材料 雞腿菇相關(guān)多糖WCP、UCP-3、SWCP、CWCP,由陜西師范大學(xué)生物物理與生物醫(yī)學(xué)工程研究室制備;K562細(xì)胞來自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心.

    1.1.2 試劑 主要試劑包括:無支原體新生牛血清,浙江天杭生物科技有限公司;RPMI Medium 1640,美國(guó)Gibco公司;MTT,美國(guó)Amresco公司;DMSO;醫(yī)用酒精;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭粚?shí)驗(yàn)所用水均為三次蒸餾水.

    1.2 儀器

    Olympus TH4-200倒置顯微鏡,日本奧林巴斯公司;HH.CP-01W型二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱,上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;YP601N電子天平,上海精密科學(xué)儀器有限公司;TDL80-2B臺(tái)式離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠;DG5032型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀,南京華東電子集團(tuán)醫(yī)療儀器設(shè)備有限責(zé)任公司;SZ-97自動(dòng)三重純水蒸餾器,上海亞榮生化儀器廠;CF16RX高速離心機(jī),日本日立公司.

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    1.3.1 雞腿菇相關(guān)多糖的制備方法 雞腿菇相關(guān)多糖的制備具體過程如下:

    (1)雞腿菇多糖WCP制備:鮮雞腿菇烘干粉碎后稱重,加4倍體積80%乙醇脫脂(20min,3次),之后抽濾烘干并稱重,加10倍體積水沸水浴煮2.5 h,重復(fù)3次,室溫下4 000r/min離心10min,上清液經(jīng)真空濃縮后醇沉,沉淀透析3d,冷凍干燥后即得沸水浴法提取雞腿菇多糖WCP.

    (2)超聲提取雞腿菇多糖UCP-3制備:參照文獻(xiàn)[15]的方法,鮮雞腿菇烘干粉碎后稱重,加4倍體積80%乙醇脫脂(20min,3次),之后抽濾烘干并稱重,加10倍體積水后超聲波提取15min(每次10s、90次、間隔15s,功率300W)重復(fù)提取3次后室溫下4 000r/min離心10min,上清液經(jīng)真空濃縮后醇沉,沉淀透析3d,冷凍干燥后即得超聲輔助法提取雞腿菇粗多糖UCP,經(jīng)季銨鹽沉淀后取堿性組分UCP-3備用.

    (3)硫酸酯化雞腿菇多糖SWCP的制備:參照李國(guó)榮[16]等的方法.采用氯磺酸-吡啶法制備硫酸酯化雞腿菇多糖,在酯化試劑體積比為V(氯磺酸)∶V(吡啶)為1∶3,反應(yīng)溫度保持在90℃,反應(yīng)時(shí)間2h的條件下制備SWCP,保存?zhèn)溆茫?/p>

    (4)羧甲基化雞腿菇多糖CWCP的制備:參照周瑞[17]等的方法.將0.5g雞腿菇多糖溶解于38 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的NaOH溶液中,攪拌1h;然后加入溶有6g氯乙酸的異丙醇混合溶液50mL,保持55℃反應(yīng)5h;停止反應(yīng)冷卻至室溫,調(diào)節(jié)pH值為中性,透析3d;冷凍干燥即得CWCP,保存?zhèn)溆茫?/p>

    1.3.2 MTT法檢測(cè)不同雞腿菇多糖對(duì)K562細(xì)胞的體外增殖抑制活性 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的狀態(tài)良好的K562細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL接種到96孔板中,每孔100μL細(xì)胞懸液,放入37℃,5%二氧化碳和飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)24h后,調(diào)零孔和對(duì)照組每孔加入100μL無血清培養(yǎng)基溶液,實(shí)驗(yàn)組每孔分別加入100μL的WCP、UCP-3、SWCP和CWCP糖溶液(濃度分別為25、50、100、200和400μg/mL),每組做6個(gè)平行,繼續(xù)分別培養(yǎng)24,48和72h后,每孔加入5mg/mL的MTT溶液20μL放入孵箱培養(yǎng)4h,1 000r/min離心5min,棄去上清液,每孔加入200μL的DMSO,輕微振蕩15 min,用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在492nm下測(cè)光吸收值OD.按照如下公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率:細(xì)胞增殖

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    2 結(jié)果與分析

    2.1 雞腿菇多糖WCP對(duì)K562細(xì)胞體外增殖的作用

    雞腿菇多糖WCP體外對(duì)K562細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用觀察結(jié)果見表1和圖1.對(duì)不同濃度的雞腿菇多糖WCP對(duì)K562細(xì)胞作用不同時(shí)間的MTT比色結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析,表明各組間沒有顯著性差異,由結(jié)果可知,雞腿菇多糖WCP對(duì)K562細(xì)胞的生長(zhǎng)幾乎沒有抑制作用.

    表1 不同濃度WCP作用不同時(shí)間后MTT比色結(jié)果Tab.1 The MTT result of different concentration WCP at different time

    圖1 不同濃度WCP作用K562細(xì)胞24h,48h和72h后細(xì)胞增殖抑制率Fig.1 Inhibition ratio of K562cells after treated with WCP in different concentrations for 24h,48hand 72h

    2.2 超聲提取雞腿菇多糖UCP-3對(duì)K562細(xì)胞體外增殖的作用

    超聲提取得到的雞腿菇多糖UCP-3對(duì)K562細(xì)胞體外生長(zhǎng)影響結(jié)果如表2和圖2所示.從中可以發(fā)現(xiàn)超聲提取雞腿菇多糖UCP-3對(duì)K562細(xì)胞體外增殖具有抑制作用,在雞腿菇多糖UCP-3濃度為25~100μg/mL之間及作用時(shí)間為24h時(shí)抑制作用沒有顯著性差異,其余濃度點(diǎn)和時(shí)間點(diǎn)的抑制作用均顯著(P<0.05或P<0.01),隨著多糖濃度和時(shí)間的增加抑制作用逐漸增強(qiáng),具有濃度效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng),當(dāng)超聲提取雞腿菇多糖UCP-3的濃度為400μg/mL和作用時(shí)間為72h時(shí)抑制效果最好,抑制率可達(dá)到27.90%(P<0.01).有學(xué)者研究表明超聲波會(huì)改變多糖的空間結(jié)構(gòu)[18-19],超聲波對(duì)多糖進(jìn)行處理后會(huì)使多糖鏈中更多的官能團(tuán)暴露,從而促進(jìn)其生物活性的表達(dá).劉娜女的研究表明UCP-3為分子量單一且不含糖醛酸、蛋白質(zhì)、多肽和核酸等雜質(zhì)的多糖,由此可說明超聲提取的雞腿菇多糖UCP-3是相對(duì)純的生物多糖,排除了雞腿菇中其他組分的干擾,具有抑制人白血病K562細(xì)胞體外增殖的活性.

    表2 不同濃度UCP-3作用不同時(shí)間后MTT比色結(jié)果Tab.2 The MTT result of different concentration UCP-3at different time

    圖2 不同濃度UCP-3作用K562細(xì)胞24h,48h和72h后細(xì)胞增殖抑制率Fig.2 Inhibition ratio of K562cells after treated with UCP-3in different concentrations for 24h,48hand 72h

    2.3 硫酸酯化雞腿菇多糖SWCP對(duì)K562細(xì)胞體外增殖的作用

    硫酸酯化修飾的雞腿菇多糖SWCP對(duì)K562細(xì)胞的體外生長(zhǎng)影響結(jié)果如表3和圖3所示.雞腿菇多糖經(jīng)過硫酸酯化修飾后對(duì)K562細(xì)胞的體外增殖表現(xiàn)出明顯的抑制作用,并且隨著多糖濃度和時(shí)間的增加抑制作用逐漸增強(qiáng),具有濃度效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng).單因素方差分析結(jié)果顯示硫酸酯化雞腿菇多糖對(duì)K562細(xì)胞的體外增殖抑制除濃度為25μg/mL與作用時(shí)間24h時(shí)不具有顯著性差異外,其余作用點(diǎn)均表現(xiàn)出顯著性差異(P<0.05或P<0.01),當(dāng)硫酸酯化雞腿菇多糖的濃度為400μg/mL和作用時(shí)間為72h時(shí)它對(duì)K562細(xì)胞的體外生長(zhǎng)抑制率最高可達(dá)到38.95%.多糖的生物活性與其結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)緊密相關(guān),多糖硫酸酯化修飾后由于所帶硫酸基團(tuán)的空間位阻和靜電排斥效應(yīng)改變了多糖原來的空間結(jié)構(gòu),增加了糖鏈的屈伸度,提高了水溶性,從而引起生物活性的改變[20].硫酸酯化多糖處理癌細(xì)胞使細(xì)胞膜損壞或裂解成碎片,細(xì)胞漿濃縮和誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)早期凋亡[21],從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng).

    表3 不同濃度SWCP作用不同時(shí)間后MTT比色結(jié)果Tab.3 The MTT result of different concentration SWCP at different time

    圖3 不同濃度SWCP作用K562細(xì)胞24h,48h和72h后細(xì)胞增殖抑制率Fig.3 Inhibition ratio of K562cells after treated with SWCP in different concentrations for 24h,48hand 72h

    2.4 CWCP對(duì)K562細(xì)胞體外增殖的作用

    羧甲基化修飾的雞腿菇多糖CWCP對(duì)K562細(xì)胞的體外生長(zhǎng)影響結(jié)果如表4和圖4所示.羧甲基化雞腿菇多糖對(duì)K562細(xì)胞的體外增殖抑制在每個(gè)作用點(diǎn)均具有顯著性(P<0.01),雞腿菇多糖經(jīng)過羧甲基化修飾后對(duì)K562細(xì)胞的體外增殖表現(xiàn)出抑制作用,隨著多糖濃度的升高抑制作用逐漸增強(qiáng),隨著作用時(shí)間的增加抑制作用逐漸減弱,魏文青等[22]的研究表明腫瘤藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)具有一個(gè)最佳的作用時(shí)間,在最佳作用時(shí)間之前隨著作用時(shí)間的增加其抑制作用增強(qiáng),超過這個(gè)最佳作用時(shí)間后抑制作用隨著時(shí)間的增長(zhǎng)而減弱.在羧甲基化雞腿菇多糖的濃度為400μg/mL和作用時(shí)間為24h是抑制率最高可達(dá)到31.17%.目前已經(jīng)有研究表明對(duì)多糖進(jìn)行化學(xué)修飾有助于提高其生物學(xué)活性,羧甲基化多糖能夠顯著提高多糖的電負(fù)性和水溶性,進(jìn)而增強(qiáng)多糖的生物活性[23];此外化學(xué)基團(tuán)的引入也可能會(huì)增強(qiáng)多糖的活性,使多糖產(chǎn)生新的活性,具體還有待進(jìn)一步研究.

    表4 不同濃度CWCP作用不同時(shí)間后MTT比色結(jié)果Tab.4 The MTT result of different concentration CWCP at different time

    圖4 不同濃度CWCP作用K562細(xì)胞24h,48h和72h后細(xì)胞增殖抑制率Fig.4 Inhibition ratio of K562cells after treated with CWCP in different concentrations for 24h,48hand 72h

    3 小結(jié)與討論

    對(duì)3種不同的雞腿菇多糖的體外抗腫瘤活性進(jìn)行了研究,結(jié)果表明對(duì)多糖采用不同方法提取與化學(xué)修飾會(huì)影響多糖的體外抗腫瘤活性,并且影響效果不同,化學(xué)修飾后多糖的抗腫瘤活性有所提高,這與很多文獻(xiàn)報(bào)道一致.由此可見對(duì)雞腿菇多糖進(jìn)行不同的提取方法和修飾手段處理后其體外生物活性會(huì)發(fā)生變化.多糖作為一種有效的功能成分,副作用少,多種功效已經(jīng)被證明,本試驗(yàn)通過對(duì)雞腿菇多糖進(jìn)行不同的處理和結(jié)構(gòu)修飾后研究其體外抗腫瘤活性,為開發(fā)高效、低毒的多糖類抗腫瘤藥物提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù).

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