人耳聾相關(guān)基因GJB3的結(jié)構(gòu)特征及生物信息學(xué)分析

孫丹，王帥，魏欽俊，姚俊，曹新

南京醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210029

聽(tīng)力障礙是人類(lèi)最常見(jiàn)的感覺(jué)神經(jīng)紊亂，世界范圍約1000個(gè)兒童就有1例患有聽(tīng)力障礙。在中國(guó)，每年2000萬(wàn)的新生兒中有30 000例患有先天性耳聾[1]。已經(jīng)明確，在引起耳聾的各類(lèi)原因中，遺傳因素致聾已逐漸成為主導(dǎo)因素，在工業(yè)化國(guó)家至少50%耳聾病例都是遺傳因素所致[2]。遺傳性耳聾分為綜合征型耳聾（syndromic hearing loss，SHL）和非綜合征型耳聾（non-syndromic hearing loss，NSHL），其中NSHL在耳聾兒童中的發(fā)生率為80%[3-5]。NSHL具有全部的孟德?tīng)栠z傳方式及線粒體基因的母系遺傳方式，其中常染色體隱性遺傳方式約占77%，常染色體顯性遺傳方式約占22%，X連鎖和線粒體遺傳占1%～2%[6-7]。迄今，已明確超過(guò)60種基因與感音神經(jīng)性耳聾有關(guān)，還存在上百個(gè)聽(tīng)力損傷相關(guān)的基因座[8]。

間隙連接蛋白（connexin，Cx）基因是一類(lèi)最常見(jiàn)的與遺傳性耳聾相關(guān)的致聾基因。Cx是間隙連接通道的亞單位蛋白，它允許離子和相對(duì)分子質(zhì)量小于1500的代謝物在細(xì)胞間擴(kuò)散。介導(dǎo)質(zhì)膜間通訊的2個(gè)半通道又稱(chēng)為連接子，它的作用是彼此對(duì)接形成間隙連接通道，從而實(shí)現(xiàn)間隙連接細(xì)胞間的通 訊（gap functionalintercellularcommunication，GJIC）[9]。GJIC在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中具有十分重要的作用，可通過(guò)相鄰細(xì)胞的相互調(diào)控及物質(zhì)交換促進(jìn)細(xì)胞正常生長(zhǎng)與分化，當(dāng)其功能下調(diào)或喪失時(shí)，導(dǎo)致包括耳聾在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生[10]。

在耳蝸毛細(xì)胞，GJIC主要涉及3種Cx，即Cx26、Cx31和Cx30。編碼Cx26的GJB2基因是遺傳性NSHL最常見(jiàn)的耳聾基因，其突變類(lèi)型廣泛且突變率高[11-12]。而編碼Cx30、Cx31的GJB6、GJB3與GJB2相比，無(wú)論在突變譜還是致病性突變頻率上，均表現(xiàn)出明顯的差異性。因此，深入研究這2類(lèi)基因的分子結(jié)構(gòu)與進(jìn)化特征，對(duì)了解該基因家族突變致聾的分子機(jī)制是十分有益的。

我們利用生物信息學(xué)方法，對(duì)人類(lèi)GJB3基因的編碼區(qū)序列結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析和預(yù)測(cè)，為該基因后續(xù)相關(guān)功能和致病性研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇17個(gè)物種的Cx31蛋白質(zhì)序列（表1），長(zhǎng)度為257～304殘基。這17個(gè)物種分別來(lái)自哺乳綱、鳥(niǎo)綱、兩棲綱和魚(yú)綱，其中9個(gè)物種的Cx31蛋白質(zhì)序列為預(yù)測(cè)序列。

生物信息分析軟件及在線分析工具包括多序列比對(duì)軟件ClustalW2（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/）、進(jìn)化分析和進(jìn)化樹(shù)繪制軟件MEGA 5.05（http://www.megasoftware.net/）、蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)工具SWISS-MODEL（http://swissmodel.expasy.org/）、蛋白質(zhì)模建構(gòu)圖軟件 VMD1.9（http://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/vmd-1.9/）。

1.2 GJB3進(jìn)化樹(shù)繪制與分析

將17個(gè)物種（表1）的Cx31序列用MEGA5.05進(jìn)行多重序列比對(duì)，并選擇與Cx31同為縫隙連接蛋白家族的人類(lèi)Cx30作為外群（outgroup）建立NJ（Neighbor joining）樹(shù)，用Test of Phylogeny（發(fā)育檢驗(yàn)方法）選擇 Bootstrap method，Bootstrap Replica?tions（Bootstrap檢驗(yàn)次數(shù)）選擇1000，采用泊松模式建樹(shù)以獲得系統(tǒng)發(fā)育結(jié)論。

1.3 GJB3基因保守性分析

選取Cx31系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中哺乳動(dòng)物綱除鴨嘴獸外各末端節(jié)點(diǎn)處物種1種（本研究選擇了人類(lèi)、荷蘭豬、家犬、家鼠、中國(guó)倉(cāng)鼠等5個(gè)物種），用ClustalW2軟件對(duì)GJB3基因編碼蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)，計(jì)算保守位點(diǎn)百分?jǐn)?shù)。

1.4 Cx31蛋白三維結(jié)構(gòu)分析

將Cx31蛋白質(zhì)氨基酸序列提交至SWISSMODEL進(jìn)行模建，得到的pdb文件用VMD1.9軟件進(jìn)行可視化分析。依據(jù)SWISS-MODEL提供的自動(dòng)化比較蛋白質(zhì)模建服務(wù)器和SWISS-MODEL庫(kù)進(jìn)行同源模建[13-15]。

1.5 GJB3基因錯(cuò)義突變分析

為研究GJB3發(fā)生錯(cuò)義突變后三維結(jié)構(gòu)的改變，選擇了2種錯(cuò)義突變（p.E183K和p.I141V）進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)突變前后的比較，并分析了Anolea原子平均勢(shì)能。采用同源模建軟件SWISS-MODEL模建Cx31蛋白的三維結(jié)構(gòu)，用VMD1.9軟件對(duì)突變前后的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行可視化分析，最后通過(guò)Anolea原子平均勢(shì)能圖的改變?cè)u(píng)價(jià)錯(cuò)義突變對(duì)Cx31蛋白三維結(jié)構(gòu)的影響。

2 結(jié)果

2.1 GJB3系統(tǒng)發(fā)育分析

用MEGA5.05構(gòu)建的Cx31的NJ樹(shù)見(jiàn)圖1。進(jìn)化樹(shù)中哺乳綱、鳥(niǎo)綱、兩棲綱和魚(yú)綱動(dòng)物分界明晰，符合物種進(jìn)化從水生到陸生的過(guò)程。其中哺乳綱動(dòng)物除鴨嘴獸外其余各物種親緣關(guān)系接近，這與鴨嘴獸為最原始的哺乳動(dòng)物有關(guān)；另從圖中可見(jiàn)，兩棲動(dòng)物與魚(yú)類(lèi)的親緣關(guān)系更為接近，這驗(yàn)證了魚(yú)類(lèi)為兩棲類(lèi)動(dòng)物的祖先這一點(diǎn)。該NJ樹(shù)的構(gòu)建以與Cx31同家族的人類(lèi)Cx30蛋白為外群，Blast兩兩比對(duì)顯示Cx31和Cx30的同源相似度僅為45%，且該樹(shù)中Cx30成獨(dú)立一支，說(shuō)明選擇Cx30作為外群是合理的。外群的構(gòu)建增加了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的置信度。

表1 各物種的Cx31蛋白質(zhì)序列信息

2.2 GJB3保守性分析

圖1 Cx31蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖2 Cx31多序列比對(duì)結(jié)果

如圖2，用ClustalW2對(duì)GJB3編碼的蛋白質(zhì)Cx31進(jìn)行多序列比對(duì)，結(jié)果顯示Cx31完全保守和高度保守殘基的位點(diǎn)占全部氨基酸殘基的83.70%（226/270）。將Cx31的序列提交至PredictProtein后可得到氨基酸位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的各區(qū)域預(yù)測(cè)。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示Cx31蛋白有4個(gè)跨膜區(qū)（M1、M2、M3、M4）、2個(gè)胞外環(huán)（E1、E2）和3個(gè)胞漿區(qū)（N-term、CL、C-term）。經(jīng)數(shù)據(jù)分析，跨膜區(qū)平均保守度為92.31%（72/78）；胞外環(huán)平均保守度為94.12%（64/68）；胞漿區(qū)平均保守度為72.00%（90/125），其中胞漿區(qū)C端保守度極低，僅為53.97%（34/63）（表2）。

2.3 Cx31三維結(jié)構(gòu)分析

同源建模后的pdb坐標(biāo)文件用VMD1.9對(duì)Cx31蛋白進(jìn)行可視化，分析可知Cx31有6個(gè)α螺旋、3個(gè)β折疊、7個(gè)轉(zhuǎn)角、7個(gè)無(wú)規(guī)則卷曲。Cx31蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)如圖3所示，M1～M4分別為4個(gè)跨膜區(qū)。由于Cx31的同源建模是以Cx26為模板的，Cx26氨基酸殘基數(shù)目少于Cx31，所以即便Cx31存在270個(gè)氨基酸殘基，SWISS-MODEL僅提供2～212位氨基酸殘基的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)模型。也就是說(shuō)，大部分的胞漿區(qū)C端沒(méi)有被預(yù)測(cè)出來(lái)，但其他區(qū)域的結(jié)構(gòu)都得到了很好的預(yù)測(cè)。

2.4 GJB3錯(cuò)義突變分析

GJB3致病性錯(cuò)義突變很少，耳聾變異數(shù)據(jù)庫(kù)［Deafness Variation Database（http://deafnessvaria?tiondatabase.com/）］共收錄了9種導(dǎo)致NSHL的GJB3錯(cuò)義突變（表3）。

我們選擇Cx31位于跨膜區(qū)M1的p.Arg32Trp突變和位于胞外環(huán)E2的p.Glu183Lys突變，對(duì)Cx31跨膜區(qū)和胞外環(huán)突變導(dǎo)致NSHL的發(fā)生機(jī)制分別進(jìn)行分析。M1區(qū)32位Arg被Trp替代，Anolea原子平均勢(shì)能圖顯示了4個(gè)明顯變化區(qū)域（圖4），各原子勢(shì)能的增加可導(dǎo)致CX31結(jié)構(gòu)由低能量的穩(wěn)態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)檩^高能量的不穩(wěn)態(tài)。用VMD1.9對(duì)CX31進(jìn)行突變前后的結(jié)構(gòu)可視化，發(fā)現(xiàn)Anolea平均勢(shì)能圖4個(gè)明顯變化區(qū)域分別為跨膜區(qū)M1、M2、M3、M4，且4個(gè)變化區(qū)域的氨基酸殘基均與M1區(qū)32位氨基酸殘基空間結(jié)構(gòu)上接近（局部三維結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖4A，a和b）。對(duì)Cx31分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行重疊分析（圖4A，c），發(fā)現(xiàn)193～194位 Gly和 Ala，196～198位 Ala、Val和 Cys空間結(jié)構(gòu)位置發(fā)生了較明顯的改變（藍(lán)色為突變前殘基位置，紅色為突變后殘基位置）。由此推測(cè)，位于Cx31跨膜區(qū)的某氨基酸殘基改變可導(dǎo)致該蛋白其他跨膜區(qū)相近殘基空間結(jié)構(gòu)的改變，最終導(dǎo)致Cx31無(wú)法發(fā)揮其正常功能。

表2 Cx31結(jié)構(gòu)域保守度分析

表3 已報(bào)道的NSHL的GJB3錯(cuò)義突變

E2區(qū)183位Glu被Lys替代，Anolea原子平均勢(shì)能圖上可觀測(cè)到2個(gè)明顯改變區(qū)域（圖5），即E1區(qū)39～43位及E2區(qū)182～183位。在VMD1.9可視化中可看出這2個(gè)區(qū)域在空間結(jié)構(gòu)上非常接近，即可推測(cè)183位Glu被Lys替代后影響了E1和E2區(qū)局部分子的分子間作用力。Xia等對(duì)Cx31錯(cuò)義突變的實(shí)驗(yàn)研究表明p.Glu183Lys會(huì)導(dǎo)致Cx31蛋白大部分滯留在高爾基復(fù)合體，少部分在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，而在細(xì)胞與細(xì)胞間連接上沒(méi)有發(fā)現(xiàn)[16]。因此，可推測(cè)發(fā)生在E2區(qū)的錯(cuò)義突變會(huì)導(dǎo)致Cx31不能從高爾基復(fù)合體運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞膜上參與構(gòu)建細(xì)胞間的間隙連接。

3 討論

圖3 Cx31三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

圖4 野生型和p.Arg32Trp型Cx31蛋白的三維結(jié)構(gòu)和Anolea平均勢(shì)能比較

間隙連接蛋白可在相鄰細(xì)胞間形成間隙連接通道，從而介導(dǎo)小分子物質(zhì)的通訊。間隙連接蛋白在耳蝸Corti氏器的K+循環(huán)通路中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。K+流入毛細(xì)胞機(jī)械門(mén)控離子通道后，毛細(xì)胞將去極化，接著Ca2+流入基底膜，介導(dǎo)神經(jīng)遞質(zhì)釋放。間隙連接蛋白的丟失將會(huì)導(dǎo)致K+循環(huán)被破壞，Corti氏器局部K+濃度過(guò)高發(fā)生鉀中毒。GJB3基因編碼的蛋白Cx31是間隙連接蛋白家族中的重要成員，分布在身體多個(gè)組織器官上，但以皮膚和內(nèi)耳最多，其突變可導(dǎo)致可變性紅斑皮膚角化病（EKV）、聽(tīng)力損傷和周?chē)窠?jīng)病變[17-18]。

圖5 野生型和p.Glu183Lys型Cx31蛋白三維結(jié)構(gòu)和Anolea平均勢(shì)能比較

為了更好地理解GJB3基因突變與NSHL發(fā)生的相關(guān)性，我們利用生物信息學(xué)軟件，從GJB3系統(tǒng)發(fā)育、保守性、三維結(jié)構(gòu)和錯(cuò)義突變角度分別進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析。Cx31在跨膜區(qū)和胞外環(huán)的保守性遠(yuǎn)高于胞漿區(qū)，胞漿區(qū)C端保守度極低。Cx26和Cx31均為間隙連接蛋白家族成員，但GJB3基因致病性突變遠(yuǎn)少于GJB2基因。對(duì)GJB2編碼蛋白Cx26的保守性分析顯示其保守度為95.58%（216/226），而同物種多序列比對(duì)顯示Cx31保守度為83.70%（226/270）。因此，Cx31的保守性低于Cx26，突變對(duì)Cx31的影響要小于Cx26，可推測(cè)這是GJB2突變致聾的人群遠(yuǎn)多于GJB3突變?cè)蛑?。?duì)已報(bào)道的p.Arg32Trp和p.Glu183Lys兩類(lèi)錯(cuò)義突變，對(duì)其Cx31跨膜區(qū)和胞外環(huán)氨基酸發(fā)生改變后三維結(jié)構(gòu)改變和Anolea原子平均勢(shì)能變化的分析，將推進(jìn)從Cx31蛋白分子結(jié)構(gòu)上對(duì)GJB3錯(cuò)義突變致病的分子機(jī)制的理解。我們以2種突變?yōu)槔?，發(fā)生在跨膜區(qū)的p.Arg32Trp可能會(huì)導(dǎo)致其他幾個(gè)跨膜區(qū)氨基酸空間結(jié)構(gòu)的改變而使得Cx31無(wú)法發(fā)揮其正常功能；同時(shí)，結(jié)合Xia等的實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)生在胞外環(huán)的p.Glu183Lys使得Cx31蛋白不能完成高爾基復(fù)合體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的加工修飾而正常定位于細(xì)胞膜上，無(wú)法介導(dǎo)正常的細(xì)胞間連接通訊。由這2種突變可推測(cè)，GJB3基因發(fā)生錯(cuò)義突變后，其編碼的Cx31結(jié)構(gòu)將會(huì)發(fā)生改變，難以定位于細(xì)胞膜上，不能發(fā)揮間隙連接的功能。

雖然通過(guò)生物信息學(xué)方法對(duì)基因和蛋白質(zhì)進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)與功能的預(yù)測(cè)分析依舊有其局限性，但這些工作對(duì)于生物分子系統(tǒng)的生物學(xué)研究起到了很好的前瞻性作用。我們利用生物信息學(xué)方法首次對(duì)GJB3基因的編碼區(qū)進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建、保守區(qū)多序列比對(duì)分析及三維結(jié)構(gòu)與某些錯(cuò)義突變功能分析，為今后相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究提供了有價(jià)值的信息并奠定了重要的基礎(chǔ)。

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