嗜熱芽孢桿菌噬菌體的分離及特征研究

晏愛芬，余麗，林連兵

1.保山學(xué)院 資源環(huán)境學(xué)院，云南 保山 678000；2.昆明理工大學(xué) 生物工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650224

噬菌體是一類寄生在古生菌和真細(xì)菌中的病毒，是體積微小、結(jié)構(gòu)簡單、性質(zhì)特殊的生命形態(tài)。隨著對噬菌體在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中地位的認(rèn)識不斷加深，高溫噬菌體引起了越來越多科研工作者的關(guān)注，因?yàn)樗鼈儾粌H可以作為一種模式系統(tǒng)，用于研究地?zé)釁^(qū)生物的分子生物學(xué)及生物化學(xué)特性，而且還深刻影響著生物地球化學(xué)和生態(tài)系統(tǒng)的進(jìn)化過程，包括遺傳轉(zhuǎn)換、營養(yǎng)循環(huán)、生物種群結(jié)構(gòu)、生物分類、生物進(jìn)化[1]等。對騰沖熱海嗜熱芽孢桿菌噬菌體的研究，不僅可以了解它們在騰沖熱海中的分布及特征，還有助于豐富我國嗜熱噬菌體資源。

本文報(bào)道了分離自騰沖熱海熱泉的一株嗜熱芽孢桿菌噬菌體，我們對其進(jìn)行了電鏡形態(tài)觀察、生理特征初步研究。

1 材料和方法

1.1 材料

噬菌體分離所用的宿主菌嗜熱芽孢桿菌為本實(shí)驗(yàn)室保存；從云南省騰沖縣熱海熱泉采集水樣及沉積物，室溫保存于無菌的離心管中，采樣點(diǎn)溫度為50～75℃，pH值為7.0～8.0。

高溫菌培養(yǎng)基DSM88[2]，調(diào)節(jié)pH值為7.5；固體培養(yǎng)基的瓊脂濃度為2%，半固體培養(yǎng)基的瓊脂濃度為1%。

1.2 噬菌體的分離及純化

采用雙層平板法分離嗜熱噬菌體[3]。取20 mL熱泉樣品接種到200 mL DSM88液體培養(yǎng)基中，55℃、200 r/min振蕩過夜，所得培養(yǎng)液經(jīng)0.22 μm滅菌濾膜過濾除菌后，取100 μL濾液與350 μL培養(yǎng)至對數(shù)生長期早期的嗜熱芽孢桿菌混合，室溫靜置10 min后與3 mL半固體培養(yǎng)基混勻，均勻傾倒在DSM88固體平板上，即形成雙層平板；將雙層平板置于密封袋中，55℃培養(yǎng)過夜；肉眼觀察到噬菌斑后，用牙簽挑取單個(gè)噬菌斑，溶于DSM88液體培養(yǎng)基中，作為下次感染的病毒儲(chǔ)液感染宿主細(xì)胞，經(jīng)3次純化獲得純噬菌體。

1.3 噬菌體的形態(tài)觀察

取純化后的噬菌體（效價(jià)為108pfu/mL）10 μL，用一定量的2%醋酸雙氧鈾染色，吸附于230目銅網(wǎng)（噴涂碳膜）上，干燥后用JEOL-TEM1400透射電子顯微鏡觀察。

1.4 最佳感染復(fù)數(shù)的測定

感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）是指初始感染時(shí)加入噬菌體的數(shù)量與宿主菌數(shù)量的比值，也稱感染倍數(shù)。參照Lu等[4]的方法，略有改動(dòng)。培養(yǎng)宿主菌NHH4至對數(shù)前期，用分光光度計(jì)測定此時(shí)的 D600nm值約為 0.2，相當(dāng)于 1×108CFU/mL；按照MOI分別為0.01、0.1、1、10和100的比例，加入噬菌體純培養(yǎng)液和宿主菌，加入DSM88培養(yǎng)基使各管總體積相同；在55℃搖床中160 r/min振蕩培養(yǎng)8 h，13 000×g離心10 min，收集上清測定噬菌體滴度；各點(diǎn)均作2份復(fù)管培養(yǎng)，取平均值，同時(shí)以不加噬菌體的宿主菌和不加宿主菌的噬菌體為對照，以產(chǎn)生最高噬菌體滴度的MOI為最佳感染復(fù)數(shù)。

1.5 物理因素對噬菌體活性的影響

1.5.1 噬菌體的熱穩(wěn)定性分析[5]取滴度為2.1×108pfu/mL的噬菌體懸液1 mL，分別置于50、55、60、65℃水浴鍋中，每隔10 min取一次樣，共取5次，測定各溫度梯度下不同時(shí)間的噬菌體滴度 。

1.5.2 噬菌體pH穩(wěn)定性分析[5]取pH值分別為4、5、6、7、7.5、8、9、10、11的DSM88培養(yǎng)基0.99 mL，加入1.5 mL滅菌離心管中，加入0.01 mL滴度為2.1×108pfu/mL的噬菌體懸液，室溫靜置1 h，用DSM88培養(yǎng)基稀釋至1/10，取20 μL與350 μL對數(shù)期宿主細(xì)胞混合，室溫靜置15 min后測定滴度。

2 結(jié)果

2.1 噬菌體的分離和純化

把不同采樣點(diǎn)的富集樣品過濾除菌得到的病毒儲(chǔ)液，與培養(yǎng)至對數(shù)期的不同菌株吸附，采用雙層平板法檢測是否有噬菌斑形成。結(jié)果NHH4菌株的菌苔可見清新、透明的噬菌斑，直徑2～4 mm（圖1）。反復(fù)挑取3次純化噬菌體，在合適的液體培養(yǎng)條件下分離到1株噬菌體能快速裂解宿主菌，使培養(yǎng)液變得澄清，噬菌體滴度較高，一般可達(dá)108pfu/mL以上；電鏡觀察，可見形態(tài)均一的噬菌體顆粒。

2.2 噬菌體電鏡形態(tài)

用滅菌牙簽把雙層平板上的噬菌斑挑到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，對噬菌體培養(yǎng)液超速離心濃縮，于電鏡下觀察，噬菌體顆粒為二十面體型，直徑為80～100 nm，無尾，未見刺突，衣殼較薄，截面呈六邊形，邊長60～80 nm（圖2）。根據(jù)其形態(tài)，將感染嗜熱芽孢桿菌NHH4的噬菌體命名為嗜熱芽孢桿菌二十面體噬菌體（thermophilicBacillusicosahedral phage，TBIP1）。

2.3 噬菌體TBIP1的最佳MOI測定

加入噬菌體和宿主菌培養(yǎng)8 h后，宿主菌被充分裂解，培養(yǎng)液變得澄清，計(jì)數(shù)各測定管中的噬菌體滴度，結(jié)果見表1。當(dāng)MOI為1、0.1和0.01時(shí)，噬菌體TBIP1感染其宿主菌NHH4產(chǎn)生的子代噬菌體的滴度較高；當(dāng)MOI為1.0時(shí)，子代噬菌體滴度為1.09×109PFU/mL，在所有MOI中，該產(chǎn)出率最高。因此，確定噬菌體TBIP1感染其宿主嗜熱芽孢桿菌NHH4的最佳MOI為1.0。

圖1 噬菌體在平板上形成的噬菌斑形態(tài)

圖2 二十面體噬菌體TBIP1的形態(tài)

表1 噬菌體TBIP1的感染復(fù)數(shù)測定

2.4 物理因素對噬菌體TBIP1活性的影響

2.4.1 溫度對噬菌體活性的影響 宿主菌NHH4在45～65℃可被TBIP1感染，以培養(yǎng)溫度為55℃時(shí)獲得的噬菌體滴度最高，培養(yǎng)液中噬菌體滴度可達(dá)2.8×108pfu/mL。熱穩(wěn)定性分析（圖3）表明，TBIP1在55℃最穩(wěn)定，隨著溫度升高，其存活率降低，65℃處理20 min后噬菌體失活。

2.4.2 pH值對噬菌體活性的影響 pH值的改變對噬菌體TBIP1滴度的影響較大，從圖4可以看出，在pH為5～9時(shí)，噬菌體均保持45%以上的活性，尤以pH7.5時(shí)滴度最高；隨著pH值的升高，噬菌體TBIP1的活性快速降低，pH11時(shí)噬菌體完全失去感染宿主的能力；當(dāng)pH值降到4時(shí)滴度為零。相比之下，TBIP1在較為溫和的pH值環(huán)境下有較好的穩(wěn)定性。

3 討論

高溫噬菌體生活在一類特殊的環(huán)境中，對溫度具有很強(qiáng)的耐受力和適應(yīng)性，它們通過侵染嗜熱細(xì)菌而生存繁殖，具有獨(dú)特的分子生物學(xué)和生物化學(xué)特性。噬菌體TBIP1是分離自從騰沖熱海溫泉中得到的嗜熱芽孢桿菌NHH4的一株新的烈性噬菌體。TBIP1在DSM88培養(yǎng)基中能夠很好地感染宿主菌NHH4并形成清晰的噬菌斑，感染宿主菌的溫度范圍為45～65℃，最適感染溫度為55℃；感染宿主菌的pH值范圍為5.0～10.0，最適感染pH值為7.5。根據(jù)對噬菌體TBIP1的生物學(xué)特征分析，認(rèn)為噬菌體TBIP1比較典型。

騰沖熱海作為我國著名的火山地?zé)釁^(qū)，具有不同水化學(xué)特征的溫泉類型，與之對應(yīng)的漫長的微生物生態(tài)系統(tǒng)的演化，孕育出了現(xiàn)代騰沖熱海豐富的高溫微生物資源。已從騰沖熱海中分離到硫化葉菌噬菌體[6]、棲熱菌噬菌體[5]，可見騰沖熱海的嗜熱菌及其噬菌體都具有生物多樣性。騰沖熱海作為我國重要的高溫菌及其嗜熱噬菌體資源寶庫，值得進(jìn)一步研究。

圖3 溫度對噬菌體TBIP1活性的影響

圖4 不同pH值對噬菌體TBIP1活性的影響

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