表達miR-192的重組腺病毒的構建及其在肝細胞中的表達分析

代曉朋 ，李軍鋒 ，張紅飛 ，張偉 ，趙光宇 ，于虹 ，郭彥 ，周育森

1.軍事醫(yī)學科學院 微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國家重點實驗室，北京 100071；

2.鄭州大學 公共衛(wèi)生學院，河南 鄭州 450001

微小RNA（microRNA，miRNA）是一種內(nèi)源性的高度保守的由19～25個核苷酸組成的非編碼RNA，它能在轉錄后水平上通過調(diào)節(jié)靶基因表達，參與細胞的凋亡與增殖、組織的分化、抗病毒免疫等生物學過程[1-2]。在對miRNA的功能研究中，怎樣使miRNA有效地高表達是一個重要方面。構建表達miRNA的真核表達載體及將化學合成的miRNA模擬物（mimic）轉染細胞是目前常用的方法。但對部分細胞，如肝癌細胞系HepG2而言，存在轉染效率不高且重復性差等問題。而腺病毒表達系統(tǒng)具有宿主范圍廣、能在非復制型細胞中表達、復制效率高、沒有插入突變、表達水平高等特點[3-5]，因而得到廣泛應用。

miRNA-192（miR-192）在肝細胞癌[6]、乳腺癌[7]、肺癌[8]、糖尿病患者腎臟[9]中表達異常，提示miR-192可能與這些腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切的關系。深入研究miR-192對肝細胞功能的影響及分子機制是我們關注的問題。為了在肝細胞中高效表達miR-192，我們擬選擇構建腺病毒表達系統(tǒng)，將miR-192前體基因插入重組腺病毒載體進行包裝，感染肝細胞后檢測其表達情況。視網(wǎng)膜母細胞瘤基因1（retino?blastoma 1，RB1）為調(diào)控細胞周期的重要分子，其mRNA的3'UTR區(qū)域含miR-192結合序列[8]，我們將研究miR-192在肝細胞中是否調(diào)節(jié)RB1的表達。本工作將為探討miR-192在肝細胞中的功能及調(diào)節(jié)的靶基因提供基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

QBI-293A細胞、HepG2細胞、含pAdEasy-1腺病毒骨架的大腸桿菌BJ5183感受態(tài)、空腺病毒、pAdTrack腺病毒載體系統(tǒng)均為本研究室留存；大腸桿菌DH5α感受態(tài)、DNA marker、DNA凝膠回收試劑盒和小量質(zhì)粒提取試劑盒均購自北京全式金生物技術有限公司；pMD18-T載體系統(tǒng)、M-MLV反轉錄酶、RNase抑制劑購自TaKaRa公司；胎牛血清、高糖型 DMEM 培養(yǎng)液（C12430）、LipofectAMINE2000試劑購自Invitrogen公司；限制性內(nèi)切酶購自NEB公司；定量PCR儀為Eppendorf公司產(chǎn)品；引物由上海生物工程有限公司合成。

1.2 穿梭載體pAdTrack-miR-192的構建和鑒定

根據(jù)miR-192前體基因序列（GenBank：NR_029578.1）設計擴增引物（表1）。提取HepG2細胞基因組，以其為模板擴增miR-192前體基因。瓊脂糖電泳回收大小正確的條帶，與pMD-18T克隆載體相連，氨芐西林選擇培養(yǎng)，挑克隆菌培養(yǎng)后提質(zhì)粒酶切鑒定，對條帶大小正確的克隆進行序列測定。將測序正確的重組質(zhì)粒用KpnⅠ和SalⅠ酶切，切下miR-192前體基因，連接到經(jīng)相同酶切的pAdTrack穿梭載體中，轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，卡那霉素抗性選擇陽性克隆，提質(zhì)粒并用XhoⅠ/BamHⅠ雙酶切鑒定，正確的重組質(zhì)粒（含有2個BamHⅠ酶切位點）理論上被切為750 bp、3.8 kb、5.1 kb等3條片段。將插入miR-192前體基因的穿梭載體命名為pAdTrack-miR-192。

1.3 miR-192重組腺病毒載體pAd-miR-192的構建

將構建的pAdTrack-miR-192用PmeⅠ酶切線性化，轉化含腺病毒骨架pAdEasy-1的大腸桿菌BJ5183感受態(tài)，卡那霉素抗性選擇培養(yǎng)24 h，挑選10個最小的克隆，根據(jù)文獻[10]用快速裂解法進行初步篩選，選擇條帶最大的克隆，提質(zhì)粒并轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)進行擴增，提質(zhì)粒后用PacⅠ酶切鑒定，進行瓊脂糖凝膠電泳，如大條帶大于30 kb、小條帶大小為3或4.5 kb，說明該克隆為重組成功的腺病毒，命名為pAd-miR-192。

1.4 細胞培養(yǎng)和轉染

在DMEM培養(yǎng)液（2 mmol/L谷氨酰胺，10%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素）中，于5%CO2、37℃恒溫孵箱中培養(yǎng)QBI-293A細胞。轉染用試劑為Invitrogen公司的LipofectAMINE2000，轉染方法依據(jù)操作說明書。

1.5 miR-192重組腺病毒的包裝和滴度測定

將重組成功的pAd-miR-192載體經(jīng)PacⅠ酶切線性化后，用膠回收試劑盒回收，經(jīng)DNA定量后轉染QBI-293A細胞，培養(yǎng)7 d后在顯微鏡下觀察細胞空斑病變，在熒光顯微鏡下觀察EGFP的表達，當細胞中出現(xiàn)病變且視野中幾乎或局部全為綠色熒光時，表明重組腺病毒在QBI-293A細胞中包裝成功。收集包裝腺病毒的細胞，于-70℃/37℃反復凍融3次以裂解細胞，離心后取含有病毒的上清液于-70℃保存?zhèn)溆?。取空腺病毒和miR-192重組腺病毒再次感染QBI-293A細胞以擴增病毒。經(jīng)過3次擴增，根據(jù)文獻[11]的方法將病毒上清按1∶5的比例梯度稀釋，根據(jù)感染細胞中綠色熒光細胞的陽性數(shù)計算病毒滴度及感染復數(shù)（MOI）。

1.6 miR-192重組腺病毒在HepG2細胞中的表達和檢測

在六孔板中接種HepG2細胞（2.5×105/孔），培養(yǎng)條件與QBI-293A一致，在恒溫孵箱中37℃培養(yǎng)18 h。吸去培養(yǎng)液，每孔補加新鮮的培養(yǎng)液500 μL。以空腺病毒為對照，每組重復3次。按照MOI為20的標準加入miR-192重組腺病毒，吸附1 h后補加1.5 mL培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，72 h后用熒光顯微鏡觀察綠色熒光的表達情況，以確定重組腺病毒是否感染HepG2細胞。收集成功感染的細胞檢測細胞中miR-192和RB1的表達。

1.7 q-PCR檢測病毒感染細胞中miR-192和RB1 mRNA的相對表達

依據(jù)莖環(huán)法定量檢測細胞中miRNA[12]，設計莖環(huán)逆轉錄引物和定量檢測上游引物（表1）。收集感染構建的含miR-192前體基因的重組腺病毒和對照空腺病毒的HepG2細胞，提取RNA后，采用miR-192和U6莖環(huán)逆轉錄引物，用M-MLV酶進行反轉錄，然后用miR-192和U6定量檢測上游引物分別和莖環(huán)結構通用下游引物組合，根據(jù)各組細胞miR-192 和 U6檢測的 Ct值，利用 2-ΔΔCt法進行相對定量分析，檢測miR-192在病毒感染細胞后是否表達miR-192。

用Primer Express 3.0軟件設計RB1的定量檢測引物（表1）。取過表達miR-192的細胞和對照細胞的RNA各1 μg，用M-MLV反轉錄為cDNA，然后用RB1和β-actin定量檢測引物，以β-actin為內(nèi)參，實時定量PCR檢測RB1 mRNA和β-actin的Ct值，利用 2-ΔΔCt法進行相對定量分析。

1.8 統(tǒng)計學分析

統(tǒng)計學分析所用軟件為GraphPad Prism 4，比較方式為成組t檢驗，P＜0.05（雙側）表明差異具有統(tǒng)計學意義。

表1 所需引物及序列

2 結果

2.1 miR-192前體基因的克隆

以HepG2細胞提取的基因組為模板擴增miR-192前體基因，膠回收約670 bp的擴增產(chǎn)物，連接T載體，構建重組載體T-miR-192，對T-miR-192進行EcoRⅠ/HindⅢ雙酶切鑒定（圖1）。酶切鑒定正確后，交北京奧科鼎盛生物科技公司進行序列測定，表明獲得的miR-192基因序列與GenBank中完全一致。

2.2 表達miR-192的重組腺病毒載體的構建

依據(jù)前述方法將miR-192前體基因與穿梭載體pAd-Track連接，用BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切（圖2），酶切片段大小與理論值一致，表明構建了穿梭載體pAdTrack-miR-192。將鑒定正確的pAdTrackmiR-192用PmeⅠ酶切線性化后轉化含pAdEasy-1腺病毒骨架的大腸桿菌BJ5183感受態(tài)細胞，用卡那霉素抗性的培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)，挑選最小的克隆菌擴增快速裂解鑒定，初步篩選，篩選到克隆后轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)擴增質(zhì)粒后用PacⅠ酶切鑒定，切出約4.5 kb的條帶，與理論值相符（圖2），表明構建了表達miR-192的重組腺病毒載體pAd-miR-192。

2.3 含miR-192前體基因的重組腺病毒的包裝和擴增

將經(jīng)PacⅠ酶切線性化的重組腺病毒載體pAd-miR-192轉染QBI-293A細胞，于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中孵育，熒光顯微鏡下檢測綠色熒光蛋白的表達。轉染第8 d時，在普通熒光顯微鏡下檢測到細胞病變，且綠色熒光充滿視野中的絕大多數(shù)細胞（圖3），提示病毒包裝成功。收集包裝細胞，-70℃/37℃反復凍融3次以收獲重組腺病毒pAd-miR-192，將病毒凍融上清液反復感染QBI-293A細胞以大量擴增并收獲病毒。經(jīng)過3次擴增，根據(jù)文獻[11]的方法將病毒上清按1∶5的比例梯度稀釋，根據(jù)感染細胞中綠色熒光細胞的陽性數(shù)計算病毒滴度為4×107PFU/mL，MOI為18。

圖1 miR-192前體基因的克隆和鑒定

圖2 表達miR-192重組腺病毒載體的鑒定

2.4 含miR-192前體基因的重組腺病毒細胞中的miR-192表達分析及靶基因分析

在六孔板中接種HepG2細胞，在恒溫孵箱中于37℃培養(yǎng)18 h，將擴增的含miR-192前體基因的重組腺病毒與對照空腺病毒經(jīng)滴定后感染HepG2細胞，72 h后在熒光顯微鏡下觀察，可見視野中有大量綠色熒光（圖4A），說明重組腺病毒成功感染了HepG2細胞。收集2組細胞進行miR-192及RB1定量檢測。結果表明，轉染含miR-192前體基因腺病毒的細胞中，miR-192的表達顯著高于轉染空腺病毒的細胞（P＜0.001）（圖4B），說明構建的含miR-192前體基因的腺病毒感染HepG2細胞后，miR-192的表達水平遠高于對照細胞，即成功構建了可以高效表達miR-192的重組腺病毒，同時也建立了miR-192高表達細胞模型。為了檢測3'非翻譯區(qū)含miR-192結合位點的RB1在肝細胞是否是miR-192的靶基因，對2組細胞的RB1 mRNA進行了相對定量分析。結果表明，感染重組腺病毒后細胞中RB1 mRNA的表達水平明顯下降（P＜0.001）（圖4C），表明在肝細胞中miR-192能夠靶向RB1 mRNA。

圖3 熒光顯微鏡下檢測pAd-miR-192轉染QBI-293細胞后GFP的表達（×200）

3 討論

miR-192最初由Lagos-Quintana等[13]克隆，隨后由Lim等[14]證實。目前確定miR-192前體基因位于人11號染色體上，與miR-194成簇共同轉錄；在肝組織和結腸組織中高表達，而在癌組織中低表達，在一些肝癌組織中其序列發(fā)生了突變。研究表明，在肺癌組織中miR-192低表達，抑制肺癌細胞系A549、H460、95D的增殖。在結腸癌細胞中，p53調(diào)節(jié)miR-192表達，miR-192的表達進而抑制腫瘤治療的靶標二氫葉酸還原酶的翻譯，可以促進細胞G1和G2期的阻滯，參與了p53抑制腫瘤的過程[15]。

miR-192在肝細胞中表達豐度高，然而有關其對肝細胞功能的影響及調(diào)控的分子機制的報道卻很少，一些未知的功能和機制有待研究和闡明。在對miRNA進行功能研究中，它的過表達和抑制是其中的一個重要而基本的環(huán)節(jié)?？紤]到腺病毒具有感染效率高、宿主廣泛、容易制備表達、不整合入染色體、表達效率高等優(yōu)點，我們選擇構建miRNA的腺病毒載體。通過對所構建的miR-192腺病毒的表達進行分析檢測，發(fā)現(xiàn)miR-192在HepG2細胞中的表達顯著提高，建立了miR-192過表達肝細胞模型，為進一步研究其對肝細胞的功能影響打下了基礎。為了鑒定miR-192調(diào)控的分子，選擇在肺癌中的miR-192靶標分子RB1進行檢測，發(fā)現(xiàn)在肝癌細胞中過表達miR-192同樣可以明顯降低細胞中RB1 mRNA的水平。該實驗驗證了在肝癌細胞中RB1為miR-192的靶標分子。綜上，我們建立的miR-192高表達肝細胞模型，在豐度和功能上實現(xiàn)了miR-192的過量表達，而且可用來驗證靶基因。這為我們進行miR-192的肝功能研究奠定了重要基礎，同時也為其他miRNA的研究提供了一種簡單高效表達所需miRNA的方法。

圖4 含miR-192前體基因的重組腺病毒感染肝細胞后miR-192的表達及靶基因分析

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