檢測(cè)HSA-GLP-1融合蛋白雙抗體夾心ELISA方法的建立

王秋實(shí) ，劉運(yùn)龍 ，張玉民 ，陳知航 ，錢愛(ài)東 ，程遠(yuǎn)國(guó)

1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 微生物流行病研究所，北京 100071；3.延邊大學(xué)，吉林 延吉 133000

糖尿病已成為世界上繼腫瘤、心腦血管病之后第三位嚴(yán)重危害人類健康的慢性疾病。糖尿病主要分為1型和2型，90%以上為2型糖尿病。2型糖尿病患者多存在胰島素抵抗和胰島素分泌不足兩方面異常[1]。胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide 1，GLP-1）是回腸內(nèi)分泌細(xì)胞分泌的一種肽類激素，由30個(gè)氨基酸殘基組成[2]，具有多種生理功能[3-6]，如延遲胃排空及延緩小腸蠕動(dòng)；促進(jìn)糖原合成，抑制脂肪的形成；血糖依賴性地促進(jìn)胰島素的釋放，促進(jìn)胰島素原合成，抑制胰高血糖素合成，促進(jìn)β細(xì)胞修復(fù)與增殖；抑制食欲產(chǎn)生飽腹感等。目前，GLP-1及其類似物是研究非胰島素依賴糖尿病治療的熱點(diǎn)。

然而，GLP-1在人體血循環(huán)中易被二肽酶Ⅳ降解而失去活性，導(dǎo)致GLP-1的體內(nèi)半衰期不足2 min，因而限制了其在臨床中的直接應(yīng)用。為此，阻斷或延緩GLP-1類藥物的降解，延長(zhǎng)其半衰期，是GLP-1類似物藥物應(yīng)用于臨床的研發(fā)關(guān)鍵點(diǎn)之一。目前已建立的改善蛋白質(zhì)藥物半衰期的技術(shù)包括蛋白藥物的化學(xué)修飾、蛋白質(zhì)融合、微囊化/納米粒、糖基化、構(gòu)建抗蛋白酶突變體等[7]。人血清白蛋白（hu?man serum albumin，HSA）融合技術(shù)是一種新型的長(zhǎng)效給藥平臺(tái)技術(shù)。HSA在人體中的半衰期達(dá)20 d，將GLP-1與HSA融合后獲得的融合蛋白保留了GLP-1的生物活性，其在體內(nèi)的半衰期也顯著延長(zhǎng)。

本課題旨在建立一種高靈敏的雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法，能精確檢測(cè)HSA-GLP-1融合蛋白的濃度。這種測(cè)定方法安全、高效、簡(jiǎn)便，可應(yīng)用于融合蛋白藥代動(dòng)力學(xué)檢測(cè)及分析。

1 材料和方法

1.1 材料

HSA-GLP-1（20111103-1，江蘇泰康生物醫(yī)藥有限公司）；GLP-1單抗（HYB147-12，Antibodyshop公 司）；anti-HSA-biotin（ab31898，Abcam 公 司）；HRP-Strep（DY998，RD公司）；TMB單組分顯色液（PR1200，上海索萊寶有限公司）；96孔板（Costar公司）；酶標(biāo)儀（M550，BIO-RAD公司）；微量移液器（Eppendorf公司）；渦旋震蕩器（上海海門儀器）等。

1.2 檢測(cè)方法

①包被：用pH7.4的PBS緩沖液包被GLP-1單克隆抗體，4℃過(guò)夜；②封閉：用洗液洗板3次，拍干酶聯(lián)板，加3%BSA封閉液200 μL，室溫封閉2 h；③加樣：用洗液洗板4次，拍干酶聯(lián)板，每孔加100 μL用20%猴空白血清稀釋至不同濃度的HSA-GLP-1融合蛋白和待測(cè)樣品，室溫孵育1 h；④加二抗：用洗液洗板4次，拍干酶聯(lián)板，每孔加100 μL anti-HSA-biotin，室溫孵育 1 h；⑤免疫放大：用洗液洗板4次，拍干酶聯(lián)板，每孔加100 μL HRPStrep，室溫孵育20 min；⑥顯色：用洗液洗板6次，拍干酶聯(lián)板，每孔加100 μL TMB，室溫孵育20 min；⑦終止：加終止液，30 min內(nèi)讀取D450nm值。

2 結(jié)果

2.1 抗體配對(duì)

鼠抗人 GLP-1單抗 ABS033-10、ABS046-03、HYB147-12分別作為捕捉抗體，anti-HSA-biotin作為檢測(cè)抗體。經(jīng)過(guò)篩選捕捉抗體工作濃度和檢測(cè)抗體工作濃度，進(jìn)而選擇最佳濃度；將HSA-GLP-1融合蛋白稀釋至2 μg/mL，然后按1/4梯度稀釋至0.5 ng/mL，設(shè)空白孔作為本底。結(jié)果見(jiàn)表1、圖1，最終GLP-1單抗選擇HYB147-12包被酶標(biāo)板。

2.2 抗體滴度的選擇

GLP-1（HYB147-12）一抗選擇 5、8 μg/mL，an?ti-HSA-biotin選擇 1∶2000、1∶5000，HRP 標(biāo)記的親和素選擇1∶200的免疫信號(hào)放大，比較2個(gè)抗體滴度的配對(duì)效果，結(jié)果見(jiàn)表2，最終GLP-1單抗選擇8μg/mL包被酶標(biāo)板，anti-HSA-biotin選擇1∶2000。

表1 抗體配對(duì)結(jié)果（D450nm）

表2 GLP-1單抗與anti-HSA-biotin檢測(cè)抗體的抗體滴度（D450nm）

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將標(biāo)準(zhǔn)品HSA-GLP-1融合蛋白用20%猴血清稀釋至 1000、500、250、125、62.5、31.25 及 15.6 ng/mL，取100 μL樣品，按上述測(cè)定方法檢測(cè)。以D450nm值為縱坐標(biāo)、各標(biāo)準(zhǔn)濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)其進(jìn)行四參數(shù)回歸，所得回歸方程即為HSA-GLP-1融合蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線（表3、圖3）。經(jīng)四參數(shù)Logistic函數(shù)模型擬合，求得曲線斜率、IC50及上下端漸進(jìn)線間的近線性范圍。其數(shù)學(xué)模型為：

其中A1為S狀曲線下端漸進(jìn)線的估計(jì)值，A2為S狀曲線上端漸進(jìn)線的估計(jì)值，P為校正曲線的斜率，X0（IC50）為50%吸光度所對(duì)應(yīng)的樣品濃度值。含量超出上下端漸進(jìn)線間的近線性范圍的樣品須適當(dāng)稀釋至校正曲線最佳測(cè)量濃度范圍進(jìn)行測(cè)定。未知血清樣品均用同一板上各自的標(biāo)準(zhǔn)校正曲線計(jì)算濃度。

2.4 方法的特異性

圖1 不同抗體組檢測(cè)HSA-GLP-1融合蛋白的校正曲線

圖2 不同抗體工作濃度及檢測(cè)HSA-GLP-1融合蛋白的校正曲線

選擇分子結(jié)構(gòu)類似于HSA-GLP-1融合蛋白的藥物 GLP-1、HSA、IL-2-HSA 和 PEG-INF-α2b等，分別制備成與HSA-GLP-1融合蛋白相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行交叉反應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)圖 4，GLP-1、HSA、IL-2-HSA和PEG-INF-α2b均不與HSA-GLP-1融合蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)，不干擾血清樣本中的抗HSA-GLP-1融合蛋白檢測(cè)，呈現(xiàn)較高的特異性。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

分別以10%、20%、50%血清和全猴血清為稀釋液制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖5。10%、20%、50%血清和全猴血清稀釋液等4條標(biāo)準(zhǔn)曲線比較重合，標(biāo)準(zhǔn)曲線沒(méi)有明顯右移或左移，可以判定沒(méi)有基質(zhì)效應(yīng)存在。為了在后續(xù)樣品檢測(cè)中更具有代表性，我們選用20%血清作為稀釋液。

表3 ELISA方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍（D450nm）

圖3 HSA-GLP-1融合蛋白的四參數(shù)校正曲線

圖4 方法的特異性考察

2.6 方法的回收率

按照制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法制成500、125、31.25 ng/mL等3個(gè)濃度，按上述方法進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)濃度重復(fù)5次，用隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其測(cè)定濃度，與理論濃度比較得到相對(duì)回收率，結(jié)果見(jiàn)表4。每個(gè)濃度質(zhì)控樣品回收率均為95.4%～104.5%，變異系數(shù)為3.6%～7.4%，符合方法學(xué)確證的要求。

2.7 方法的靈敏度

按照制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法制成15.6 ng/mL的HSA-GLP-1融合蛋白，按上述方法進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)5次，由同一板上的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算出的濃度為HSA-GLP-1融合蛋白的檢出量。結(jié)果如表5所示，標(biāo)準(zhǔn)品15.6 ng/mL的5次重復(fù)檢測(cè)準(zhǔn)確度為-2.5%，精密度為4.3%，符合方法學(xué)確證的要求。

2.8 方法的精密度

按照制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法制成500、125、31.25 ng/mL等3個(gè)濃度，按上述方法進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)濃度重復(fù)5次，檢測(cè)3次，計(jì)算板間與板內(nèi)的精密度。結(jié)果見(jiàn)表6、7，板內(nèi)精密度為3.1%～10.0%，板間精密度為3.9%～7.8%，符合方法學(xué)確證要求。

圖5 不同濃度稀釋液制備的四參數(shù)校正曲線

表4 ELISA方法檢測(cè)HSA-GLP-1融合蛋白在血清中的回收率

2.9 方法學(xué)穩(wěn)定性的考察

血清中HSA-GLP-1融合蛋白穩(wěn)定性研究結(jié)果見(jiàn)表8、9、10。HSA-GLP-1融合蛋白在血清中-80℃凍融1次、室溫放置4 h、-80℃保存90 d均不影響其穩(wěn)定性，符合方法學(xué)確證要求。

2.10 稀釋率的影響

表5 ELISA方法檢測(cè)HSA-GLP-1融合蛋白在血清中的靈敏度

表6 ELISA方法檢測(cè)HSA-GLP-1融合蛋白在血清中的板內(nèi)精密度

表7 ELISA方法檢測(cè)HSA-GLP-1融合蛋白在血清中的板間精密度

將濃度為1000 ng/mL的HSA-GLP-1融合蛋白分別稀釋至 500、250、125、100、50、25 ng/mL，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表11，準(zhǔn)確度為-16.4%～4.4%，符合方法學(xué)確證要求。

表8 方法的凍融穩(wěn)定性驗(yàn)證

表9 方法的室溫4 h穩(wěn)定性驗(yàn)證

表10 方法的長(zhǎng)期穩(wěn)定性驗(yàn)證

表11 稀釋率的影響

3 討論

目前測(cè)定生物體內(nèi)蛋白質(zhì)多肽藥物的方法主要有同位素標(biāo)記示蹤法、生物測(cè)定法及免疫分析法[8]。生物檢定法雖然可直接反映蛋白藥物在生物體內(nèi)產(chǎn)生的生物學(xué)活性，但操作復(fù)雜，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，影響因素較多，其變異較大[9-10]。同位素標(biāo)記法檢測(cè)靈敏度高,但試驗(yàn)操作相對(duì)復(fù)雜并可能存在放射性污染[11]，不能識(shí)別原型藥物和降解產(chǎn)物，給準(zhǔn)確測(cè)定原型藥物的濃度變化帶來(lái)困難，不能獲得準(zhǔn)確的藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)。免疫分析方法是一類快速、經(jīng)濟(jì)、靈敏和適用的測(cè)定方法，常用的免疫分析法有ELISA[12-13]、放射免疫分析法（RIA）和免疫放射分析法（IRMA）等。ELISA是免疫測(cè)定法的代表，通過(guò)特異性地識(shí)別蛋白質(zhì)或多肽分子上的抗原決定簇部位的單克隆抗體或多克隆抗體來(lái)測(cè)定目標(biāo)物。由于ELISA方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)迅速、非放射性及可以批量測(cè)定等諸多優(yōu)點(diǎn)，已成為藥代動(dòng)力學(xué)研究常用的免疫測(cè)定方法[14-16]。建立可靠和可重復(fù)的定量分析方法是進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)研究的前提之一。定量分析方法驗(yàn)證的目的是證明采用的含量測(cè)定方法適于相應(yīng)分析要求，在進(jìn)行定量分析方法學(xué)研究或起草藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，分析方法須經(jīng)驗(yàn)證[17]。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們選用與GLP-1特異性結(jié)合的GLP-1抗體作為捕獲抗體。由于GLP-1分子較小，通過(guò)HSA融合技術(shù)將其與白蛋白連接以增大相對(duì)分子質(zhì)量，同時(shí)在ELISA方法檢測(cè)中，GLP-1抗原決定簇容易被屏蔽，通過(guò)篩選不同特異性抗原決定表位的單克隆抗體，得到抗GLP-1鼠單克隆抗體，可滿足ELISA方法建立的需求，而抗原決定表位在N端和C端的GLP-1單克隆抗體均未與HSA-GLP-1融合蛋白發(fā)生免疫反應(yīng)，說(shuō)明GLP-1的N端和C端的抗原決定簇被屏蔽，或者HSA-GLP-1融合蛋白在反應(yīng)中發(fā)生空間位阻使其失去結(jié)合抗體的能力。用20%空白血清稀釋融合蛋白配制校正曲線,以提高試驗(yàn)的準(zhǔn)確度和精密度。

結(jié)果表明，我們建立的雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法靈敏度高，特異性及重現(xiàn)性好，完全符合藥代動(dòng)力學(xué)檢測(cè)要求，可用于食蟹猴血清中HSA-GLP-1融合蛋白的檢測(cè)，為進(jìn)行臨床前HSA-GLP-1融合蛋白藥代動(dòng)力學(xué)研究奠定了基礎(chǔ),并為其他融合蛋白類藥物的藥代動(dòng)力學(xué)研究提供了借鑒思路。

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