• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    果蠅蛋白質(zhì)組學(xué)研究進展

    2013-10-29 09:36:36邢曉華楊曉明徐平
    生物技術(shù)通訊 2013年5期
    關(guān)鍵詞:泛素果蠅組學(xué)

    邢曉華 ,楊曉明 ,徐平

    1.北京工業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與生物工程學(xué)院,北京 100124;

    2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 放射醫(yī)學(xué)研究所,北京 100850;3.北京蛋白質(zhì)組研究中心,北京 102206

    果蠅(Drosophila melanogaster)是一種雙翅目(Diptera)昆蟲,因喜好腐爛的水果及發(fā)酵的果汁而得名。由于個體小、繁殖快、生活史豐富、染色體少、突變多等一系列優(yōu)點,果蠅已成為生命科學(xué)領(lǐng)域最常用的一種模式生物[1]。

    果蠅是多細胞生物,具有復(fù)雜的發(fā)育過程和豐富的行為學(xué)特征,與人類在身體發(fā)育、神經(jīng)退化、腫瘤形成等的調(diào)控機制上有很多相通之處,其調(diào)控規(guī)律也與人類極其相似,許多人類基因在果蠅上也有,甚至功能可以互通[2]。因此,在20世紀生命科學(xué)發(fā)展的歷史長河中,果蠅扮演了十分重要的角色。遺傳學(xué)、發(fā)育的基因調(diào)控、各類神經(jīng)疾病、帕金森病、老年癡呆、藥物成癮和酒精中毒、衰老與長壽、記憶與某些認知行為的研究中都有果蠅的“身影”[3]。目前果蠅基因組方面的研究也已相當(dāng)成熟。2000年,果蠅全基因組測序完成。該基因組中編碼蛋白質(zhì)的基因有13 600多個,數(shù)量少于線蟲。但因果蠅存在復(fù)雜的生活史和形態(tài)變化,因此其基因的功能調(diào)控更為復(fù)雜多樣。長期的系統(tǒng)研究也使果蠅的基因組成為至今注釋最好的基因組之一[4]。另外,果蠅擁有目前國際上應(yīng)用最廣泛的在線數(shù)據(jù)庫Flybase,利于對其蛋白質(zhì)的功能和結(jié)構(gòu)進行進一步的分析[5]。

    盡管果蠅的研究在遺傳學(xué)和基因組方面已非常成熟,但蛋白質(zhì)是生命活動功能的直接承擔(dān)者,在果蠅蛋白質(zhì)組水平的研究可以直接獲得基因在細胞內(nèi)的確切功能,是系統(tǒng)鑒定、定量蛋白質(zhì),并研究其生物學(xué)功能的重要手段。最重要的是,在蛋白質(zhì)組層面,果蠅作為無脊椎模式生物,在氨基酸序列水平與脊椎動物的同源性最高,結(jié)合果蠅的遺傳學(xué)、基因組學(xué)及生理學(xué)研究技術(shù)基礎(chǔ),能夠?qū)ζ淙绱素S富且與人類極其相似的生活史調(diào)控規(guī)律進行深度解讀[6]。因此,果蠅蛋白質(zhì)組學(xué)研究引起了生命科學(xué)界的廣泛重視,成為當(dāng)今國際生命科學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域最活躍的學(xué)科前沿。

    但由于技術(shù)的限制,至今在果蠅蛋白質(zhì)組學(xué)方面的研究報道并不多見。我們對近年來的果蠅蛋白質(zhì)組學(xué)研究進行了綜述,主要包括果蠅蛋白質(zhì)組的產(chǎn)生背景,以及在表達譜、修飾譜、比較蛋白質(zhì)組學(xué)和疾病模型蛋白質(zhì)組學(xué)等方面的進展,并對果蠅蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展前景進行了展望,為進一步開展人類疾病模型的果蠅蛋白質(zhì)組學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

    1 果蠅及其蛋白質(zhì)組的研究內(nèi)容

    果蠅的生活史包括卵、幼蟲、蛹、成蟲等4個連續(xù)的但形態(tài)完全不同的變態(tài)發(fā)育階段。其生活周期十分短暫,在25℃、60%相對濕度條件下約為10 d。通過控制養(yǎng)殖溫度,可以加速或減緩果蠅的發(fā)育。果蠅個體很小,成蟲果蠅體長僅為3~4 mm,且雄性較雌性偏小。果蠅的染色體數(shù)目少,其核型只包括4對同源染色體,其中1對為性染色體,3對為常染色體。果蠅的性別決定方式為XY型,雄性異配,因此常常被用作驗證性別決定的實驗素材[7]。

    基于清晰的遺傳背景和便捷的遺傳操作,果蠅在發(fā)育生物學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)等領(lǐng)域都占據(jù)了不可替代的位置,在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域也得到越來越廣泛的應(yīng)用。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的日臻成熟,對果蠅的研究已遠遠不止停留在基因和遺傳學(xué)的層次上,科學(xué)家更關(guān)注果蠅基因如何調(diào)控蛋白質(zhì)的表達,并進而對生命活動進行直接調(diào)控,揭示人類生命的奧秘。

    隨著人類基因組學(xué)計劃的逐漸成熟,分子水平的實驗技術(shù)不斷發(fā)展,果蠅蛋白質(zhì)組學(xué)研究的各個方面均有較大突破,新的研究內(nèi)容和方法不斷出現(xiàn)。

    2 果蠅蛋白質(zhì)組表達譜

    基于凝膠電泳體系的蛋白質(zhì)鑒定策略是近年來果蠅蛋白質(zhì)組學(xué)研究常用的技術(shù)策略,主要包括2種技術(shù):一是基于2-DE的傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法,二是基于一維凝膠電泳分離-高效液相色譜分離和串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(GeLC-MS/MS)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究策略。但由于技術(shù)的限制,果蠅蛋白質(zhì)組學(xué)研究,尤其是大規(guī)模的蛋白質(zhì)組學(xué)研究報道尚不多見。為得到覆蓋率更高的果蠅蛋白質(zhì)組表達譜,各種新方法不斷產(chǎn)生,比較有效的是將樣品分為不同的組織和器官分別進行鑒定,不但可以提高鑒定率,也可以為研究特定組織和器官提供更為詳盡的蛋白信息,實現(xiàn)生物功能專一性和多樣性(表1)。

    2.1 基于2-DE的傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法

    基于2-DE的傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法在前期的果蠅蛋白質(zhì)組學(xué)研究中占據(jù)主要地位。Alonso等[8]利用2-DE技術(shù)研究了果蠅線粒體的蛋白質(zhì)組,鑒定到231個銀染的多肽,對應(yīng)了66個線粒體蛋白質(zhì);并且用相似的技術(shù)體系對果蠅成蟲的翅膀胎盤進行了蛋白質(zhì)組分析,共鑒定到1492個多肽,對應(yīng)了100多個蛋白[9]。Vierstraete等[10]利用該技術(shù)對果蠅幼蟲血淋巴的分泌蛋白質(zhì)組進行了分析,分別得到脂多糖、啤酒酵母和藤黃微球菌等3種物質(zhì)感染下發(fā)生免疫的蛋白質(zhì)10、20和19個。Takemori等[11]用相似的技術(shù)體系發(fā)現(xiàn)了440個果蠅雄性生殖系統(tǒng)(包括睪丸、精囊、附屬腺、射精管和射精管球)組織特異的蛋白。Lee等[12]利用雙向電泳技術(shù)鑒定了果蠅頭部中的1500個熒光蛋白點,得到650個蛋白質(zhì),其中500個屬于果蠅頭部特異的蛋白質(zhì)。

    雙向電泳可分離上千種蛋白質(zhì),并獲得該蛋白的等電點和相對分子質(zhì)量,但也存在不易分離強疏水性、低溶解度、極酸或極堿的蛋白質(zhì),以及繁瑣、不穩(wěn)定、靈敏度低等缺點[13-14]。

    表1 以果蠅為模式生物的蛋白質(zhì)組表達譜研究進展

    2.2 基于高效液相色譜分離和串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)

    近幾年中,基于高效液相色譜分離和串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)逐漸成為主流的全蛋白質(zhì)組研究方法。Bunner等[15]報道了基于LC-MS/MS蛋白質(zhì)組技術(shù)的首例大規(guī)模果蠅蛋白質(zhì)組學(xué)研究成果,選取果蠅卵、幼蟲、蛹和成蟲等4個發(fā)育階段及Kc167和S2等2個細胞系作為研究材料,在多種蛋白提取分離鑒定技術(shù)的支持下,經(jīng)若干次重復(fù)試驗,共鑒定到9124個蛋白,對應(yīng)8672個基因,成為迄今最大規(guī)模的果蠅蛋白質(zhì)組研究。

    組織特異和亞細胞水平的蛋白質(zhì)組學(xué)研究是蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域中的一支新生力量。它一方面降低樣品的復(fù)雜度,使分析簡單化;另一方面可以相對富集相應(yīng)亞細胞結(jié)構(gòu)的低豐度蛋白,而且可以部分提示蛋白質(zhì)的定位和功能信息,成為蛋白質(zhì)鑒定及其功能研究的紐帶。由于果蠅這個多細胞生物的復(fù)雜的發(fā)育過程、豐富的行為學(xué)特征及不斷改進的多種策略和技術(shù)方法,其亞細胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究進展非常迅速,一些重要的亞細胞結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)組不斷得到分析,并已深入到亞細胞器和復(fù)合體水平。Was?brough等[16]利用LC-MS/MS的方法分離分析了果蠅精子蛋白質(zhì)組,獲得了包含956個精子相關(guān)蛋白的數(shù)據(jù)集。Muller等[17]分析了果蠅胚胎中心體的蛋白質(zhì)組學(xué)研究,共鑒定到蛋白251個。Khanna等[18]利用相似方法研究了質(zhì)膜蛋白質(zhì)組,鑒定了432個蛋白。Cammarato等[19]也利用該方法對145個果蠅心臟組織進行蛋白質(zhì)組分離分析,共鑒定了1228個相關(guān)蛋白質(zhì)。不但如此,亞細胞蛋白質(zhì)組還向更深方向發(fā)展。Anholt等[20]以果蠅觸角為研究材料,初步探索了果蠅的可溶性蛋白質(zhì)組,發(fā)現(xiàn)了100多個相關(guān)蛋白。這些有益的嘗試都加深了我們對蛋白質(zhì)在特異組織及細胞內(nèi)的特異表達、轉(zhuǎn)運、定位及其生物學(xué)功能的理解。

    3 果蠅蛋白質(zhì)組修飾譜

    蛋白質(zhì)翻譯后修飾在生命活動中起著十分重要的作用,它使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜、功能更為完善、調(diào)節(jié)更為精細、作用更為專一。研究較多的果蠅的蛋白質(zhì)翻譯后修飾形式主要是磷酸化、泛素化、糖基化、類泛素化及組蛋白的甲基化。在體內(nèi),各種翻譯后修飾過程不是孤立存在的,而是相互作用、共同調(diào)節(jié)的。

    3.1 磷酸化修飾

    蛋白質(zhì)磷酸化修飾涉及細胞信號傳導(dǎo)、神經(jīng)活動、肌肉收縮及細胞的增殖、發(fā)育和分化等生理、病理過程,在生命活動發(fā)展中發(fā)揮著巨大的作用。Zhai等[21]利用一套完整的磷酸化富集和鑒定體系,包括強陽離子交換色譜、金屬離子親和色譜和高精度的質(zhì)譜體系,在果蠅的胚胎中共鑒定到13 720個磷酸化位點,來自2702個蛋白,建立了當(dāng)時規(guī)模最大的果蠅磷酸化數(shù)據(jù)集。在果蠅的蛋白質(zhì)磷酸化修飾的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中,人們致力于不斷提高磷酸肽的富集效率和質(zhì)譜的鑒定水平,以此提高果蠅蛋白質(zhì)組的磷酸化修飾譜。Pinkse等[22]利用基于二氧化鈦富集的二維色譜方法,使果蠅S2細胞系的磷酸肽鑒定量與僅借助SCX相比翻了4番,高達2152個,大大加強了磷酸肽的富集效果。Bodenmiller等[23]不但通過改進磷酸肽的富集方式將果蠅Kc167細胞系的磷酸肽的鑒定從299提高到494個,并且經(jīng)MS3質(zhì)譜譜圖的確認,提高了鑒定的可信度,也將磷酸化肽的鑒定數(shù)目提高到505個,其中25個蛋白(5%)都是這種新方法單獨鑒定的結(jié)果。這一嘗試使果蠅的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究有了巨大飛躍。另外通過將ETD和CID結(jié)合,進一步提高了果蠅Kc167細胞系磷酸化肽的鑒定率,其中ETD單獨鑒定了153個磷酸肽。這與提高磷酸肽富集效率的方法異曲同工,對果蠅修飾蛋白質(zhì)組的鑒定做出了巨大貢獻[24]。Courcelles等[25]發(fā)明了一種算法,可以鑒定磷酸肽的同分異構(gòu)體,在果蠅的磷酸化蛋白質(zhì)組鑒定中共得到15 700個磷酸肽,證明了在LC-MS的洗脫層面有8%~12%的磷酸肽都含有同分異構(gòu)體。

    3.2 泛素化和類泛素化修飾

    蛋白質(zhì)泛素化和類泛素化修飾對于蛋白質(zhì)的定位、代謝、功能、調(diào)節(jié)和降解起著重要作用。隨著蛋白質(zhì)翻譯后修飾研究的不斷深入,蛋白質(zhì)泛素化的新的功能不斷被挖掘,包括參與細胞周期、增殖、凋亡、分化、轉(zhuǎn)移、基因表達、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、信號傳遞、損傷修復(fù)、炎癥免疫等幾乎一切生命活動的調(diào)控,并且在腫瘤、心血管等疾病發(fā)病中起十分重要的作用,是近年來生物化學(xué)研究的一項重大成果,亦是研究、開發(fā)新藥物的新靶點。Franco等[26]利用蛋白質(zhì)組學(xué)策略,在果蠅的胚胎細胞中鑒定到48個神經(jīng)細胞特異的泛素化底物。更為重要的是,這些泛素化底物都是首次被鑒定到,并且沒有任何同源的蛋白質(zhì)具有泛素化的證據(jù),說明這種蛋白質(zhì)組學(xué)方法鑒定的神經(jīng)細胞的泛素化底物并不與其他細胞類型共有。Nie等[27]在果蠅的早期胚胎細胞中鑒定到140個早期類泛素化底物,并且驗證了這些底物分別參與細胞周期調(diào)控、Ras信號通路和早期形體形成過程。類泛素化蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)集的產(chǎn)生,為以后研究類泛素化的功能提供了便利。Xu等[28]發(fā)展了一種果蠅近乎全標記的SILAC方法,并發(fā)現(xiàn)果蠅在成蟲期隨年齡的增長K48和K63泛素鏈具有不同的變化趨勢,表明蛋白質(zhì)的泛素化及其狀態(tài)和生物壽命相關(guān)。

    3.3 組蛋白修飾

    組蛋白上的翻譯后修飾主要有4種情況,即乙酰化、磷酸化、甲基化和ADP-核糖基化。甲基化和乙?;c轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)有關(guān),特別是組蛋白乙?;瘜τ诓溉閯游锷镧姷恼{(diào)控是非常重要的[29]。Ardehali等[30]通過多線染色體染色和活細胞成像技術(shù),首次發(fā)現(xiàn)了一種位于啟動子區(qū)域的負責(zé)組蛋白H3K4三甲基化的蛋白dSet1。該蛋白依賴的H3K4三甲基化負責(zé)染色體結(jié)構(gòu)的形成,并保證RNA聚合酶Ⅱ的合成供給,進而完成對轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)。

    Imhof等[31]發(fā)現(xiàn)組蛋白H1的修飾形式隨多細胞生物的不同生長階段而變化。以果蠅胚胎為例,S10期的H1單磷酸化豐度明顯比胚胎期的少,說明翻譯后修飾與細胞周期和細胞分化相關(guān)。這是首次在果蠅中進行組蛋白的翻譯后形式的鑒定,為后續(xù)研究提供了依據(jù)。

    乙?;瘜虮磉_的調(diào)控已廣為人知。這一新的研究更讓人們確定組蛋白的乙?;瘜虮磉_的調(diào)控具有廣泛的作用[32],而果蠅可以作為很好的模型來驗證這一論斷,進而推動組蛋白修飾在生命發(fā)展過程中發(fā)揮更加積極的作用。

    4 果蠅比較蛋白質(zhì)組

    蛋白質(zhì)組具有動態(tài)、多樣和時空特異性。即使在細胞發(fā)育的不同階段,因不同時期、不同條件,蛋白質(zhì)組的構(gòu)成也不斷地變化。因此,分析比較不同條件下蛋白質(zhì)組的變化和差異,發(fā)現(xiàn)和鑒定在不同生理條件下蛋白質(zhì)組中的差異組分,從中揭示生命的奧秘,這些構(gòu)成了比較蛋白質(zhì)組學(xué)的研究內(nèi)容。然而,比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究由于并不要求捕獲“全部”蛋白,而重在找出有意義的差異蛋白,因而在技術(shù)上有著相當(dāng)高的可實現(xiàn)性。目前常用的方法主要分為有標定量(labeling quantitation)和無標定量(la?bel-free quantitation)2類。有標定量又可分為化學(xué)標記方法[如同位素標記的親和標簽(isotope-cod?ed affinity tag,ICAT)、串聯(lián)質(zhì)譜標簽(tandem mass tag,TMT)、同位素相對標記與絕對定量技術(shù)(isobar?ic tagging for relative and absolute quantitation,iTRAQ)]和代謝標記方法[(細胞培養(yǎng)氨基酸穩(wěn)定同位素標記(stable isotope labeling with amino acids in cell culture,SILAC)、15N代謝標記方法][33]。目前果蠅中應(yīng)用較廣泛的有15N標記、SILAC、iTRAQ及無標定量方法。

    4.1 15N標記方法

    2003年Krijgsveld等[34]首次提出了果蠅全蛋白質(zhì)組的代謝標記策略。用只含15N的培養(yǎng)基標記酵母,再以此喂養(yǎng)生長在以這些標記酵母為惟一氮源的培養(yǎng)基中的果蠅卵,經(jīng)質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn)15N的標記效率約為95%,證明果蠅可通過1個世代得到幾乎完全的標記。Findlay等[35]利用該技術(shù)研究了果蠅交配時精液蛋白對生殖的影響,發(fā)現(xiàn)了19個原先沒有注釋的基因。這種代謝標記和非標記果蠅可在蛋白樣品抽提前混合,因此可以極大地減少樣品操作過程引起的誤差。缺點是不同肽中標記的氮原子數(shù)目不同,致使標記與非標記肽的相對分子質(zhì)量位移在鑒定前不能預(yù)測,且標記肽段形成寬泛的同位素峰分布,增加了蛋白質(zhì)鑒定中的假陽性率和定量的難度。

    4.2 SILAC標記方法

    與15N標記方法不同,SILAC標記是利用重穩(wěn)定性同位素標記的氨基酸在生長過程中對目標蛋白質(zhì)組進行標記。這種標記和非標肽段的相對分子質(zhì)量位移是可以提前預(yù)測的,并且隨后的蛋白質(zhì)分離、酶切、鑒定等所有過程都在同一條件下進行,誤差小,重復(fù)性好,因此逐漸取代15N標記方法而成為現(xiàn)階段同位素代謝標記的金標準[37]。Bonaldi等[38]利用ISWI基因缺陷型果蠅模型和對照組的SILAC方法標記果蠅SL2細胞系,用LTQ-Orbitrap質(zhì)譜儀鑒定到4119個蛋白,同時得到了因ISWI基因表達水平的改變而引起的幾百個在轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組水平表達產(chǎn)生顯著差異的蛋白。Sury等[39]報道,在果蠅中SILAC標記的效率可以達到近100%,為果蠅的SILAC標記提供了更廣闊的應(yīng)用空間。Xu等[28]也利用賴氨酸重標酵母的方法對果蠅進行了近乎完全的標記,并在果蠅的泛素化蛋白質(zhì)組研究中得到良好的應(yīng)用,為果蠅翻譯后修飾蛋白質(zhì)組的研究奠定了堅實基礎(chǔ)。

    4.3 ICAT標記方法

    ICAT是由Gygi等[40]開發(fā)的一種同位素親和標簽標記和定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究策略。該方法通過在蛋白水平分別加入不同標記的ICAT試劑,反應(yīng)后等比例混合進行消化和質(zhì)譜分析。實踐表明ICAT試劑存在一些不足,如不能分析半胱氨酸缺失的蛋白質(zhì)、標記和非標記肽不能被同步洗脫、難于精確定量等。另外,ICAT標簽試劑本身的相對分子質(zhì)量約為500,增加了譜圖和數(shù)據(jù)庫搜索的復(fù)雜性。為解決這些技術(shù)上的缺陷,先后又開發(fā)了可剪切ICAT(cleav?able ICAT,cICAT)試劑,用可被酸剪切的官能團代替ICAT試劑中的聚醚鏈接,以此減少難以解析的碎片離子數(shù)量;以9個13C取代8個氘原子,使輕、重同位素試劑相對分子質(zhì)量相差9,不僅便于質(zhì)譜分辨不同分子質(zhì)量的標簽,而且使得輕、重肽段可被色譜共洗脫,有效提高了定量精度。Kohler等[41]用cICAT標記方法檢測了普通幼蟲期果蠅和饑餓狀態(tài)下的脂肪體蛋白質(zhì)的表達變化,監(jiān)測到脂肪脫氫酶Desat1缺失時果蠅幼蟲細胞在喪失饑餓狀態(tài)下的自我吞噬的功能,首次揭示了Desat1在脂滴形成和自體吞噬中的作用。這種cICAT標記試劑的缺點是合成成本太高,難以普及使用。

    4.4 iTRAQ標記方法

    iTRAQ標記是化學(xué)標記的一種,可同時標記并比較8種不同樣本,提高了分析通量。Pflieger等[42]使用iTRAQ技術(shù)對蛋白磷酸酶處理后果蠅細胞系進行研究,通過比較蛋白質(zhì)的磷酸化狀態(tài),發(fā)現(xiàn)了胰島素受體的同源序列Chico。Pedersen等[43]為了檢測果蠅中的溫度敏感致死因子,采用iTRAQ技術(shù)對實驗組、近交系對照組和遠交系對照組進行不同的化學(xué)標簽標記,經(jīng)二維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析,共鑒定到45個在實驗組和近交系對照組發(fā)生了明顯變化的可能的溫度敏感蛋白,這些蛋白在近交系和遠交系對照組中并沒有發(fā)生顯著的量的變化,進一步證明了這些溫度敏感差異蛋白的真實性。但這種標記方法要求對比較的蛋白組必須進行提取、蛋白酶消化和脫鹽處理等多個步驟,然后才能進行標記、混合和質(zhì)譜鑒定、定量。這會引入試驗誤差,增加了發(fā)現(xiàn)真實的生物學(xué)差異蛋白的難度。

    4.5 無標定量方法

    無標定量方法不進行任何標記,而是直接利用質(zhì)譜鑒定中產(chǎn)生的數(shù)據(jù),比如樣品酶切后經(jīng)LC-MS/MS產(chǎn)生的質(zhì)譜數(shù)據(jù)對蛋白樣品進行定量比較。這種方法簡便易行,在果蠅定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究上也得到了廣泛應(yīng)用。Xun等[44]利用該方法分析了帕金森病果蠅模型的蛋白質(zhì)組,在A53T α-突觸核蛋白果蠅模型中鑒定、定量了253個蛋白,并在重疊區(qū)域篩選到24個表達差異蛋白。這些蛋白主要與膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、肌動蛋白細胞骨架、線粒體和核糖體相關(guān)。Xun等[45]將無標定量和廣泛型內(nèi)標技術(shù)相結(jié)合,定量了青少年型帕金森病果蠅模型(AR-JP),共定量了375個蛋白。其中16個蛋白具有顯著的表達差異,參與能量代謝的失調(diào)蛋白有7個,并有6個表達下調(diào),說明青少年型帕金森病和能量代謝有較高的關(guān)聯(lián)性;參與蛋白轉(zhuǎn)運活動的5個蛋白均表現(xiàn)出較高的水平,如幼蟲血清蛋白1α、1β、1γ和脂肪體蛋白1均顯示出高于10倍的上調(diào)水平。盡管同位素標記已成為可信賴的定量方法,但準備同位素化合物需大量時間,并且試劑昂貴,難以推廣,而非標定量法不存在這些缺點,應(yīng)用前景廣闊。但非標定量法對樣品制備和分析過程的控制要求較高,否則難以得到可信的結(jié)果。

    5 果蠅疾病模型蛋白質(zhì)組

    近一個世紀以來,果蠅作為生命科學(xué)領(lǐng)域的一種理想的模式生物,在生物學(xué)研究的舞臺上占有舉足輕重的地位。十幾年前完成的果蠅的基因組測序結(jié)果顯示,超過60%的人類疾病基因在果蠅的基因組中有直系同源物,其中人類的腫瘤、神經(jīng)疾病、畸形綜合征等相關(guān)基因多與果蠅基因同源。因此,以果蠅為模式研究人類疾病的發(fā)病機制有非常重要的意義[46]。

    Xun等[47]利用液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),對A30P α-突觸核蛋白轉(zhuǎn)基因果蠅和對照的早期帕金森病果蠅模型進行了蛋白質(zhì)組研究,結(jié)果顯示約44%的基因在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)水平均發(fā)生了改變,但變化趨勢不完全一致。蛋白質(zhì)組研究彌補了轉(zhuǎn)錄本研究的不足,對后期疾病狀態(tài)的預(yù)測有較大的幫助。他們在該研究中還發(fā)現(xiàn),早期的細胞骨架和線粒體差異蛋白主要與神經(jīng)退化相關(guān)。

    Beller等[49]比較了野生型和脂肪儲存缺陷型果蠅的脂肪滴成分的差異,在鑒定到的248個蛋白中,除了發(fā)現(xiàn)與脂肪滴相關(guān)的PAT蛋白外,還鑒定了參與蛋白質(zhì)胞內(nèi)定位和多層面轉(zhuǎn)運的一些相關(guān)蛋白。Li等[50]利用2-DE技術(shù)研究了經(jīng)飲食抑制劑BBI處理后果蠅胚胎中腸蛋白質(zhì)組的變化,發(fā)現(xiàn)了9種表達差異蛋白,例如固醇載體蛋白SCPX參與了脂肪酸代謝過程。脂滴和脂肪酸代謝直接介導(dǎo)肝臟脂質(zhì)代謝,是肝病發(fā)生和發(fā)展的主要成因,這為人類肝臟疾病的研究提供了依據(jù)。

    Chan等[51]利用果蠅模型研究了VCP基因引起的額顳葉癡呆?。↖BMPFD)的比較蛋白質(zhì)組。利用2D-DIGE方法在轉(zhuǎn)基因果蠅模型中鑒定了43個蛋白點,并發(fā)現(xiàn)VCP的突變消耗了大量ATP,為節(jié)約能量,導(dǎo)致肌動蛋白關(guān)閉,由此激活ROS信號通路,進而引發(fā)細胞凋亡。這是蛋白質(zhì)組學(xué)在探索IBMPFD分子機制方面的新發(fā)現(xiàn),為發(fā)病機理的研究和治療靶點的尋找提供了有力證據(jù)。

    6 結(jié)語

    利用果蠅進行遺傳學(xué)研究的歷史悠久,對其染色體組成、編碼基因、蛋白質(zhì)定位和表型等的詳細闡明都是其他生物無法比擬的。百余年的研究也積累了很多果蠅的相關(guān)知識與信息,制備了大量分布于數(shù)以千計的基因中的突變體,為構(gòu)建果蠅的各種疾病模型奠定了基礎(chǔ)。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展,果蠅還將繼續(xù)作為重要的模式生物被廣泛用于生命科學(xué)的各個研究領(lǐng)域。這為開展與疾病相關(guān)的臨床蛋白質(zhì)組學(xué)(clinical proteomics)研究,揭示生命的奧秘和疾病發(fā)生發(fā)展的分子機制奠定堅實的基礎(chǔ)。

    [1]Beller M,Oliver B.One hundred years of high-throughput Drosophila research[J].Chromosome Res,2006,14(4):349-362.

    [2]Bier E.Drosophila,the golden bug,emerges as a tool for hu?man genetics[J].Nat Rev Genet,2005,6(1):9-23.

    [3]Chien S,Reiter L T,Bier E,et al.Homophila:human dis?ease gene cognates in Drosophila[J].Nucleic Acids Res,2002,30(1):149-151.

    [4]Adams M D,Celniker S E,Holt R A,et al.The genome se?quence of Drosophila melanogaster[J].Science,2000,287(5461):2185-2195.

    [5]Grumbling G,Strelets V.FlyBase:anatomical data,images and queries[J].Nucleic Acids Res,2006,34(Database issue):D484-D488.

    [6]Mushegian A R,Garey J R,Martin J,et al.Large-scale taxo?nomic profiling of eukaryotic model organisms:a comparison of orthologous proteins encoded by the human,fly,nematode,and yeast genomes[J].Genome Res,1998,8(6):590-598.

    [7]Venken K J,Bellen H J.Emerging technologies for gene ma?nipulation in Drosophila melanogaster[J].Nat Rev Genet,2005,6(3):167-178.

    [8]Alonso J,Rodriguez J M,Baena-Lopez L A,et al.Character?ization of the Drosophila melanogaster mitochondrial proteome[J].J Proteome Res,2005,4(5):1636-1645.

    [9]Alonso J,Santaren J F,Proteomic analysis of the wing imagi?nal discs of Drosophila melanogaster[J].Proteomics,2005,5(2):474-489.

    [10]Vierstraete E,Verleyen P,De Loof A,et al.Differential pro?teomics for studying Drosophila immunity[J].Ann N Y Acad Sci,2005,1040:504-507.

    [11]Takemori N,Yamamoto T T.Proteome mapping of the Dro?sophila melanogaster male reproductive system[J].Proteomics,2009,9(9):2484-2493.

    [12]Lee T R,Huang S H,Lee C C,et al.Proteome reference map of Drosophila melanogaster head[J].Proteomics,2012,12(11):1875-1878.

    [13]Tannu N S,Hemby S E.Two-dimensional fluorescence differ?ence gel electrophoresis for comparative proteomics profiling[J].Nat Protoc,2006,1(4):1732-1742.

    [14]Iwadate Y.Clinical proteomics in cancer research-promises and limitations of current two-dimensional gel electrophoresis[J].Curr Med Chem,2008,15(23):2393-2400.

    [15]Brunner E,Ahrens C H,Mohanty S,et al.A high-quality catalog of the Drosophila melanogaster proteome[J].Nat Bio?technol,2007,25(5):576-583.

    [16]Wasbrough E R,Dorus S,Hester S,et al.The Drosophila me?lanogaster sperm proteome-II(DmSP-II)[J].J Proteomics,2010,73(11):2171-2185.

    [17]Muller H,Schmidt D,Steinbrink S,et al.Proteomic and func?tional analysis of the mitotic Drosophila centrosome[J].EMBO J,2010,29(19):3344-3357.

    [18]Khanna M R,Stanley B A,Thomas G H.Towards a mem?brane proteome in Drosophila:a method for the isolation of plasma membrane[J].BMC Genomics,2010,11:302.

    [19]Cammarato A,Ahrens C H,Alayari N N,et al.A mighty small heart:the cardiac proteome of adult Drosophila melano?gaster[J].PLoS One,2011,6(4):e18497.

    [20]Anholt R R,Williams T I.The soluble proteome of the Dro?sophila antenna[J].Chem Senses,2010,35(1):21-30.

    [21]Zhai B,Villen J,Beausoleil S A,et al.Phosphoproteome anal?ysis of Drosophila melanogaster embryos[J].J Proteome Res,2008,7(4):1675-1682.

    [22]Pinkse M W,Mohammed S,Gouw J W,et al.Highly robust,automated, and sensitive online TiO2-based phosphopro?teomics applied to study endogenous phosphorylation in Dro?sophila melanogaster[J].J Proteome Res,2008,7(2):687-697.

    [23]Bodenmiller B,Malmstrom J,Gerrits B,et al.PhosphoPep--a phosphoproteome resource for systems biology research in Dro?sophila Kc167 cells[J].Mol Syst Biol,2007,3:139.

    [24]Domon B,Bodenmiller B,Carapito C,et al.Electron transfer dissociation in conjunction with collision activation to investi?gate the Drosophila melanogaster phosphoproteome[J].J Pro?teome Res,2009,8(6):2633-2639.

    [25]Courcelles M,Bridon G,Lemieux S,et al.Occurrence and de?tection of phosphopeptide isomers in large-scale phosphopro?teomics experiments[J].J Proteome Res,2012,11(7):3753-3765.

    [26]Franco M,Seyfried N T,Brand A H,et al.A novel strategy to isolate ubiquitin conjugates reveals wide role for ubiquitina?tion during neural development[J].Mol Cell Proteomics,2011,10(5):M110 002188.

    [27]Nie M,Xie Y,Loo J A,et al.Genetic and proteomic evi?dence for roles of Drosophila SUMO in cell cycle control,Ras signaling,and early pattern formation[J].PLoS One,2009,4(6):e5905.

    [28]Xu P,Tan H,Duong D M,et al.,Stable isotope labeling with amino acids in Drosophila for quantifying proteins and modifications[J].J Proteome Res,2012,11(9):4403-4412.

    [29]Boros I M.Histone modification in Drosophila[J].Brief Funct Genomics,2012,11(4):319-331.

    [30]Ardehali M B,Mei A,Zobeck K L,et al.Drosophila Set1 is the major histone H3 lysine 4 trimethyltransferase with role in transcription[J].EMBO J,2011,30(14):2817-2828.

    [31]Villar-Garea A,Imhof A.Fine mapping of posttranslational modifications of the linker histone H1 from Drosophila mela?nogaster[J].PLoS One,2008,3(2):e1553.

    [32]Xiong Y,Guan K L.Mechanistic insights into the regulation of metabolic enzymes by acetylation[J].J Cell Biol,2012,198(2):155-164.

    [33]Li Z,Adams R M,Chourey K,et al.Systematic comparison of label-free,metabolic labeling,and isobaric chemical label?ing for quantitative proteomics on LTQ Orbitrap Velos[J].J Proteome Res,2012,11(3):1582-1590.

    [34]Krijgsveld J,Ketting R F,Mahmoudi T,et al.Metabolic label?ingofC.elegansand D.melanogasterforquantitativepro?teomics[J].Nat Biotechnol,2003,21(8):927-931.

    [35]Findlay G D,Yi X,Maccoss M J,et al.Proteomics reveals novel Drosophila seminal fluid proteins transferred at mating[J].PLoS Biol,2008,6(7):e178.

    [36]Ong S E,Blagoev B,Kratchmarova I,et al.Stable isotope la?beling by amino acids in cell culture,SILAC,as a simple and accurate approach to expression proteomics[J].Mol Cell Proteomics,2002,1(5):376-386.

    [37]Ong S E,Mann M.A practical recipe for stable isotope label?ing by amino acids in cell culture(SILAC)[J].Nat Protoc,2006,1(6):2650-2660.

    [38]Bonaldi T,Straub T,Cox J,et al.Combined use of RNAi and quantitative proteomics to study gene function in Drosoph?ila[J].Mol Cell,2008,31(5):762-772.

    [39]Sury M D,Chen J X,Selbach M.The SILAC fly allows for accurate protein quantification in vivo[J].Mol Cell Proteomics,2010,9(10):2173-2183.

    [40]Gygi S P,Rist B,Gerber S A,et al.Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags[J].Nat Biotechnol,1999,17(10):994-999.

    [41]Kohler K,Brunner E,Guan X L,et al.A combined pro?teomic and genetic analysis identifies a role for the lipid de?saturase Desat1 in starvation-induced autophagy in Drosophila[J].Autophagy,2009,5(7):980-990.

    [42]Pflieger D,Junger M A,Muller M,et al.Quantitative pro?teomic analysis of protein complexes:concurrent identification of interactors and their state of phosphorylation[J].Mol Cell Proteomics,2008,7(2):326-346.

    [43]Pedersen K S,Codrea M C,Vermeulen C J,et al.Proteomic characterization ofa temperature-sensitive conditionallethal in Drosophila melanogaster[J].Heredity(Edinb),2010,104(2):125-134.

    [44]Xun Z,Sowell R A,Kaufman T C,et al.Quantitative pro?teomics of a presymptomatic A53T alpha-synuclein Drosophi?la model of Parkinson disease[J].Mol Cell Proteomics,2008,7(7):1191-203.

    [45]Xun Z,Kaufman T C,Clemmer D E.Stable isotope labeling and label-free proteomics of Drosophila parkin null mutants[J].J Proteome Res,2009,8(10):4500-4510.

    [46]Rubin G M,Yandell M D,Wortman J R,et al.Comparative genomics of the eukaryotes[J].Science,2000,287(5461):2204-2215.

    [47]Xun Z,Sowell R A,Kaufman T C,et al.Protein expression in a Drosophila model of Parkinson's disease[J].J Proteome Res,2007,6(1):348-357.

    [48]Xun Z,Sowell R A,Kaufman T C,et al.Lifetime proteomic profiling of an A30P alpha-synuclein Drosophila model of Par?kinson's disease[J].J Proteome Res,2007,6(9):3729-3738.

    [49]Beller M,Riedel D,Jansch L,et al.Characterization of the Drosophila lipid droplet subproteome[J].Mol Cell Proteomics,2006,5(6):1082-1094.

    [50]Li H M,Margam V,Muir W M,et al.Changes in Drosophi?la melanogaster midgut proteins in response to dietary Bow?man-Birk inhibitor[J].Insect Mol Biol,2007,16(5):539-549.

    [51]Chan H T,Lee T R,Huang S H,et al.Proteomic analysis of a drosophila IBMPFD model reveals potential pathogenic mechanisms[J].Mol Biosyst,2012,8(6):1730-1741.

    猜你喜歡
    泛素果蠅組學(xué)
    果蠅也會“觸景傷身”
    小果蠅大貢獻
    果蠅遇到危險時會心跳加速
    小果蠅助力治療孤獨癥
    口腔代謝組學(xué)研究
    基于UHPLC-Q-TOF/MS的歸身和歸尾補血機制的代謝組學(xué)初步研究
    蛋白泛素化和類泛素化修飾在植物開花時間調(diào)控中的作用
    代謝組學(xué)在多囊卵巢綜合征中的應(yīng)用
    泛RNA:miRNA是RNA的“泛素”
    泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域與泛素化信號的識別
    天美传媒精品一区二区| 在线播放无遮挡| 欧美三级亚洲精品| 午夜福利在线在线| 亚洲精品粉嫩美女一区| 欧美精品国产亚洲| 老鸭窝网址在线观看| 午夜激情欧美在线| 人人妻人人看人人澡| 永久网站在线| 久久这里只有精品中国| 免费人成视频x8x8入口观看| 免费黄网站久久成人精品 | 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 听说在线观看完整版免费高清| av女优亚洲男人天堂| 99热这里只有是精品50| 九九在线视频观看精品| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 美女大奶头视频| 露出奶头的视频| 亚洲精品久久国产高清桃花| 男女那种视频在线观看| 国产视频一区二区在线看| 亚洲片人在线观看| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 亚洲av电影不卡..在线观看| 黄色配什么色好看| 最新中文字幕久久久久| 免费观看人在逋| 欧美色欧美亚洲另类二区| 日日夜夜操网爽| 三级国产精品欧美在线观看| 亚洲av免费在线观看| 在线观看午夜福利视频| 好男人在线观看高清免费视频| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 久久精品国产亚洲av天美| 757午夜福利合集在线观看| 亚洲乱码一区二区免费版| 色综合站精品国产| 久久99热6这里只有精品| 久久久久久久久中文| ponron亚洲| 哪里可以看免费的av片| av女优亚洲男人天堂| 欧美最黄视频在线播放免费| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 免费大片18禁| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 少妇熟女aⅴ在线视频| 日韩欧美精品v在线| 国产精品女同一区二区软件 | 赤兔流量卡办理| 久久热精品热| 国产成人福利小说| 免费在线观看成人毛片| 国产免费男女视频| 99久久精品热视频| 真人一进一出gif抽搐免费| 怎么达到女性高潮| 又粗又爽又猛毛片免费看| 久久久久久国产a免费观看| 欧美日韩福利视频一区二区| 91狼人影院| 村上凉子中文字幕在线| 天美传媒精品一区二区| 亚洲人成网站在线播| 欧美激情久久久久久爽电影| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 亚洲黑人精品在线| 国产综合懂色| 91久久精品电影网| 中文字幕熟女人妻在线| 亚洲欧美精品综合久久99| 日本熟妇午夜| 丰满的人妻完整版| 欧美色视频一区免费| 十八禁国产超污无遮挡网站| 一进一出抽搐gif免费好疼| 亚洲国产欧美人成| 性欧美人与动物交配| 一个人看视频在线观看www免费| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 欧美成人性av电影在线观看| 国产在视频线在精品| 在线a可以看的网站| 国产免费av片在线观看野外av| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 国产精品亚洲一级av第二区| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 三级毛片av免费| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 婷婷色综合大香蕉| 午夜福利视频1000在线观看| 少妇的逼水好多| 午夜福利在线在线| 天天躁日日操中文字幕| 亚洲在线观看片| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 免费大片18禁| 国产精品久久电影中文字幕| 999久久久精品免费观看国产| АⅤ资源中文在线天堂| 欧美丝袜亚洲另类 | 一级a爱片免费观看的视频| av视频在线观看入口| 亚洲avbb在线观看| 又紧又爽又黄一区二区| 国产一区二区在线av高清观看| 亚洲人与动物交配视频| 欧美激情国产日韩精品一区| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 国产成人影院久久av| 日韩大尺度精品在线看网址| 日本与韩国留学比较| 成人午夜高清在线视频| 观看免费一级毛片| 国产精品综合久久久久久久免费| 淫秽高清视频在线观看| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 日韩精品中文字幕看吧| 国产私拍福利视频在线观看| 在线免费观看不下载黄p国产 | 精华霜和精华液先用哪个| 毛片一级片免费看久久久久 | 久久久久久久久中文| 久久国产乱子伦精品免费另类| 欧美成人性av电影在线观看| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 精品人妻偷拍中文字幕| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 亚洲精品在线美女| 免费观看人在逋| 老司机福利观看| 九九在线视频观看精品| 久久久久久大精品| 日本三级黄在线观看| 成年女人看的毛片在线观看| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 亚洲专区中文字幕在线| 欧美成人性av电影在线观看| 99精品在免费线老司机午夜| 3wmmmm亚洲av在线观看| 成人av在线播放网站| 99久久99久久久精品蜜桃| 一级a爱片免费观看的视频| 一边摸一边抽搐一进一小说| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 亚洲中文字幕日韩| 俄罗斯特黄特色一大片| 国产大屁股一区二区在线视频| 免费在线观看影片大全网站| 午夜亚洲福利在线播放| av在线老鸭窝| 亚洲精品日韩av片在线观看| 99在线视频只有这里精品首页| 91九色精品人成在线观看| 五月伊人婷婷丁香| 精品一区二区三区视频在线| 少妇高潮的动态图| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 老司机午夜十八禁免费视频| 一区二区三区激情视频| 亚洲最大成人av| 如何舔出高潮| 永久网站在线| 欧美激情在线99| 亚洲在线观看片| 午夜影院日韩av| 国产成人影院久久av| 午夜久久久久精精品| 在线观看av片永久免费下载| 日本a在线网址| 日韩欧美国产在线观看| 人人妻人人澡欧美一区二区| 午夜福利视频1000在线观看| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 亚洲av成人av| 国产精品永久免费网站| 亚洲精品一区av在线观看| 91久久精品国产一区二区成人| 男女那种视频在线观看| 精品久久久久久久久亚洲 | 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 日本免费一区二区三区高清不卡| 最近最新免费中文字幕在线| 91在线观看av| 日本精品一区二区三区蜜桃| 人妻久久中文字幕网| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 99国产综合亚洲精品| 欧美国产日韩亚洲一区| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 亚洲五月天丁香| 成人欧美大片| 他把我摸到了高潮在线观看| 成年女人毛片免费观看观看9| 国产视频一区二区在线看| 一个人免费在线观看的高清视频| 真实男女啪啪啪动态图| 深夜a级毛片| 午夜福利视频1000在线观看| 看十八女毛片水多多多| av在线天堂中文字幕| 午夜久久久久精精品| 人人妻人人澡欧美一区二区| 简卡轻食公司| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 深夜精品福利| 亚洲久久久久久中文字幕| 亚洲成人久久性| 69人妻影院| 国内精品久久久久精免费| 少妇人妻一区二区三区视频| 毛片女人毛片| 国产乱人伦免费视频| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国产野战对白在线观看| 简卡轻食公司| 欧美三级亚洲精品| av视频在线观看入口| av专区在线播放| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 18+在线观看网站| 国产伦精品一区二区三区视频9| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 熟女电影av网| 夜夜爽天天搞| 国产伦一二天堂av在线观看| 欧美黑人欧美精品刺激| 久久精品国产亚洲av天美| 国产精品影院久久| 精品欧美国产一区二区三| 欧美激情久久久久久爽电影| 国产精品女同一区二区软件 | 成人毛片a级毛片在线播放| 狠狠狠狠99中文字幕| 可以在线观看毛片的网站| 婷婷六月久久综合丁香| 精品无人区乱码1区二区| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 黄色视频,在线免费观看| 观看免费一级毛片| 99久久精品热视频| 欧美丝袜亚洲另类 | 国产国拍精品亚洲av在线观看| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 亚洲美女黄片视频| 一进一出抽搐动态| 精品一区二区三区人妻视频| 丝袜美腿在线中文| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 亚洲av电影在线进入| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 91av网一区二区| 亚洲人成电影免费在线| 亚洲一区二区三区色噜噜| 亚洲国产精品成人综合色| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 欧美黑人欧美精品刺激| 精品久久久久久成人av| 亚洲真实伦在线观看| 亚洲av免费高清在线观看| 欧美不卡视频在线免费观看| 国产黄色小视频在线观看| 欧美潮喷喷水| 亚洲自偷自拍三级| 久久人妻av系列| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 欧美丝袜亚洲另类 | 欧美一区二区国产精品久久精品| 亚洲在线自拍视频| 免费av毛片视频| 如何舔出高潮| 美女大奶头视频| 热99re8久久精品国产| 国产精品久久久久久久电影| 亚洲精品影视一区二区三区av| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 欧美最黄视频在线播放免费| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 久久人妻av系列| 国内揄拍国产精品人妻在线| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 波多野结衣高清无吗| 美女cb高潮喷水在线观看| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 亚洲性夜色夜夜综合| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 国产一级毛片七仙女欲春2| 欧美日韩黄片免| 亚洲激情在线av| 中文字幕熟女人妻在线| 成年人黄色毛片网站| 中文资源天堂在线| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 嫩草影院入口| 欧美一级a爱片免费观看看| 精品久久久久久久久亚洲 | 看黄色毛片网站| 久久人人爽人人爽人人片va | 少妇丰满av| 两人在一起打扑克的视频| 中文字幕av成人在线电影| 亚洲av免费高清在线观看| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 51午夜福利影视在线观看| 赤兔流量卡办理| 国产av不卡久久| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 午夜a级毛片| 如何舔出高潮| 日韩欧美精品v在线| 久久久久性生活片| 亚洲精品一区av在线观看| 热99re8久久精品国产| 成人av一区二区三区在线看| 精品一区二区三区视频在线| 91久久精品电影网| 一进一出抽搐动态| 男人舔奶头视频| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 成年女人看的毛片在线观看| 亚洲成av人片免费观看| 麻豆久久精品国产亚洲av| 男插女下体视频免费在线播放| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 亚洲最大成人av| 真人做人爱边吃奶动态| a级毛片a级免费在线| 窝窝影院91人妻| 国产欧美日韩精品亚洲av| 最近最新中文字幕大全电影3| eeuss影院久久| 老司机午夜福利在线观看视频| 亚洲精品在线观看二区| 在线看三级毛片| 97碰自拍视频| 老司机午夜十八禁免费视频| 午夜影院日韩av| 国产视频内射| 午夜福利18| 亚洲欧美激情综合另类| 久久人人精品亚洲av| 99热6这里只有精品| ponron亚洲| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 精品一区二区三区人妻视频| 日韩有码中文字幕| 日韩精品青青久久久久久| 久99久视频精品免费| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 欧美日本亚洲视频在线播放| 麻豆av噜噜一区二区三区| av天堂在线播放| 午夜激情福利司机影院| 大型黄色视频在线免费观看| 热99re8久久精品国产| 久久精品人妻少妇| 欧美色欧美亚洲另类二区| av天堂在线播放| 亚洲欧美激情综合另类| 深夜a级毛片| 亚洲精品456在线播放app | 嫩草影院新地址| 亚洲,欧美,日韩| 午夜亚洲福利在线播放| 白带黄色成豆腐渣| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 又紧又爽又黄一区二区| 欧美成狂野欧美在线观看| 三级国产精品欧美在线观看| 日韩 亚洲 欧美在线| 大型黄色视频在线免费观看| 亚洲成a人片在线一区二区| 人人妻人人澡欧美一区二区| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 久久亚洲精品不卡| 国产大屁股一区二区在线视频| 黄片小视频在线播放| 国产成人a区在线观看| 亚洲av美国av| 亚洲三级黄色毛片| 色综合站精品国产| 欧美乱色亚洲激情| 男女视频在线观看网站免费| 婷婷精品国产亚洲av| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 国产视频一区二区在线看| 久久久久九九精品影院| 亚洲成人久久性| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产精品影院久久| 婷婷丁香在线五月| 丰满的人妻完整版| 国产探花在线观看一区二区| 中文字幕熟女人妻在线| 欧美精品啪啪一区二区三区| 国模一区二区三区四区视频| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 最近在线观看免费完整版| 一区二区三区高清视频在线| 99热6这里只有精品| 亚洲乱码一区二区免费版| 久久草成人影院| eeuss影院久久| 久久精品国产亚洲av天美| 国产私拍福利视频在线观看| 欧美潮喷喷水| 欧美一区二区亚洲| h日本视频在线播放| 最后的刺客免费高清国语| 不卡一级毛片| 99热6这里只有精品| 日韩成人在线观看一区二区三区| 国产成人啪精品午夜网站| 亚洲综合色惰| 窝窝影院91人妻| 久久久精品欧美日韩精品| 国产精品亚洲美女久久久| 欧美激情在线99| 日本成人三级电影网站| 成人性生交大片免费视频hd| av在线观看视频网站免费| 女人被狂操c到高潮| 亚洲片人在线观看| 成人美女网站在线观看视频| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 亚洲欧美清纯卡通| 亚洲精品亚洲一区二区| 中出人妻视频一区二区| 精品一区二区免费观看| 国产精品电影一区二区三区| 美女xxoo啪啪120秒动态图 | ponron亚洲| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 日本五十路高清| 色综合欧美亚洲国产小说| 亚洲综合色惰| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 亚洲性夜色夜夜综合| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 久久性视频一级片| 日韩欧美国产一区二区入口| 午夜福利成人在线免费观看| 深夜精品福利| 韩国av一区二区三区四区| 最近中文字幕高清免费大全6 | 久久久久久九九精品二区国产| 很黄的视频免费| 国产不卡一卡二| 久久国产精品人妻蜜桃| 欧美性猛交黑人性爽| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 性色avwww在线观看| 午夜福利高清视频| 一级av片app| 精品一区二区免费观看| 99久久精品一区二区三区| 一级毛片久久久久久久久女| 小说图片视频综合网站| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 午夜福利18| 国产av一区在线观看免费| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产熟女xx| 久久6这里有精品| 九九在线视频观看精品| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 日韩中字成人| 老司机福利观看| 亚洲国产精品sss在线观看| 婷婷丁香在线五月| 欧美黑人欧美精品刺激| 免费在线观看日本一区| 免费高清视频大片| 国产欧美日韩精品一区二区| 一夜夜www| 精品不卡国产一区二区三区| bbb黄色大片| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 乱码一卡2卡4卡精品| a级毛片免费高清观看在线播放| 日本熟妇午夜| 日韩亚洲欧美综合| 亚洲乱码一区二区免费版| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 国产精品乱码一区二三区的特点| 美女cb高潮喷水在线观看| 亚洲精品在线观看二区| 亚洲第一电影网av| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 桃红色精品国产亚洲av| 国产三级在线视频| 国产 一区 欧美 日韩| 亚洲av电影在线进入| 国产黄片美女视频| 精品人妻熟女av久视频| 国内揄拍国产精品人妻在线| 国产欧美日韩精品一区二区| 岛国在线免费视频观看| 两个人的视频大全免费| 中出人妻视频一区二区| 一二三四社区在线视频社区8| 在线观看舔阴道视频| 97热精品久久久久久| 91字幕亚洲| 内地一区二区视频在线| 亚洲内射少妇av| 黄色一级大片看看| 成人性生交大片免费视频hd| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 亚洲精品亚洲一区二区| 亚洲国产精品久久男人天堂| 欧美性猛交黑人性爽| 一个人看的www免费观看视频| 成人av在线播放网站| 国产不卡一卡二| 免费人成在线观看视频色| 久久6这里有精品| 12—13女人毛片做爰片一| 欧美成人免费av一区二区三区| www.999成人在线观看| 亚洲,欧美,日韩| 欧美乱妇无乱码| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产在线精品亚洲第一网站| 俄罗斯特黄特色一大片| 成年女人看的毛片在线观看| 一级av片app| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 日本在线视频免费播放| 丰满乱子伦码专区| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 99热6这里只有精品| 欧美午夜高清在线| 亚洲一区二区三区不卡视频| 禁无遮挡网站| 欧美在线黄色| 免费一级毛片在线播放高清视频| 天天躁日日操中文字幕| 欧美又色又爽又黄视频| 黄色丝袜av网址大全| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 麻豆成人av在线观看| 精品无人区乱码1区二区| 国产精品久久久久久精品电影| 亚洲中文日韩欧美视频| 精品久久久久久久末码| 精品人妻1区二区| 国产大屁股一区二区在线视频| 深爱激情五月婷婷| 日本黄大片高清| 老司机福利观看| 久久久久久国产a免费观看| 波野结衣二区三区在线| 国产视频内射| 五月玫瑰六月丁香| 亚洲最大成人中文| 给我免费播放毛片高清在线观看| 国产真实伦视频高清在线观看 | 精品人妻偷拍中文字幕| 直男gayav资源| 欧美性感艳星| 人妻夜夜爽99麻豆av| 99热这里只有精品一区| 久久精品综合一区二区三区| 在线观看免费视频日本深夜| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产精品一区二区三区四区久久| 国产精品国产高清国产av| 一进一出抽搐动态| 高清日韩中文字幕在线| 特级一级黄色大片| 一级作爱视频免费观看| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 成人美女网站在线观看视频| 欧美zozozo另类| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 国产色爽女视频免费观看| 两个人视频免费观看高清| 好男人电影高清在线观看| 天堂影院成人在线观看| 51午夜福利影视在线观看| 亚洲专区中文字幕在线| 午夜久久久久精精品| 51午夜福利影视在线观看| 大型黄色视频在线免费观看| 最近最新中文字幕大全电影3| 91在线精品国自产拍蜜月| 嫩草影视91久久| 国产高清三级在线| 免费人成视频x8x8入口观看| av在线观看视频网站免费| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 性插视频无遮挡在线免费观看| 精品久久久久久久久av| 一个人看的www免费观看视频| 麻豆av噜噜一区二区三区| 国产黄a三级三级三级人| .国产精品久久| 亚洲精品456在线播放app | 两人在一起打扑克的视频|