微小RNA分析技術研究進展

劉潛 ，付潔 ，宋海峰

1.中南大學 藥學院，湖南 長沙 410010；2.軍事醫(yī)學科學院 放射與輻射醫(yī)學研究所，北京 100850

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類起重要調(diào)控作用的非編碼小分子RNA。研究表明，miRNA-靶基因、miRNA-miRNA之間形成調(diào)控網(wǎng)絡，處于關鍵調(diào)節(jié)樞紐的miRNA有望成為疾病治療的靶標[1]或作為未來診斷疾病的有效生物標志物[2-3]。成熟miRNA具有以下特點：片段小，一般為18～25 nt；種類多，最新miRbase 18.0數(shù)據(jù)庫已收錄18 226條前體 miRNA與 21 643條成熟miRNA（http://www.mir?base.org）[4-5]；差異小，miRNA家族成員之間通常只相差一個堿基；表達水平低，相對于mRNA的表達量來說，miRNA的表達水平低。

針對miRNA基礎研究與后續(xù)藥物研發(fā)的4個主要不同階段（確定候選miRNA，miRNA時間/空間的表達差異，miRNA機理研究，miRNA候選藥物研究），我們著重闡述不同階段所普遍采用的先進分析技術：候選miRNA研究的克隆測序類技術；miRNA表達譜高通量芯片技術；目的miRNA及其前體表達水平的實時熒光定量PCR（qPCR）和Northern印跡技術；miRNA類核酸藥物的藥代動力學評價技術。

1 候選miRNA克隆測序類技術

克隆測序最早用于miRNA的分析和監(jiān)測，尤其是對于未知序列miRNA的確定，為發(fā)現(xiàn)新的候選miRNA提供基礎。最初的克隆測序方法首先需要對miRNA進行cDNA的文庫構建，再進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物隨后克隆到表達載體中，最后進行測序，該方法需要較大的初始樣本（幾百微克RNA）[8]。隨后Takada建立了一種快速擴增克隆法[9]，可以在較少樣本量的時候極大地提高miRNA檢測的靈敏度和準確度，但通量不夠（5種miRNA/反應）。Cummins在該方法的基礎上研制出標簽序列克隆法[10]，將通量大大提高（35種miRNA/反應），并被首次成功地應用于描繪成年小鼠睪丸和卵巢miRNA表達水平譜。

隨著RNA組學研究的開展，上述方法面對組織中海量的miRNA仍顯低效，新一代大規(guī)模平行測序平臺應運而生，如Roche Applied Science公司的454基因組測序技術、Illumina公司和Solexa technol?ogy公司合作開發(fā)的Illumina測序技術、Applied Bio?systems公司的 SOLiD（supported oligonucleotide li?gation and detection）測序技術等[11-12]。新型高通量測序技術均基于一種新的測序策略，即循環(huán)芯片測序法（cyclic-array sequencing），即對布滿樣品的芯片重復進行基于聚合酶反應（模板變性、引物退火雜交及延伸）及熒光序列讀取反應。該策略通過檢測目標miRNA的標簽序列和出現(xiàn)頻率，達到尋找和發(fā)現(xiàn)新miRNA的目的，能同時測定幾百種miRNA。Il?lumina基因組分析儀測定讀長為50 nt，采取每次反應封閉3'端，使反應中只能加入1個核苷酸，同時每次延伸都將上一步反應試劑清洗，因此具有所需樣品少、數(shù)據(jù)誤差小、操作流程簡單等特點。SOLiD系統(tǒng)的測定讀長為35 nt，在測序過程中每個堿基在2個連接反應過程中分別被測定，即每個堿基會被檢測2次，準確度高，單次運行所得數(shù)據(jù)量大，適于miRNA的研究。Roche 454基因組測序儀測序讀長可達400～500堿基，而miRNA序列長度僅為22堿基，所以該測序儀常用于新物種的基因組測序和轉(zhuǎn)錄組測序，極少用于miRNA測序[13]。Schotte等運用Solexa深度測序技術對70個病例中的7種兒科急性成淋巴性白血病的miRNA譜進行繪制，發(fā)現(xiàn)了28種新的miRNA及431種候選新miRNA，為兒科急性成淋巴性白血病中miRNA功能研究奠定了基礎[14]。Liu等用454基因組測序技術和SOLiD深度測序技術研究進化過程中miRNA參與新生組織的功能[12]。目前主要用克隆測序方法中的Illumina和SOLiD技術來重點解決對未知序列miRNA的初步了解及其初步表達情況的問題，為挖掘新miRNA奠定基礎。

2 miRNA表達譜的高通量分析技術

研究者須進一步研究目的miRNA（已知序列）的時相性和空間性及表達水平差異，因此miRNA芯片技術得以開發(fā)和應用。miRNA芯片技術主要包括固相微陣列芯片和液相芯片技術。固相微陣列芯片的主要原理為：在玻璃片或尼龍膜等固體支持物上固定高密度已知序列的DNA捕獲探針，利用雜交原理使多種標記了的miRNA目標分子與捕獲探針雜交，通過檢測雜交信號強度及數(shù)據(jù)處理，獲得不同標本中特異miRNA的表達譜，從而全面比較不同物種的不同器官或組織及正常和患病組織中miRNA表達水平的差異。根據(jù)所用的不同的標記試劑，可分為同位素標記檢測[15]、熒光標記檢測[16]、化學發(fā)光標記檢測[17]和納米粒子標記檢測[18]。固相微陣列技術的優(yōu)勢在于能夠迅速和高通量地確定miRNA表達譜，但其問題在于不同檢測探針與待測物之間會發(fā)生交叉反應，因此實驗的準確度和精密度較差，且制作和檢測費用高。

Luminex-xMAP液態(tài)芯片技術則是一種基于微球雜交的流式細胞檢測方法（bead-based hybridiza?tion technology），它可以對同一個微量樣本中的多個不同miRNA分子快速定量。其基本原理：首先采取逐步降溫雜交法，使目標序列miRNA與生物素標記的互補探針雜交，隨后使特定編碼的磁性微球與復合探針雜交，每一個特定編碼微球?qū)鄳奶结槪诖诉^程中，未形成雙鏈的游離探針、非特異結合到探針上的miRNA和其他單鏈RNA會被相應的單鏈酶降解；最后加入鏈親和素-藻紅素熒光報告分子，與復合探針上的生物素結合，在報告激光的作用下產(chǎn)生報告熒光，報告熒光物質(zhì)和微球內(nèi)的編碼熒光物質(zhì)分別受到定量激光激發(fā)和定性激光激發(fā)，激發(fā)后光信號轉(zhuǎn)化為電信號，通過計算機的分析處理，確定微球結合的分析物的定性和定量信息。與微陣列芯片相比，Luminex-xMAP液態(tài)芯片技術中的微球處于液相懸浮狀態(tài)，其微球表面固定的探針類似于液相探針，更有利于捕獲待測靶miRNA序列，且運用單鏈核酸酶能最大程度地避免固態(tài)芯片中的交叉反應，克服了微陣列芯片的不足。Lu[19-20]等較早應用該方法確定了人類腫瘤樣本（肝癌、直腸癌、胰腺癌及胃癌）的miRNA表達譜。由于Luminex既具有高通量、快速、微量檢測的優(yōu)點，又具有在同一個試驗樣品中同時檢測不同目標物的優(yōu)點，已被廣泛用于研究同一個細胞內(nèi)不同miRNA的相對表達。

3 目標miRNA和前體表達的定量技術

獲得目標miRNA（hit-miRNA）后，須對其機制進行深入研究。反轉(zhuǎn)錄-實時定量PCR（RT-qPCR）和Northern印跡可以對成熟和前體miRNA進行定量。目前RT-qPCR策略主要有以下3種：引物延伸法[21]、polyA加尾法和莖環(huán)PCR法。由于該類方法通常需要基于U6等內(nèi)參基因校正，且無須明確miRNA的絕對量，屬于相對定量范疇。

引物延伸法和polyA加尾法均基于特殊的酶連反應，使反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在序列長度上增長且包含特定序列，利用針對特定序列的引物進行后續(xù)qPCR擴增。但這2種方法中T4DNA連接酶的連接效率和連接作用可能改變其原本的序列，成為影響靈敏度和特異性的關鍵[7]。

莖環(huán)PCR法不需要酶連反應，僅通過對miRNA序列特異互補的莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物和通用TaqMan探針即可定量，且具有良好的特異性和靈敏度。雖然TaqMan探針需要專門設計和合成，成本較高，不適合一次檢測多個miRNA，但該方法逐漸成為miRNA相對定量的金標準，為研究miRNA的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡和機制闡述提供了有利工具。為進一步增強qPCR方法的定量能力，Li等設計了一種更加巧妙的莖環(huán)探針來代替通用的莖環(huán)探針，由于采用了2個互補的莖環(huán)探針，相對于僅采用3'端莖環(huán)的探針法，該方法進一步提高了特異性，已用于檢測4種miRNA在小鼠10種組織中的相對表達量，為癌癥的臨床診斷和研究提供了有利的工具。

qPCR不僅可對成熟miRNA進行定量，也可用于前體miRNA表達譜的分析。Chugh等建立了一種基于SYBR的qPCR方法，對miRNA前體和成熟體進行檢測，即主要采用全自動機器操作PCR整個流程和選取具有相同退火溫度的186對引物，以便在同一塊板上用相同的優(yōu)化條件進行定量，從而探究miRNA的產(chǎn)生機制。Baker等[25]運用分子信標方法，在短時間（20～30 min）內(nèi)通過相對定量可確定細胞和組織液中成熟miRNA及其前體表達水平。其主要原理：分子信標與靶標RNA發(fā)生特異性結合時，其莖環(huán)結構打開（從而淬滅基團與熒光基團分離），在激發(fā)光作用下產(chǎn)生熒光信號。Baker等運用該方法對miR-21及其前體的相對表達量進行了檢測，以探究同種miRNA與其前體之間的關系。

Northern印跡是檢測miRNA的經(jīng)典方法[26]，適用于大多數(shù)實驗室。該方法可有效檢測成熟與前體miRNA表達水平，但靈敏度低、定量范圍窄、總RNA樣品需求量大及放射性32P的使用等限制了其應用范圍。為此，研究者進行了一系列改良：如采用鎖核酸探針替代傳統(tǒng)探針以提高靈敏度[27-28]；用地高辛（DIG）標記替代放射性磷標記，在保證靈敏度的前提下增加實驗的安全性；用EDC（1-乙基-3-二甲基丙胺-碳化二亞胺）促進RNA分子轉(zhuǎn)膜[29]。Kim[30]綜合利用各種措施，使得Northern印跡檢測miRNA的定量下限為0.05 fmol/L，大幅提高了定量范圍和靈敏度。改良Northern印跡檢測法不僅有利于miRNA及其前體的相關研究，也有利于對實驗室操作成本和環(huán)境的控制。

對目標miRNA表達的定量方法還有其他多種，例如引物入侵法[31]、納米金標法[32]、納米金銀染倍增法[33]、單分子檢測法[34]、直接與間接電化學法[35-36]、光電共振法[37-38]。上述方法盡管各有特點，但整體而言，由于缺乏微陣列芯片和Luminex等技術的高通量特性、qPCR技術的高靈敏度與成熟性及Northern印跡的廣泛適用性，其應用尚有較大限制，需要進一步的探索和改進。

4 miRNA藥物的藥代動力學評價技術

目前miRNA作為治療劑已進入應用階段，已有研究表明通過拮抗miRNA對從病毒感染到癌癥均有良好的藥理治療作用，相對大多數(shù)作用于mRNA的反義藥物來說，作用于miRNA的藥物能更加精確，且能作用于有相同種子序列的基因家族[39]。研究表明，多種拮抗miRNA的antimiR藥物在動物模型體內(nèi)顯示出良好的藥理作用[40]。Miravirsen（MIR）是第一個獲準進入臨床試驗的該類藥物，現(xiàn)處于臨床Ⅱ期試驗階段。MIR是miRNA-122的拮抗模擬類似物，用于治療丙肝病毒（HCV）感染[41-42]。隨著miRNA類核酸藥物時代的開啟，旨在闡明miRNA藥物作為治療劑的體內(nèi)過程及作用機制的藥代動力學評價技術顯得格外重要。miRNA藥物的藥代動力學評價分析技術不同于前述定量技術，通常要求對生物基質(zhì)中的miRNA藥物直接定量檢測，屬于絕對定量分析，能更真實地反映體內(nèi)的過程。

目前miRNA藥物的藥代動力學評價主要為雜交酶聯(lián)免疫法。Kenneth等通過雜交酶聯(lián)免疫對血漿和細胞裂解液中甲基磷酸化修飾的miRNA進行定量分析[43]。該方法是利用序列特異性捕獲探針與目標miRNA雜交，并與地高辛標記的檢測探針形成復合體，通過顯色系統(tǒng)進行定量。目前該方法對甲基磷酸化修飾的miRNA的定量范圍為10 pmol/L～1 μmol/L。Wang[44]等利用這種超靈敏的方法，評價了2′-MeOPSmiR16-1、2′-MeOPSmiR29和2′-MeOP?SantagomiR155等3種修飾后miRNA的盒式給藥（cassette dosing）（又稱組合給藥）情況下，在血漿、外周血細胞及骨髓組織中的藥代動力學和藥效學，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合多種miRNA給藥的方式能延長各自末端半衰期，且能夠提高藥效，為miRNA的類似物或拮抗劑作為臨床治療藥物的研究提供了實驗基礎。此外，MIR的藥代動力學研究也采用該方法完成[45]。

5 結語

根據(jù)miRNA各自特點和應用情況，目前miRNA分析方法可簡要概括如表1。準確、科學的定性和定量分析方法是闡明miRNA調(diào)節(jié)機制的物質(zhì)基礎，也是以miRNA作為生物標志物進行診斷的前提，更是以其作為核酸類藥物評價不可或缺的部分。基于不同研究目的的miRNA檢測分析方法的建立與合理應用具有重要意義。因此，對傳統(tǒng)分析方法進行改良，開發(fā)全新分析技術，以達到高靈敏、高通量、樣品需求量小、低成本的要求，是未來miRNA分析技術發(fā)展的方向。

表1 miRNA定量方法的特點和應用

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